Summary
谷类作物种子感染真菌的破坏，促使大量的研究工作，以便更好地了解植物病原体相互作用。研究种子真菌的相互作用，在实验室环境中，我们开发了一个强大的真菌繁殖，生物质能和使用内核生物测定霉菌毒素污染的量化方法。
Abstract
由种子腐烂粮食感染真菌对全球谷物产量最大的经济挑战之一，更不用说对人类和动物健康的严重风险。其中谷物产量中，玉米无疑是受影响最严重的作物，由于粮食的完整性和霉菌毒素的种子污染的病原体引起的损失。玉米种植者和食品和饲料加工两个最普遍的问题霉菌毒素是黄曲霉毒素和伏马毒素， 黄曲霉菌和镰刀菌产生，分别。
分子植物-病原体相互作用的最近的研究已经证明，在了解相关的具体机制与植物的真菌感染和真菌毒素污染1,2,3,4,5,6的承诺。因为许多实验室正在使用的内核分析，研究植物病原体相互作用，有需要为不同的生物参数量化标准的方法，所以来自不同实验室的结果可以交叉进行解释。一个强大的和可重复性的种子的定量分析手段，我们已经制定了在实验室内核检测和随后的方法，以量化霉菌的生长，生物量和霉菌毒素污染。四消毒玉米籽粒真菌悬液（10 6）接种在玻璃小瓶和培养一个预定的期限内。样品瓶，然后选择由血球，麦角甾醇的生物分析，高效液相色谱（HPLC），黄曲霉毒素定量使用AflaTest荧光法，高效液相色谱法和伏马菌素量化为分生孢子枚举。
Protocol
1。玉米内核生物活性的
- 两个星期前，文化马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）的病原真菌在28°C。
- 选择具有类似的形状和大小的内核，最好是扁平的，所以他们打下水平的生物活性瓶的底部，并在50毫升猎鹰管。内核选择必须已同时在相同的环境，以确保类似种子的年龄和代谢产物的组成。
- 晃动管在室温下用70％乙醇，用无菌水1分钟，10分钟，5分钟与6％次氯酸钠表面消毒内核。冲洗，三次，每次5分钟，用无菌水，同时继续晃动。八内核在蒸压毛巾干。
- 为了方便黄曲霉感染，创建一个地下18针深度为0.5厘米的胚胎端上的小伤口。然而，在我们的经验，需要一个较大的伤口镰刀菌感染。日erefore，用刀片切割深度为0.5毫米到胚胎。
- 准备刮约5毫升的蒸压0.01％Tween-20的解决方案，以解放孢子和由重力通过至少4层灭菌纱布过滤除去菌丝体培养板接种暂停。孢子浓度与血球计算和调整到10 6个孢子/毫升为A。黄曲霉或F。 verticillioides。如果使用其他种类的病原体或主机，它是重要的，以评估适当的感染接种浓度。
- 建立在一个塑料容器内衬5张纸巾和100毫升无菌水（29.2厘米×18.7厘米×8.3厘米）的湿度室。商会是不是水或气密性的和额外的水应加在整个实验，以保持湿润的纸巾。
- 地方蒸压20毫升玻璃闪烁瓶和四核记录它们的质量。接种200μL孢子悬浮液，帽，涡悬浮均匀大衣内核。拧开瓶盖，自由允许到湿度室的空气交换和地方。
注：在这些方法中所描述的其他种子或真菌，接种所需金额可能有所不同，并应得到实验。
- 孵育下12-h-light/12-h-dark光照在29°C为7天，或直至所需的内核。
2。分生孢子枚举
- 感染期后，加入5毫升蒸压0.01％Tween-20的闪烁小瓶含1分钟彻底感染的内核和涡。
- 使用大口径的枪头，立即转移到2.0毫升含0.01％Tween-20的（或稀释需要取决于对感染）1.8毫升的Eppendorf管两个独立的孢子悬浮液200μL等份稀释。
- 枚举每200μL等分两次与血球4比较处理间的的分生孢子水平。
3。黄曲霉毒素定量
- 从1个样本，以50毫升果汁杯20毫升80％的甲醇和0.05克氯化钠，1分钟盖和高速混合添加内核。
- 1凹槽滤纸置于干净的收集容器，倒入过滤器提取。
- 10毫升的滤液转移到一个干净的容器，加入20毫升蒸馏水H 2 O，并拌匀。
- 通过1.5微米的玻璃微纤维过滤到一个干净的杯子的过滤器样品。
- 申请黄曲霉测试列和过滤提取液1毫升，用压缩空气，强行通过列1-2滴/秒，直到清空率的过滤提取。
- 1毫升的蒸馏水2两次洗列，并通过列在1-2滴/秒，直到空气来通过传递。
- 1毫升100％HPLC级甲醇在1-2滴/秒的速率将玻璃试管收集流出列。
- 加1毫升的的黄曲霉测试开发到洗脱液，拌匀。地方试管校准荧光和读取60秒。
注：当使用的Aflatest边检总站协议，从荧光的测量计算后，根据最初的50克在100毫升中提取样品。如果考虑1毫升稀释的水样，一列代表0.166克的样品。因此，修改协议时，你需要考虑到的样本大小的差异和初始提取液。例如，内核2克20毫升80％的甲醇中提取。这是0.1克/毫升。当此示例1毫升，2毫升的水混合，样品在液体中的比例是0.033克/毫升。如果这个样品给出了100 ppb的荧光读数，实际样本的比例为0.166，也就是说，PPB =（0.166革兰氏×100 PPB）/ 0.1革兰氏），或166 ppb的浓度是基于。替代黄曲霉quantifi的阳离子的方法，请参考7。
4。伏马菌素B1（FB1的）分析
- 当玉米种植木耳，抽取样品10毫升的乙腈/水（50/50，V / V），在室温无搅拌过夜。随后，与去离子水（6毫升）混合提取物（2毫升），适用本混合（8毫升）直接的C-18固相萃取。
- 加载样品之前，先决条件的C-18固相萃取柱2毫升乙腈2毫升的水冲洗。
- 装入样品后，列洗净，用2毫升水2毫升的乙腈/水（15/85，V / V）。 2毫升的乙腈/水（70/30，V / V）洗脱高效液相色谱分析样品（含FB1的）。
- Derivatize与邻phthaldehyde的甲醛（OPA）0.1毫升柱洗脱液转移到小瓶含0.1毫升硼酸盐缓冲液（0.05 mol硼酸acid/0.05中号硼酸钠[50/50，V / V]，pH值8.5）和0.1 FB1的OPA的毫升（0.1 mg / ml的丙酮itrile与0.5％ - 巯基乙醇）。
- 中号acetonitrile/0.01的硼酸（40/60，V / V）加入0.5毫升，10分钟后停止反应。
- 分析FB1的岛津高效液相色谱LC-20AT配备的分析ZORBAX ODS柱（4.6 150毫米）和可变波长Shimatzu RF-10Axl荧光检测器（激发波长335纳米/ 440 nm处发射）系统。
- 使用线性渐变（溶剂A：乙腈中号磷酸钠（40/60），pH值3.3;溶剂B：乙腈/ 0.1 M磷酸钠（60/40），pH值3.3）和梯度程序如下： 100％到100％B级10分钟，5分钟为100％乙。
- FB1的标准高效液相色谱法分析，峰面积测量用于生成标准曲线。随后，量化与FB1的标准曲线的峰面积FB1样品中的水平。
5。麦角固醇分析
- 文化的真菌玉米为7-14天。
- 潜伏期后，加入10毫升氯仿：冰毒anol（2:1，V / V），在每个小瓶。一旦加入，以及动摇样品，然后在室温下孵化24小时在黑暗中的小瓶。
- 24小时后，离心样品，收集上清，通过0.45微米尼龙膜过滤。
- 样品直接注入到岛津高效液相色谱LC-20AT，配备了4.6üODS-C18柱（200，250±4.6毫米），岛津SPD-20A紫外/可见光检测器设置在282 nm处监测系统。
- 使用甲醇（100％），在1.5毫升/分钟为流动相流速。通过比较样品峰面积从HPLC级麦角固醇生成标准曲线确定样品中麦角甾醇的定量。
6。代表结果
继接种和潜伏期为两到三天的湿度试验箱，霉菌的生长开始出现的内核。七天治疗后，治疗植物的营养生长，应该是清晰可见，whilé模拟控制应该是未受感染者（ 图1B，顶部）。潜伏期较长的时期，有利于更丰富的营养生长（ 图1B，底部）。此处所述的条件下（ 图2G），A. 黄曲霉野生型NRRL 3357显示8，6，8天，分别定植，黄曲霉毒素的积累，和分生孢子生产的最高值（ 图2，AC）。然而，当霉菌毒素污染和产孢单位的麦角甾醇相比，最大的水平，观察在4和第6天，分别为（ 图2）。图2F总结这些真菌生物量的依赖性最大价值的意见。有趣的是，在接种后4-6天之间，内核经过，看到的时间过程（ 图2H，底部）从样品中的总RNA的核酸降解。
几项研究，包括我们自己，有examin编号verticilliodies感染2,8,9,10,11,12玉米粒，并成功地用于观测时间点为7-13天。使用方法外，烟曲霉毒素水平范围从3,500-8,000纳克/克内核4,13和麦角甾醇含量范围从5,000-10,000纳克/克内核14,13。伏马菌素（上）和麦角甾醇（下图3显示了代表峰）高效液相色谱。麦角甾醇的测定，也可以进行通过吸收光谱15。
图1。真菌生物量，产孢霉菌毒素生产和代表从内核生物测定的营养生长结果的量化流程图。一）流程图概述了用来评估对玉米籽粒的真菌发病的基本生物学参数的定量描述方法。 b）代表为核心的生物测定的结果。顶，A。黄曲霉 （NRRL3357）在B73的遗传背景，对玉米籽粒的营养生长。种子接种200μL10 6个孢子/ mL和图片被接种后7天内。底部， 楼verticillioides接种B73的背景下13天感染后的内核。内核接种200μL10 6孢子/毫升。
图2。黄曲霉内核生物测定的时间过程。 B73的内核与200 10 6个孢子/毫升黄曲霉菌孢子悬浮液接种和培养2-8天（G）的。所有的值，确定从4粒干重平均（N = 3-4;均值±标准差）。一）定植（麦角甾醇），（二）黄曲霉毒素，和（C）产孢使用上述方法进行量化。五）黄曲霉毒素和（F）的产孢显示作为一个通过H麦角甾醇的测定真菌生物量的功能。 F）的观察麦角甾醇，黄曲霉毒素的积累，作为一种真菌生物功能的产孢的最高值 - 每个数量的最高值被设置为100％。 （八）1微克每车道从时间进程的总RNA。
图3。代表高高效液相色谱法（HPLC）为伏马菌素B1（顶部）和麦角甾醇（底部）从感染镰刀菌 （M3125）的内核分离的色谱图。
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Discussion
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Acknowledgments
我们要感谢他们的技术援助布兰登哈塞特和卡洛斯·奥尔蒂斯。这项工作是由国家科学基金会资助的IOB-0544428，内部监督办公室-0951272，的IOS-0925561博士迈克尔Kolomiets的支持，由美国农业部国家食品和农业研究所（粮农），AFRI植物育种和教育补助金＃2010-85117 -20539到博士。赛斯美利，托马斯Isakeit，和迈克尔Kolomiets的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientific | S71659A | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 | |
| Blender | Vicam | 20200 | |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 | |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 | |
| Afla Test column | Vicam | G1024 | |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 | |
| Methanol | Vicam | 35016 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | AC14952-0025 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC39769-0025 | |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientific | 60108-304 | |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma-Aldrich | 79760-5g | |
| Boric acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Sodium borate | Fisher Scientific | RDCS0330500 | |
| Mercapt–thanol | Fisher Scientific | 45-000-231 | |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Corporation | LC-20AT | |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 | |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Corporation | RF-10AXL | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | AC38987-0010 | |
| FB1 standards | Sigma-Aldrich | F1147-1mg | |
| Chloroform | VWR international | MK444410 | |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Corporation | 4426 | |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F | |
| Scintillation vials | VWR international | 66021-602 | |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
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