人間の茸状の味覚乳頭細胞の単離および培養

Summary

我々は人間の茸状乳頭味細胞の長期培養を分離して維持するための再現可能なプロトコルを開発することを目的とした。生検で得られたヒト茸状乳頭由来の細胞が正常に生存率の低下なしに個以上の通路（12ヶ月）培養で維持した。

Abstract

味細胞は、食品中に含まれる単純な刺激と複雑な化学分子の広い範囲の検出を可能にするユニークな組織学的、分子生物学的および生理学的特性を持つ、高度に特殊化されています。ヒトでは、個々の茸状乳頭はゼロから多くの20の味蕾に含まれています。複数のセルサイクルの文化の味覚乳頭細胞を維持する能力は、これらのユニークな感覚細胞の、分子の再生、および機能的性質を特徴づけるためにかなりのユーティリティのでしょうが培養ヒトの味覚細胞のための確立されたプロトコルは、ありません。味細胞の以前の研究はげっ歯類、または組織切片^1,2,3,4の半そのままの味蕾から、初代培養の外植片培養を新たに単離された細胞を使用して行われている。これらの製剤のそれぞれの利点がありますが、長期的な文化の発展は、特に味細胞の増殖とdiffeの研究に、大きなメリットを提供しているだろうrentiation。我々を含むいくつかのグループが、味細胞培養モデルの開発と確立に興味を持っています。文化の味細胞にほとんどの試みは3-5 D ^5,6,7,8を超えて一般的に長続きしない細胞と、限られた可能性が報告されています。我々は最近^、9齧歯類の味細胞の拡張された文化のために成功した方法を報告した。我々はここで初めて単離されたヒト茸状乳頭味細胞のin vitroの培養系の確立を報告します。生検で得られたヒト茸状乳頭由来の細胞が正常に生存率の低下なしに個以上の通路（12ヶ月）培養で維持した。細胞が成熟した味細胞の特徴多くの分子的および生理学的機能を表示します。 GustducinとホスホリパーゼCβ2、（PLC-β2）mRNAが逆転写酵素 - ポリメラーゼ連鎖反応によって、多くの細胞で検出され、配列決定によって確認した。免疫細胞化学分析では、突風の存在を実証ducinおよびPLC-β2培養味細胞における発現。培養ヒト茸状細胞は、味覚受容体とシグナル伝達経路の少なくとも一部が存在していたことを示すいくつかの味刺激の適切な濃度に応答して細胞内カルシウムの増加を示した。これらの結果は、十分な成人から味細胞が生成され、少なくとも8つの通路を維持できることを示しています。細胞の多くは、モデルの味覚システムとしての使用をサポートするために、大人の味の上皮から急性単離した細胞の生理学的および生化学的特性を保持します。このシステムは、in vitroでの準備中で哺乳類の味覚受容体細胞の増殖、分化および機能に関与するプロセスの更なる研究が可能になります。

ヒトの茸状細胞の培養を確立するために使用される人間の茸状乳頭味が見直された研究プロトコルの下で適切なインフォームドコンセント後に研究のために寄付されましたとIRB委員会によって承認されました。プロトコル（＃0934）は、シュルマンアソシエイツ機関審査委員会（株）、シンシナティ、オハイオ州によって承認されました。下記の書かれたプロトコルはOzdener らによって報告され公表されたパラメータに基づいています。 2011年^10。

Protocol

1。人間の茸状の味覚乳頭を得る

1. 湾曲した春のmicroscissorsを使用して、舌の前部の背側表面に四から八人間の茸状の味覚乳頭を削除します。
2. すぐにアイソレーション·ソリューションへの場所（26 mMの_炭酸水素ナトリウム、2.5mMののNaH ₂ PO _4、20mMのグルコース、65 mMのNaCl、20mMの塩化カリウム、1 mM EDTAをヌクレアーゼフリー水に溶解し、濾過滅菌）。

2。人間の茸状の味覚乳頭消化

人間の茸の味細胞の乳頭はわずかな違いを持つ2つの異なる酵素消化プロトコルを使用して解離させることができる。

1. プロナーゼ（1 mg / mlと、シグマアルドリッチ社）とエラスターゼ（1 mg / mlのシグマアルドリッチ社）の30-45分（プロトコル1）室温でのアイソレーション·ソリューションでインキュベートする茸状乳頭。
2. +エラスターゼ（10 U / mLで、麦汁からコラゲナーゼI型（ワージントンから550 U / mLで、）でインキュベートする茸状乳頭用 hington）35の2 mlのカルシウムフリーリンゲル溶液中で+トリプシンインヒビター（ワージントンから0.9 mg / mLの）℃で30分間、95％O _{2/5％CO 2}で穏やかな酸素の循環を持つCの水浴。（代替方法消化、プロトコル2）
3. インキュベーション後、リンガーと乳頭を洗浄し、10回の火災研磨したガラスパスツールピペットを用いて乳頭をひいて粉にする。
4. 室温で2500 rpmで3分間遠心分離し、分離液を除去すると味細胞培養培地1 mlを加える。
5. ガラス皿に消化茸状乳頭を転送します。
6. 手術の剃刀で軽く茸状乳頭の解剖。
7. ラット尾コラーゲン1型コーティングしたカバースリップの上にクローニングシリンダーに解剖乳頭の250μlを添加します。
8. 各ウェルに味細胞培養培地1 mlを追加します。

3。人間の茸状の味覚乳頭細胞の培養

1. 加湿で36℃でプレートをインキュベートインキュベーターは、5％CO ₂を含む。
2. 完全培地の最初の変更前に2日間邪魔されずにインキュベータ内に置きます。それは1〜3日ではっきりと見えないかもしれませんが、味細胞は最終的には、コーティングされたカバースリップにバインドします。
3. 完全にプレートと媒体からクローニングシリンダーを取り外し、各ウェルに味細胞の培地1 mlを加える。
4. すべての培地6-7日の1/3を交換します。より頻繁に、および/または完全に培地を変更しないでください。
5. 一日おきに、顕微鏡下で細胞の成長を確認してください。新しい細胞のほとんどは、細胞クラスターの下に成長します。細胞クラスターは、通常、新しく生成された細胞を残して培養2-3週間後にデタッチします。
6. 一度クローニングシリンダーの40-50％が味細胞の拡大に覆われて、36で2〜3分が0.25％（w / v）のトリプシン/ EDTAを用いて細胞をトリプシン処理℃に
7. 部屋の温度で5分間3000rpmで遠心分離に続いて味細胞培養培地の3巻を追加し、15 mlチューブにウェルから細胞を転送ature。
8. 味細胞の培地1mlの上清と再懸濁し、細胞を除去する。

4。人間の茸状の味覚乳頭細胞の増殖

1. T25プレートに細胞を移し、味細胞の培地（通路0）の4ミリリットルを追加します。 36加湿インキュベーター中°Cで5％CO ₂を含むで細胞を維持します。
2. 培養味細胞が100％コンフルエントに達するまで、すべての培地6-7日の1/3を交換します。この時点では、収穫に味細胞を有効にするには、0.25％（w / v）のトリプシン/ EDTA 36で2〜3分間℃を用いて細胞をトリプシン処理、滅菌PBSで細胞を洗浄
3. 上記のように遠心分離した後、新鮮なT-75フラスコ（通路1）に完全に味細胞培地および転送細胞内で再懸濁する。
4. すべての培地6-7日の1/3を交換します。より頻繁に、および/または完全に培地を変更しないでください。
5. 細胞はほぼ100％コンフルエントに達している4.3と4.4を繰り返します。 T75フラスコ中で1:4希釈以上に高いセルを分割時間の経過とともに細胞の十分な成長を維持するために。

5。培養ヒト茸状の味覚乳頭細胞を凍結融解

1. 主要味細胞の株式を凍結するには、トリプシン処理した後（ステップ4.2）、3ミリリットルの完全味細胞培地、滅菌15 mlコニカル遠心チューブへの転送セルを追加します。室温で5分間2500rpmで遠心します。
2. 慎重に95パーセントのウシ胎児血清（FBS）および5％DMSOを含む凍結培地の適切な量と上清と穏やかに再懸濁した細胞を除去します。
3. ラベル、滅菌cryovials、しっかりとキャップ、イソプロパノールを含む冷凍コンテナ内の場所にセルを転送します。前に液体窒素を無期限に転送するには、少なくとも一日のために-80℃の冷凍庫に配置します。
4. 37℃で凍結初代ヒト茸状乳頭味細胞の場所のバイアルを解凍し℃の水浴まで層流細胞培養での作業中にだけ、（約1分）融解フード。
5. 滅菌した15mlのコニカル遠心チューブに細胞と凍結培地を転送し、味細胞培養培地5mlを追加します。
6. 室温で5分間2500rpmで遠心し。慎重に、完全な味細胞培養培地で上清を、穏やかに再懸濁した細胞を破棄し、滅菌したT-25組織培養フラスコに移す。
7. 3〜4ステップに応じて培養細胞に進みます。

6。代表的な結果

文化の中で味の生検を成長させる試みは、時間の90％が成功した。生検および解離数日後、細胞は一般的に解離手順の後に残った解剖茸状組織の部分から外側に成長し、移行し始めました。個々の細胞がめっき（ 図1A）の後に表示されて24〜48時間であったが、細胞が時折娘細胞（ 図1B）を生成し、添付された細胞塊の下に2から3週間まで成長しました。生検から文化の中で4週間で8000個の細胞 - ING 4月8日人間の茸状乳頭は、プライマリ人間の茸状乳頭味細胞の最初の分離株は約2000に達する。さらに3-4週間のT25細胞培養フラスコ（通路1）の拡大は、培養中のヒトの茸状乳頭味細胞（ 図1C）に適応を有することになります。初代ヒト茸状乳頭味細胞はさらに3-4週間（ 図1D）の通路-1で少なくとも100万セルの上方を得るために培養で増殖することができます。主な味覚細胞が8つ以上の通路を拡大していきます。

培養中の培養ヒト茸状乳頭味細胞の形態は、以前は^11,12に記載の培養化学感覚細胞に類似していた..ほとんどのヒト培養茸状乳頭味細胞は最大15-30日に1つまたは複数のプロセスの有無にかかわらず細胞体の元のコンパクトな外観を維持しています。彼らは、合流点に培養されたCEのほとんどに達した後LLSは、偏細長い外観を有していた。成熟した味細胞は、いくつかの異なる組織型と展示味細胞固有の機能で構成されています。ここでは、これらの培養内の細胞は、成熟味細胞の特徴的な多くの分子的および生理学的機能を表示することを示している。 GustducinとホスホリパーゼC - β2、（PLC-β2）mRNAが逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応およびシークエンシング（ 図2）によって確認された製品によって検出された。 gustducinおよびPLC-β2の発現は、免疫細胞化学II型様細胞（BとDはそれぞれ図3）の存在を示すが検出されました。有病率と細胞シグナル伝達経路や細胞の種類を反映してgustducinおよびPLC-β2の相対的な発現パターンを正確に生体内で見たことが反映されません。味蕾内の異なる細胞型の相対的な分布を支配する因子は不明であり、培養条件で複製することはできません。したがって、B培養細胞とそのin vivoでの対応では、操作および監視することができる条件下で、分子レベルでこれらの特性の規制を検討する機会を提供するとの類似点と相違点をOTH。

モデルシステムのための重要な基準は、関連する機能的特性の存在である。培養細胞はまた、いくつかの味刺激の適切な濃度（ 図4）に応答して細胞内カルシウムの堅牢な増加を示した。これらの研究では、甘い、苦い刺激脱分極に対応することができる細胞内カルシウムの増加を誘発する。これらの味覚細胞様培養細胞の性質は、我々がここで説明するモデルシステムは、伝達経路とヒトの味覚細胞の再生能力の更なる研究のための貴重な資産となるという主張を支持する。

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図1添付ファイルおよび培養ヒト茸状乳頭味細胞の形態。コラーゲンタイプ1でコートしたプレート上に成長させた初代ヒト茸状の味覚乳頭細胞の培養は2日（）の後に撮像した。人間の茸状乳頭味細胞は娘細胞を生じるように見えた添付の細胞クラスターの下で4週間までのために成長しました。細胞は通常は4週間（B）内でコンフルエントになるまで成長し、（CとD）収穫とそれぞれ再シードした後2日目と4週を表します。培養細胞は、少なくとも8ヶ月間の成長を続けた。スケールバー= 50 nmである。 図1の部分もOzdener らに提示された。ら^10。

図2 RT-PCRの結果は、特定味細胞マーカーのmRNA（gustducinおよびPLC-β2）の存在を実証した。培養ヒト茸状細胞からのトータルRNAは、逆transcでしたRT-PCR用スーパースクリプトファーストストランド合成システム（Invitrogen）を用いてribedとgustducinおよびPLC-β2の検出のために設計された特異的なプライマーで増幅することによりPCRに使用されます。プライマー（ 表1）が 1以上のイントロンにまたがるように選ばれました。各mRNAは、配列決定によって確認し予想されるサイズの増幅産物との通路4または5から培養したヒト茸状乳頭味細胞で検出されました。特定のmRNAはなく、ゲノムDNAの混入がないことを示す逆転写酵素なしでの対照実験では検出されなかった。 PCR産物を2％アガロースゲル上で分離し、ゲル上の増幅産物はカミソリで切り出した。 DNAをQIAquickゲル抽出キット（Qiagen）を用いてゲルから抽出した。 PCR産物は、ペンシルベニア州シーケンシング施設の大学で配列決定した。 C-PCRおよびC-RTは、それぞれPCRおよび逆転写酵素の制御実験である。 図2の部分はまたOzdener らに提示された。アル。

培養ヒト茸状乳頭味細胞の継代4または5の図3。免疫染色では、味細胞マーカーの存在を示した。培養ヒト茸状乳頭味細胞（5日齢）4℃で一晩（表2）4％パラホルムアルデヒドで固定し、一次抗体とともにインキュベートした画像は、ライカTCS-SP2共焦点レーザー走査型顕微鏡で得られた。約、培養された茸状乳頭味細胞の60％がgustducin（B）とPLC-β2（D）20〜30％で標識した。対応するセルの透過画像（AとC）が表示されます。コントロールでは、抗体特異的免疫グロブリンと免疫染色は、非特異的免疫反応性（データは示さず）が存在しないことを実証した。スケールバー= 50 nmである。一部図3のまたOzdener らに提示された。ら^10。

図4。通路4または5から培養ヒト茸状乳頭味細胞は様々な刺激に応答します。培養ヒト茸状乳頭味細胞（4-5日齢）1mMのフラ-2 AM（Molecular Probes社）および10 mg / mlのプルロニックF127（Molecular Probes）でロードされていました。培養ヒト茸状乳頭味細胞の細胞内カルシウム濃度（[Ca ^{2 +]} iの）の変化は、標準的な手動のイメージング技術を用いて測定した。細胞は、340nmおよび380nmの励起波長で倒立蛍光顕微鏡および510nmを中心とするバンドパスフィルタによって設定され、発光波長を用いて可視化した。必要に応じて刺激は浴溶液に溶解し、次いでpHおよび浸透圧を再調整しました。培養ヒト茸状の味覚乳頭細胞は、甘いと苦い刺激に反応した。 Graphs（B）は、スクラロース（1 mM）を、（）デナトニウム（2 mm）に露光中に、個々の細胞での[Ca 2] iのレベルの代表的な反応を示しています。各トレースは、単一の、個々のセルを表します。

遺伝子	シーケンス	PCR条件		予想されるサイズ （BP）	リファレンス
β-アクチン	GGACTTCGAGCAAGAGATGG AGCACTGTGTTGGCGTACAG	7分 45秒 45秒 45秒 7分	95 94 53 72 72	234	NM_001101.3
Gustducin	TCTGGGTATGTGCCAAATGA GGCCCAGTGTATTCTGGAAA	7分 45秒 45秒 45秒 7分	95 94 53 72 72	386	NM_001102386
PLC-β2	GTCACCTGAAGGCATGGTCT TTAAAGGCGCTTTCTGCAAT	3分 30秒 30秒 60秒 7分	95 94 53 72 72	333	NM_004573

表1。味特定の分子を検出するために使用したプライマーおよび条件。

一次抗体	ソース	ホスト	希釈	二次抗体	ソース	ホスト 希釈
Gustducin	サンタクルス	ウサギ	1:500	抗ウサギIgGアレクサ633	分子プローブ	ヤギ	1:500
PLC-β2	サンタクルス	ウサギ	1:500	抗ウサギIgGアレクサ633	分子プローブ	ヤギ	1:500

表2。抗体の特定の分子の発現を検出するために使用されます。

Discussion

私たちは12ヶ月の期間にまたがる、8以上の通路のために人間の茸状乳頭味から得られた細胞を維持しています。これらの培養物は、味覚受容体細胞の重要な分子的及び生理学的性質に加えて、成熟した味蕾細胞の種類にはいくつかのマーカーを発現した段階にin vitroで成熟し、その多くは新しい細胞を生成します。 gustducinと培養細胞のサブセットのPLC-β2免疫反応の存在は、この結論と整合的である。最も重要なのは、いくつかの細胞が解離した味細胞^5、味蕾スライス³および培養ヒトおよびラットの味細胞の細胞^19,10の特徴である、細胞内カルシウムの一過性増加と甘味と苦味の刺激のアプリケーションに対応した。これは、培養中の細胞の一部が甘いと苦いの分子受容体を発現していることだけでなく示しているが、彼らはcalciを生成するために十分なGタンパク質共役伝達カスケードのを持っていること応答UM。

長期的な初代培養細胞は、しばしば細胞の生理機能に重要な役割を果たす可能性があり、元の組織や細胞構造と細胞因子を維持することはできません。人間の茸状乳頭味細胞の培養の成功した長期の確立により、大きな進歩がまだ行われている、いくつかの制限が挙げられる必要があります。何よりもこれらの中で初代培養細胞の各バッチは、培養を開始するために使用される細胞の初期集団の違いにより変化することができるということです。初代培養細胞は、しばしば細胞の生理的機能の役割を果たす元組織の組織構造や成長因子を逃す。培養は、100％のコンフルエンスまで増殖されることはありませんように細胞は、他の細胞と接触して常に、完全に頻繁にではありません。一般的に、初代培養細胞にも分化し、染色体不安定性の対象となり、連続したセルのLiに細​​胞複製時に染色体の損失または利益によって特徴付けNEは、別の問題^13,14,15かもしれません。舌の培養nontaste細胞と培養ヒト茸状細胞の比較が検討される必要があります。我々の理解が完了する前にこれらの質問は、多くの実験的アプローチとモデルシステムの使用が必要になります。

結論として、このプロトコルは、ここで説明し、関連する細胞の生理学的および分子的特性を失うことなく、少なくとも8通路（12ヶ月）のためにin vitroでのヒトの茸状乳頭味細胞を維持することができます。この長期的な初代培養の今後の発展には、増殖と分化、刺激特異性、ヒトの味覚受容体細胞と同様に、組織再生のクロストークと適応特性の研究のためのモデルシステムを提供します。さらに、感染症などの味覚細胞の機能を損なう状態、薬、放射線、毒性や化学物質暴露の影響は、分子および生理学的レベルで調べることができます。