La dissection de souris adultes et utricule adénovirus-support cellulaire des infections

Summary

Cellules ciliées mécanosensorielle sont les cellules réceptrices de l'oreille interne. Le mieux caractérisé

Abstract

La perte d'audition et de troubles de l'équilibre sont souvent causés par la mort des cellules ciliées mécano, qui sont les cellules réceptrices de l'oreille interne. Comme il n'y a pas de ligne de la cellule qui représente de façon satisfaisante les cellules ciliées de mammifères, de la recherche sur les cellules ciliées se fonde sur les cultures d'organes primaires. Le mieux caractérisé dans le système modèle in vitro de cellules matures des poils des mammifères utilise des cultures d'organes de utricules de souris adultes (Figure 1) ^1-6. L'utricule est un organe vestibulaire, et les cellules ciliées de l'utricule sont semblables dans les deux à la structure et la fonction des cellules ciliées de l'organe auditif, l'organe de Corti. La préparation utricule souris adultes représente un épithélium sensoriel maturité pour les études des signaux moléculaires qui régulent la survie, l'homéostasie, et la mort de ces cellules.

Mammifères cellules ciliées cochléaires sont définitivement différenciés et ne sont pas régénérés quand ils sont perdus. En non-mamvertébrés maliens, auditif ou vestibulaire de la mort des cellules ciliées est suivie d'une régénération robuste qui rétablit les fonctions auditives et l'équilibre ^{7, 8.} La régénération des cellules de cheveux est médiée par la glie-comme les cellules de soutien, qui sont en contact les surfaces basolatérale des cellules ciliées de l'épithélium sensoriel ^{9, 10.} Cellules de soutien sont aussi des médiateurs importants de la survie des cellules ciliées et de la mort ^11. Nous avons récemment développé une technique pour l'infection des cellules de soutien dans les utricules cultivées en utilisant des adénovirus. Utilisation adénovirus de type 5 (dE1/E3) pour fournir un transgène contenant la GFP sous le contrôle du promoteur CMV, nous constatons que l'adénovirus spécifiquement et efficacement infecte les cellules de soutien. Soutenir l'efficacité infection de la cellule est d'environ 25-50%, et les cellules ciliées ne sont pas infectés (Figure 2). Surtout, nous constatons que l'infection adénovirale de cellules de soutien n'entraîne pas de toxicité pour les cellules ciliées ou des cellules de soutien, comme nombre de cellules dans Ad-GFP infutricules ecté sont équivalentes à celles en situation de non-infectés utricules (Figure 3). Ainsi l'expression des gènes adénovirus dans des cellules de soutien de utricules culture fournit un outil puissant pour étudier les rôles des cellules de soutien en tant que médiateurs de la survie des cellules des cheveux, la mort et la régénération.

Protocol

1. Dissection utricule et de la Culture

1. Euthanasier un adulte (âge de 4 semaines ou plus) de la souris en utilisant un protocole approuvé et décapiter.
2. Snip le conduit auditif externe sur les deux côtés de la tête et tirer la peau vers l'avant en direction du nez. Bissecter la tête d'arrière en avant et retirez le cerveau des deux côtés de révéler le labyrinthe osseux.
3. Coupez le crâne loin de la cochlée osseuse et à transférer le labyrinthe osseux (y compris la bulle) pour une hotte de culture de tissus équipé d'un microscope à dissection (Remarque: le travail adénovirus doit être effectuée dans un cabinet de classe II de la sécurité biologique).
4. Dans la hotte, le transfert de chaque cochlée à une boîte de culture de tissu de 35 mm contenant milieux stériles dissection (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (figure 1A).
5. Si la bulle auditive est encore intact (il est possible d'enlever la bulle lors de la dissection brute en insérant votre vignette entre la bulle et le sommet dela cochlée), utilisez deux pinces (un n ° 3 et un n ° 5) à briser la bulle (figure 1B).
6. Identifier les points de repère de la préparation osseuse cochlée: osselets faîtières, de base, et de forme ovale et ronde, les fenêtres de la racine nerveuse, les canaux semi-circulaires VIIIe (figure 1 C, D).
7. Placez l'oreille interne dans le plat avec le côté interne vers le haut, de telle sorte que l'ovale et ronde et le sommet sont des fenêtres sur le fond du plat et la racine du nerf VIIIème vers le haut. Maintenez la préparation à l'aide un # 3 pince dans la région des canaux semi-circulaires (figure 1D).
8. Avec un scalpel équipé d'une lame n ° 11, couper le sommet de la cochlée juste apicale de la racine nerveuse (figure 1D).
9. Activer la préparation de sorte que la partie découpée est tournée vers le haut. Utilisez le canal semi-circulaire antérieure comme une poignée pour stabiliser la préparation (figure 1E).
10. En utilisant une pince n ° 5, retirez la cochlée aux modiolus basà la base. Au point où la région crochet de la cochlée tourne vers le bas, utilisez une sonde fine (la moitié d'un cassées # 55 forceps) de lever la dernière tablette osseuse de la lame spirale osseuse (figure 1F), révélant le saccule. Juste en dessous du saccule est la platine de l'étrier, qui est une étape importante. Le utricule est immédiatement adjacente à la platine de l'étrier (figure 1G), et il est entouré par de l'os. Utilisez la sonde pour ébrécher l'os loin suffisant pour révéler au sujet de 1/3 de l'utricule. Retirez soigneusement l'utricule en utilisant une pince N ° 55 (Figure 1H). Cette procédure se traduira généralement en retrait de l'épithélium pigmenté de toit que l'utricule est tiré de la préparation osseuse. Toutefois, si l'utricule est enlevée avec de l'épithélium toit intact, le toit peut être enlevé en utilisant une pince N ° 55.
11. Utricules de l'infection à adénovirus (ou des expériences d'imagerie vivantes) doivent avoir le otoconia enlevé lors de la dissection (avant l'infection).Dans ce cas, utiliser une seringue luer-lock qui est rempli avec les médias de dissection et munie d'une aiguille de petit calibre (généralement 26-28 gauge). Maintenez l'utricule au bord en utilisant une pince N ° 55 (Figure 1I). Apportez la pointe de l'aiguille à proximité de l'utricule avec le biseau de l'aiguille pointant vers le bas. Utiliser un jet de disséquer les médias pour souffler la otoconia (Figure 1J). Alternativement, otoconia peut être éliminé par les brossant à l'aide d'un outil de cil (Ted Pella, Inc # 113). Utricules qui ne vont pas se soumettre à une infection adénovirale sont normalement cultivées flottant librement dans des plaques 24 puits de culture de tissus intacts à l'otoconia (voir ci-dessous pour le post-fix retrait otoconia, qui est plus facile).
12. Une fois tous les utricules sont disséqués, changer les médias de dissection à la culture stérile des médias: DMEM F12 (Gibco # 11320) supplémenté avec 5% de FBS et 50 U / ml de pénicilline G (Sigma).
13. Utricules sont cultivées à 37 ° C et 5% de CO _2. Si les cultures doivent être maintaminé pendant plus de 48 heures, la moitié des milieux de culture doivent être changés tous les jours. Les cultures peuvent être maintenues pendant une semaine ou plus.

2. Infection par un adénovirus de cellules de soutien

Important: Travailler avec l'adénovirus exige de niveau de biosécurité 2 (BSL2) les procédures et de certification. Vérifiez auprès de votre Agent de biosécurité institutionnelle d'orientation et de formation sur les procédures BSL2.

1. Disséquer utricules comme ci-dessus dans les médias de dissection (pas de sérum). Retirer otoconia comme ci-dessus.
2. Lorsque vous êtes prêt à infecter, transférer 1 utricule (cellules ciliées le haut) dans chaque puits d'une mini-bac Nunc (Fisher # 12-565-68) contenant 15 uL DMEM sans sérum F12 (ce qui est important, car le sérum peut inactiver le virus) . Ce transfert est plus facile avec un microcurette 1,5 mm (# 10082-15 à partir des outils des sciences Beaux).
3. Notre Ad-GFP est de sérotype 5 avec les gènes viraux E1 et E3 supprimées et le promoteur du CMV humain de conduire l'transgène (GFP). Ce virus a été obtenue à partir Vecteur BioLabs (Philadelphie, PA vectorbiolabs.com ). Virus images sont fournies à des titres de 1,0 à 4,0 × ¹⁰ 10 PFU / ml. Ajouter 0,5 à 2 pi de stock de virus à chaque puits contenant un utricule (Figure 1L). Le montant réel utilisé varie en fonction du titre du virus et le bouillon. Nous avons l'habitude d'infecter chaque utricule avec de 1,0 à 4,0 × 10 ⁷ UFP.
4. Culture des utricules contenant le virus dans les médias à 37 ° C / 5% de CO ₂ pendant 2 heures. Après 2 heures, transférer les utricules revenir à la plaque de 24 puits de culture de tissu contenant des milieux de culture avec du sérum. Culture des utricules nuit à 37 ° C / 5% de CO _2.
5. Utricules peut être utilisé le lendemain pour des expériences d'imagerie en direct, ou ils peuvent être fixés pour l'immunochimie des cellules ciliées (voir ci-dessous). Virale augmente l'expression du transgène dans le temps, si l'expression du transgène est faible à 24 heures post-infection, il peutbénéfique pour les cellules en culture pendant 24 heures supplémentaires dans le sérum contenant les médias. Si vous voyez la toxicité cellulaire des cheveux, de réduire la quantité de virus utilisée.

3. Fixation utricule, enlèvement otoconia, et d'immunochimie

1. À la fin de la période de culture, fixer utricules dans du paraformaldéhyde 4% pour soit 3 heures à température ambiante (sur une plate-forme à bascule) ou une nuit à 4 ° C. Utricules de lavage (3 fois, 15 min chacune) dans 0,1 M (1X) pH Sorensen tampon phosphate 7,4. Ces étapes sont réalisées dans une plaque de 24 puits de culture de tissu.
2. Retrait otoconia: Remarque: otoconia doivent être retirés avant l'infection adénovirus (voir l'étape 1.11 ci-dessus). Cependant, utricules qui ne sont pas à être infecté peut être mis en culture et fixé à la otoconies intacte. Dans ce cas, utilisez les étapes décrites ici pour supprimer le otoconia après fixation. Inspectez utricules pour toute l'épithélium pigmenté de toit restante. Retirez soigneusement tout épithélium toit restante en utilisant deux N ° 55 forceps. Pour retirer le otoconia, remplacer un tampon phosphate de Sorensen avec 750-1000 ul Cal-Ex détartrant (Fisher # CS510-1D). Laissez Cal-Ex sur utricules pendant 1 minute et 40 secondes (ne pas dépasser 2 minutes). Remplacer Cal-Ex avec un tampon phosphate 0,1 M Sorensen et de lavage (5 fois, 5 minutes chacun).
3. Incuber utricules dans le borohydrure de sodium (Sigma # 452882, 1% dans de l'eau déminéralisée) pendant 10 minutes. Laver utricules dans un tampon phosphate 0,1 M Sorensen (5 fois, 5 minutes chacun).
4. Utricules Placer dans la Blocking Solution (PBS + 2% de sérum albumine bovine + 0,8% sérum de chèvre normal + 0,4% de Triton X-100) pendant 3 heures à température ambiante sur une plate-forme à bascule.
5. Ajouter des anticorps primaires et incuber une nuit à 4 ° C. Anti-myosine 7a (soit Proteus Biosciences # 25-6790 ou # MYO7A 138-1 du développement de la Banque études hybridome) au 1:100 dans le blocage de toutes les étiquettes solution cellules ciliées. Pour marquer séparément les cellules ciliées et non-striolar striolar, nous avons utilisé un Protoco double-étiquettel avec un anticorps monoclonal anti-calmoduline (Sigma # C 3545; 1:150) et polyclonaux anti-calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, Californie, Etats-Unis; 1:200). Anticorps secondaire (généralement Alexa Fluor anticorps secondaires conjugués de Invitrogen, Carlsbad, CA, Etats-Unis) sont dilués à 1:500 dans une solution de blocage et incubées pendant 4 heures dans l'obscurité, à température ambiante sur une plate-forme à bascule.
6. Utricules montage sur lames de verre en utilisant Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, États-Unis).

4. Les résultats représentatifs

Utricules cultivés en utilisant cette méthode conserver la totalité des compléments de cellules ciliées et les deux cellules de soutien (Figure 2). Les cellules ciliées dans les cultures en bonne santé montrent rondes profils nucléaires entourées par de minces régions cytoplasmiques qui sont myosine 7a-positif (figure 2, panneau supérieur). Cellules de soutien (étiqueté anti-Sox2) sont plus petits et plus dense que les cellules ciliées (Figure 2, panneau inférieur). Adenovirus infecte 25-50% des cellules de soutien dans l'utricule, et aucun des cellules ciliées sont infectées (figure 2, Ad-GFP panneaux). Il convient de noter que le titre de travail optimal de chaque adénovirus doit être déterminé de manière empirique, depuis la mort de cellules ciliées est possible si le titre viral est trop élevé. En outre, les régions de dommages mécaniques (causé lors de la dissection) aura de grandes quantités de virus. Ces régions de dommages mécaniques sont faciles à distinguer par une ligne continue de cellules avec des niveaux très élevés d'expression de la GFP et les cellules ciliées manquantes. Ceci est en contraste à l'expression de la GFP dans les cellules de soutien dispersée d'une culture en bon état ​​(Figure 2).

Figure 1. Utricule dissection. A: C La bulle est brisée par deux pinces robustes:. Auditif bulle (AB) B. Bony cochlée (RW = fenêtre ronde, S =. artère stapédienne, C = cochlée, ST = étrier) D: Une lame de scalpel (SB) est utilisé pour couper l'apex de la cochlée apicale du nerf crânien VIII (8 N ^e) ASC = canal semi-circulaire antérieure E..: la préparation est maintenu fermement à l'aide d'une pince # 3 avec une fourche inséré dans le canal antérieure semi-circulaire (ASC) et l'autre sur l'os extérieur (flèches). Le labyrinthe membraneux est retiré avec une pince F:. Avec le labyrinthe membraneux enlevé, le tour basal de la lame spirale osseuse est visible près de la région du crochet. Une sonde fine est insérée sous ce plateau osseux pour soulever le plateau et retirez-le (la flèche) G:. Après élimination du saccule, utricule (U) est visible immédiatement adjacente à la platine de l'étrier (SF) H:. Utricule (U ) est éliminée en utilisant une pince # 55 (flèche) SF = étrier platine I:.. utricule avec otoconia (O), partiellement éliminé und sensoriels épithélium (SE) au-dessous visibles J:. otoconia (O) sont retirés de la utricule l'aide d'un flux de média rendu par une seringue munie d'une aiguille de calibre 26. L'ombre de l'aiguille (S) est visible au bas de l'image K:. Utricule avec otoconies enlevé et épithélium sensoriel (SE) visibles L:. Infection adénoviral: chaque utricule (U) est placé dans un puits individuel d'un mini- -bac. Cellules de soutien sont infectées par l'adénovirus par pipetage virus dans le puits (P = pointe de la pipette).

Figure 2. Adénovirus infection de cellules de soutien. Utricules ont été infectées par l'adénovirus expression motrice de la protéine fluorescente verte (GFP-annonce). Affichés sont des images confocales de la couche de cellules ciliées, et la couche de cellules de support dans la même zone d'un utricule. Les cellules ciliées sont marquées avec un anticorps contre la myosine 7a(Magenta). Cellules de soutien sont marquées avec un anticorps contre Sox2 (rouge). Le schéma suivant montre la structure de l'épithélium sensoriel utricule et les emplacements des cellules ciliées (HC) et les cellules de soutien (SC). Emplacements des confocal (optique) sections indiquées dans la partie supérieure (U) et inférieure (L) des panneaux sont indiqués par des lignes en pointillés dans le schéma. Panneaux supérieurs: En images confocales prises au niveau des noyaux des cellules des cheveux, Ad-GFP signal apparaît dans les espaces entre les cellules ciliées et ne se chevauchent pas avec le 7a cellules ciliées myosine marqueur. Des panneaux inférieurs: Dans les sections confocales au niveau des noyaux cellulaires de support, Ad-GFP signal de colocalisée avec le marqueur de cellules de support Sox-2. L'infection Ad-GFP dans l'expression de la GFP dans des cellules de soutien seulement, et pas les cellules ciliées sont infectés.

Figure 3. Infection adénovirale n'entraîne pas la mort des cellules ciliées ou des cellules de soutien. Utricles ont été infectées avec Ad-GFP à 4 × 10 ⁸ UFP / ml. Utricules ont été marqués avec des anticorps contre la myosine 7a (marqueur des cellules de cheveux) et Sox2 (soutien marqueur de cellule). Des cellules ciliées et numération des cellules de soutien étaient égaux pour utricules de contrôle et Ad-GFP utricules infectés.

Discussion

Cellules ciliées sensorielles sont sensibles à la mort causée par une variété de stress, notamment le vieillissement, traumatisme sonore, et l'exposition à des médicaments ototoxiques, y compris les antibiotiques aminoglycosides et le cisplatine agent antinéoplasique. Dans les résultats mammifères cheveux de la mort cellulaire dans la perte d'audition permanente et / ou perturbation de l'équilibre. Dans les systèmes de modèle in vitro sont des outils essentiels pour les études visant à déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tend la mort cellulaire des cheveux, ainsi que ceux qui visent à prévenir ou inverser la mort des cellules ciliées . Contrairement aux cellules ciliées de la cochlée des mammifères adultes, les cellules ciliées de l'utricule bien survivre dans la culture. Cellules ciliées utricule sont sensibles à la mort de l'exposition à des médicaments thérapeutiques mêmes qui sont toxiques pour les cellules ciliées de la cochlée, et les mécanismes cellulaires sous-jacents ototoxique la mort cellulaire des cheveux et la survie sont similaires pour les cellules ciliées à la fois utriculaires et cochléaire ^12-18. En outre, lorsque les données obtenues dans le système modèle utricule sont tested in vivo, la préparation utricule s'est avéré être un prédicteur fiable de la survie des cellules de cheveux et de la mort dans les pays matures cochlée ^{12, 18-21.} La préparation de la souris utricule nous permet également d'examiner les effets des protéines spécifiques en utilisant utricules d'animaux transgéniques et knock-out.

Les signaux qui interviennent dans la survie et la mort des cellules ciliées sensorielles en situation de stress sont mal comprises. Toutefois, des preuves nouvelles suggère que les autres types de cellules de l'oreille interne peut jouer un rôle important pour déterminer si les cellules ciliées en situation de stress en fin de compte vivre ou mourir ^{11, 22, 23.} Le système modèle utricule peut être utilisé pour examiner ces critiques interactions cellule-cellule dans un épithélium sensoriel maturité chez les mammifères. Infection adénovirale fournit un procédé de modification expression des gènes dans les cellules de soutien, ce qui facilite les études sur le rôle (s) de cellules de soutien dans la survie cellulaire des cheveux, la mort, la phagocytose, et la régénération.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium 199	GIBCO, by Life Technologies	12350
DMEM/F12	GIBCO, by Life Technologies	11320
Fine forceps (#55)	Fine Science Tools	11255-20
Fine forceps (#5)	Fine Science Tools	11252-30
Forceps (#3)	Fine Science Tools	11231-30
Penicillin G	Sigma-Aldrich	P3032
Fetal bovine serum	Invitrogen	10082-139
Nunc mini-tray	Fisher Scientific	12-565-68
Adenovirus-GFP	Vector Biolabs	1060*
Cal-Ex decalcifier	Fisher Scientific	CS510-1D
sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882
Anti-Myosin 7a (polyclonal)	Proteus Biosciences	25-6790
Anti-Myosin 7a (monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	MYO7A 138-1
Anti-Calmodulin	Sigma-Aldrich	C 3545
Anti-Calbindin	Chemicon International	AB1778
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1x1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.