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Neuroscience

Dissektion der erwachsenen Maus Utriculus und Adenovirus-vermittelten Hilfs-Zell-Infektion

Published: March 28, 2012 doi: 10.3791/3734
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Microbiology & Immunology, Medical University of South Carolina, 3National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

ERRATUM NOTICE

Summary

Mechanosensorischen Haarzellen sind die Sinneszellen des Innenohres. Der am besten charakterisierte

Abstract

Schwerhörigkeit und Gleichgewichtsstörungen werden oft durch den Tod von mechanosensorischen Haarzellen, die die Sinneszellen im Innenohr verursacht werden. Da es keine Zelllinie, die zufriedenstellend für Säuger-Haarzellen setzt Forschung Haarzellen auf Hauptorgan Kulturen. Die in vitro-Modellsystem von reifem Säuger Haarzellen am besten charakterisierte verwendet Organkulturen von Primordialschläuche von erwachsenen Mäusen (1) 1-6. Der Utriculus ist ein Gleichgewichtsorgan, und die Haarzellen des Utriculus sind ähnlich in Struktur und Funktion der Haarzellen im Hörorgan, das Corti-Organ. Die erwachsenen Maus Utriculus Vorbereitung stellt eine reife Sinnesepithel für Studien über die molekularen Signale, die das Überleben, Homöostase und Tod dieser Zellen zu regulieren.

Mammalian Haarzellen der Cochlea sind terminal differenziert und werden nicht regeneriert, wenn sie verloren sind. In Nicht-mammalischen Wirbeltiere, auditive oder vestibuläre Haarzelle der Tod durch robuste Regeneration, die Gehör und Gleichgewicht Funktionen 7, 8 wieder gefolgt. Haare Zellregeneration wird durch Glia-wie Stützzellen, die die basolateralen Oberflächen der Haarzellen in der Sinnesepithel 9, 10 Kontakt vermittelt. Stützzellen sind auch wichtige Mediatoren der Haarzelle Überleben und Tod 11. Wir haben vor kurzem eine Technik für die Infektion von Stützzellen in kultivierten Primordialschläuche Verwendung von Adenovirus entwickelt. Verwendung von Adenovirus Typ 5 (dE1/E3), ein Transgen enthält GFP unter der Kontrolle des CMV-Promotors zu liefern, finden wir, dass Adenovirus-spezifisch und effizient infiziert Stützzellen. Unterstützende Zellinfektion ein Wirkungsgrad von ca. 25-50%, und Haarzellen nicht infiziert sind (Abbildung 2). Wichtig ist, finden wir, dass adenovirale Infektion von Stützzellen nicht in die Toxizität für Haarzellen oder Stützzellen führen, da Zellzahlen in der Ad-GFP-infektieren Primordialschläuche denen entsprechen, die in nicht-infizierten Primordialschläuche (Abbildung 3). So Adenovirus-vermittelten Genexpression in Stützzellen des kultivierten Primordialschläuche ist ein leistungsstarkes Tool, um die Rollen von Stützzellen als Vermittler der Haare das Überleben der Zelle, Tod und Regeneration zu studieren.

Protocol

1. Utriculus Dissection und Kultur

  1. Euthanize einen Erwachsenen (4 Wochen alt oder älter) Maus unter Verwendung eines zugelassenen Protokoll und enthaupten.
  2. Snip den äußeren Gehörgang auf beiden Seiten des Kopfes und ziehen Sie die Haut nach vorn in Richtung der Nase. Halbierung der Kopf von hinten nach vorne und entfernen Sie das Gehirn von beiden Seiten, um die knöchernen Labyrinth zu offenbaren.
  3. Kürzen Sie den Schädel weg von der knöchernen Schnecke und überweisen Sie den knöchernen Labyrinth (einschließlich der Bulla) auf eine Gewebekultur Kapuze mit einem Binokular ausgestattet (Hinweis: Adenovirus Arbeit sollte in einer Klasse II biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden).
  4. In der Haube, übertragen jede Schnecke auf einer 35-mm Gewebekulturschale mit steriler Sezieren Medien (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (Abbildung 1A).
  5. Wenn die Gehörkapsel noch intakt ist (es ist möglich, die Bulla während des Brutto-Dissektion zu entfernen, indem Sie Ihren Daumennagel zwischen der Bulla und der Spitzedie Cochlea), verwenden Sie zwei Zangen (ein # 3 und # 5 ein), um die Bulla (Abbildung 1B) zu brechen.
  6. Identifizieren Sie die Sehenswürdigkeiten der knöchernen Schnecke Zubereitung: Apex, Base, Gehörknöchelchen, ovale und runde Fenster, VIII. Nervenwurzel, Bogengänge (Abbildung 1 C, D).
  7. Setzen Sie den inneren Ohr in die Schüssel mit der medialen Seite nach oben, so dass die ovalen und runden Fensters und Spitze auf der Unterseite der Schale und der VIII. Nervenwurzel sind nach oben zeigt. Halten Sie die Vorbereitung mit Hilfe einer Pinzette # 3 in der Region der Bogengänge (1D).
  8. Mit einem Skalpell mit einer # 11 Klinge ausgestattet, schneiden Sie die Spitze der Cochlea nur apikal der Nervenwurzel (1D).
  9. Drehen Sie die Vorbereitung, so dass die abgeschnittenen Teil nach oben zeigt. Verwenden Sie den anterioren Bogengangs als Griff, um die Vorbereitung (1E) zu stabilisieren.
  10. Mit Nr. 5 Zange, entfernen Sie die Hörschnecke an den Modiolus nach untenmit der Basis. An der Stelle, wo der Haken Bereich der Cochlea sich nach unten dreht, mit einem feinen Sonde (die Hälfte eines zerbrochenen Nr. 55 Pinzetten), um die letzte knöchernen Regal des knöchernen Lamina spiralis (1F) anheben und enthüllt den Sacculus. Direkt unter der Sacculus ist die Stapesfußplatte, was ein wichtiger Meilenstein ist. Die Schlauches unmittelbar an der Fußplatte (1G), und es ist von Knochen umgeben. Verwenden Sie die Sonde, um den Knochen splittern weg genug, um etwa 1/3 des Utriculus offenbaren. Entfernen Sie vorsichtig die Utriculus mit einer Pinzette # 55 (Abbildung 1H). Dieses Verfahren wird in der Regel bei der Entfernung des pigmentierten Dach Epithel führen, da die Schlauches von der knöchernen Herstellung gezogen wird. Wenn jedoch die Schlauches mit dem Dach Epithel intakt entfernt wird, kann das Dach abgenommen mit Nr. 55 Zangen werden.
  11. Primordialschläuche für Adenovirus-Infektion (oder Live-Imaging-Experimente) müssen die Otokonien während der Dissektion (vor der Infektion) entfernt.In diesem Fall verwenden Sie einen Luer-Lock-Spritze, die mit Sezieren Medien gefüllt ist und mit einer kleinen Injektionsnadel (in der Regel 26 bis 28 Gauge). Halten Sie den Utriculus am Rand mit einer Pinzette # 55 (Abb. 1I). Bringen Sie die Nadelspitze in der Nähe des Schlauches mit der Abschrägung der Nadel nach unten zeigt. Verwenden Sie einen Stream zu sezieren Medien Abblasen des Otokonien (Abb. 1J). Alternativ können Otokonien durch Streichen sie weg mit der Wimper Werkzeug (Ted Pella, Inc. # 113) entfernt werden. Primordialschläuche, die nicht gehen, um Adenovirus-Infektion zu unterziehen sind in der Regel kultivierte freischwebend im 24-well-Zellkulturplatten mit dem Otokonien intakt (siehe unten für Post-fix Otokonien Entfernung, was leichter ist).
  12. Sobald alle Primordialschläuche seziert werden, ändern Sie die Medien zu sezieren sterilen Nährmedien: DMEM F12 (Gibco Nr. 11320) mit 5% FBS und 50 U / ml Penicillin G (Sigma) ergänzt.
  13. Primordialschläuche werden bei 37 ° C und 5% CO 2 kultiviert. Wenn Kulturen sind zu mainta seininiert für mehr als 48 Stunden, sollte die Hälfte der Kulturmedien jeden zweiten Tag gewechselt werden. Kulturen können für eine Woche oder länger aufrechterhalten werden.

2. Adenovirus-Infektion von Stützzellen

Wichtig: Die Arbeit mit Adenovirus erfordert Biosafety Level 2 (BSL2) und Urkunde. Fragen Sie bei Ihrem Institutional Biosafety Officer für Beratung und Weiterbildung auf BSL2 Verfahren.

  1. Sezieren Primordialschläuche wie oben in Dissektion Medien (kein Serum). Entfernen Sie Otokonien wie oben.
  2. Wenn Sie bereit sind zu infizieren, übertragen ein Utriculus (Haarzellen nach oben) in jedes Well ein Nunc Mini-Tray (Fisher # 12-565-68) mit 15 ul serumfreiem DMEM F12 (das ist wichtig, weil Serum das Virus zu inaktivieren kann) . Dieser Transfer ist leichter, mit einem 1,5 mm microcurette (# 10082-15 von Fine Science Tools).
  3. Unsere Ad-GFP ist Serotyp 5 mit den viralen Gene E1 und E3 gelöscht und des humanen CMV-Promotor, der die transgen (GFP). Dieses Virus wurde von Vector BioLabs (Philadelphia, PA erhalten vectorbiolabs.com ). Lager Viren in Titern von 1,0-4,0 × 10 10 PFU / ml bereitgestellt. In 0,5-2 ul Lager Virus in jede Vertiefung mit einem Utriculus (Abb. 1 l). Die tatsächliche Menge verwendet wird, variiert in Abhängigkeit von dem Virus und-Titern. Wir in der Regel infizieren sich Utriculus mit 1,0-4,0 × 10 7 PFU.
  4. Kultur die Primordialschläuche in Virus-enthaltenden Medium bei 37 ° C / 5% CO 2 für 2 Stunden. Nach 2 Stunden, übertragen Sie die Primordialschläuche zurück auf die 24-Well-Zellkultur-Platte, die Nährböden mit Serum. Kultur Primordialschläuche die über Nacht bei 37 ° C / 5% CO 2.
  5. Primordialschläuche kann verwendet werden, am nächsten Tag für die Live-Imaging-Experimenten werden, oder sie können für Haarzelle Immunchemie befestigt werden (siehe unten). Virale Transgenexpression der Zeit zunimmt, so dass, wenn Transgenexpression ist bei 24 Stunden nach der Infektion gering auch immerNutzen zur Kultivierung von Zellen weitere 24 Stunden in serumhaltigen Medien. Wenn Sie Haarzelle Toxizität sehen, reduzieren die Menge an Virus verwendet.

3. Utriculus Fixierung, Otokonien Removal, und Immunchemie

  1. Am Ende der Kulturzeit, zu fixieren Primordialschläuche in 4% Paraformaldehyd für entweder 3 Stunden bei Raumtemperatur (auf einer Schüttelplattform) oder über Nacht bei 4 ° C Wash Primordialschläuche (3-mal, jeweils 15 min) in 0,1 M (1X) Sorensens Phosphatpuffer pH 7,4. Diese Schritte werden in einer 24-Well Gewebekultur-Platte durchgeführt.
  2. Otokonien Entfernung: Hinweis: Otokonien muss vor der Adenovirus-Infektion entfernt werden (siehe Schritt 1,11 oben). Allerdings kann Primordialschläuche, die nicht infiziert zu sein, kultiviert und mit dem Otokonien noch intakt fixiert werden. In diesem Fall verwenden Sie die hier beschriebenen Schritte, um die Otokonien nach der Fixierung zu entfernen. Überprüfen Primordialschläuche sie für jeden weiteren pigmentierte Epithel Dach. Entfernen Sie vorsichtig das restliche Dach Epithel mit zwei Nr. 55 forceps. Um die Otokonien entfernen, ersetzen Sorensen-Phosphat-Puffer mit 750-1000 ul Cal-Ex-Entkalker (Fisher # CS510-1D). Verlassen Sie Cal-Ex auf Primordialschläuche für 1 Minute und 40 Sekunden (nicht mehr als 2 Minuten). Ersetzen Sie Cal-Ex mit 0,1 M Sorensen-Phosphat-Puffer und waschen (5-mal, jeweils 5 min).
  3. Inkubieren Primordialschläuche in Natriumborhydrid (Sigma # 452882, 1% in VE-Wasser) für 10 min. Waschen Sie Primordialschläuche in 0,1 M Sörensen-Phosphatpuffer (5-mal, jeweils 5 min).
  4. Platz Primordialschläuche in Blocking-Lösung (PBS + 2% Rinderserumalbumin + 0,8% normales Ziegenserum + 0,4% Triton X-100) für 3 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttler Plattform.
  5. In primären Antikörpern und über Nacht bei 4 ° C Anti-Myosin 7a (entweder Proteus Biosciences # 25-6790 oder # MYO7A 138-1 aus der Developmental Studies Hybridoma Bank) bei 1:100 in Blockierungslösung Etiketten alle Haarzellen. Separat zu beschriften striolar und nicht-striolar Haarzellen, haben wir ein Doppel-Label-Protokolls in Verwendungl mit monoklonalen anti-Calmodulin (Sigma C # 3545; 1:150) und polyklonalen anti-Calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, USA; 1:200). Sekundäre Antikörper (Alexa Fluor meist konjugierte sekundäre Antikörper von Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) werden 1:500 in Blocking-Lösung verdünnt und für 4 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur auf einem schwankenden Plattform.
  6. Berg Primordialschläuche auf Glasplättchen mit Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA).

4. Repräsentative Ergebnisse

Primordialschläuche kultiviert mit dieser Methode die volle Ergänzung der beiden Haar-und Stützzellen (Abbildung 2). Haarzellen im gesunden Kulturen zeigen Runde nuklearen Profile von dünnen zytoplasmatischen Regionen, die Myosin-positiven 7a umgeben sind (Abbildung 2, oberes Feld). Stützzellen (markiert mit anti-Sox2) sind kleiner und dichter besiedelt als Haarzellen (Abb. 2, unten) verpackt. Adenovirus infiziert 25-50% der Stützzellen im Utriculus, und keine Haarzellen infiziert sind (Abbildung 2, Ad-GFP-Panels). Es sei darauf hingewiesen, dass die optimale Arbeitsbedingungen Titer jeder Adenovirus empirisch ermittelt werden müssen, da Haar Zelltod ist möglich, wenn der virale Titer zu hoch ist. Darüber hinaus werden die Regionen von mechanischen Beschädigungen (verursacht während der Dissektion) nehmen große Mengen an Virus. Diese Regionen einer mechanischen Beschädigung sind leicht zu erkennen durch eine durchgezogene Linie von Zellen mit sehr hohen GFP-Expression und fehlende Haarzellen. Dies steht im Gegensatz zu der gestreuten GFP-Expression in Stützzellen eines unbeschädigten Kultur (2).

1
Abbildung 1. Utriculus Dissection. A:. Gehörkapsel (AB). B: Die Bulla ist gebrochen mit zwei stabilen Zange C: knöchernen Schnecke (RW = runde Fenster, S =. A. stapedia, C = Cochlea, ST = Stapes) D: A Skalpellklinge (SB) dient zum Abschalten der Spitze der Cochlea apikal des VIII. Hirnnerven (8 th N) ASC = anterioren Bogengangs E..: Die Herstellung ist fest mit einer # 3-Zange mit einer Gabel in die vordere Bogengang (ASC) und das andere auf der äußersten Knochen (Pfeile) eingesetzt gehalten wird. Das häutige Labyrinth wird mit einer Pinzette entfernt F:. Mit der häutigen Labyrinths entfernt, ist der basalen Windung des knöchernen Spiralblatt sichtbar in der Nähe des Hakens Region. Eine feine Sonde wird unter dieser knöchernen Regal eingefügt, um das Regal anheben und entfernen Sie sie (Pfeil) G:. Nach der Entfernung des Sacculus ist Utriculus (U) sichtbar unmittelbar neben dem Stapesfußplatte (SF) H:. Utriculus (U ) wird unter Verwendung eines # 55 Zange (Pfeil) SF = Stapesfußplatte I:.. Utriculus mit Otokonien (O) teilweise entfernt eind Sinnesepithel (SE) darunter sichtbar J:. Otokonien (O) aus des Schlauches mit einem Strom von Medien durch eine Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet geliefert entfernt. Der Schatten der Nadel (n) ist sichtbar am unteren Rand des Bildes K:. Utriculus mit Otokonien entfernt und Sinnesepithel (SE) sichtbar L:. Adenoviralen Infektion: je Utriculus (U) ist im Einzelfall auch von einer Mini platziert -Fach. Hintergrundinformationen Zellen mit Adenovirus durch Pipettieren Virus in dem Bohrloch (P = Pipettenspitze) infiziert.

2
Abbildung 2. Adenovirus-vermittelte Infektion von Zellen unterstützen. Primordialschläuche wurden mit Adenovirus die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP-Ad) infiziert. Es zeigen konfokale Bilder der Haare Zellschicht und der unterstützenden Zellschicht im gleichen Bereich eines Schlauches. Haar-Zellen werden mit einem Antikörper gegen Myosin 7a markierten(Magenta). Hintergrundinformationen Zellen mit einem Antikörper gegen Sox2 (rot) markiert. Schema zeigt die Struktur des Utriculus Sinnesepithel und die Standorte der Haarzellen (HC) und Stützzellen (SC). Standorte der konfokalen (optisch) Abschnitte in der oberen (U) und unteren gezeigt (L) Platten sind durch gestrichelte Linien in der schematischen angegeben. Obere Platten: Bei der konfokalen Bilder auf der Ebene der Haare Zellkernen, scheint sich Ad-GFP-Signal in den Zwischenräumen zwischen Haarzellen und nicht mit dem Haar Zellmarker Myosin 7a überlappen. Untere Reihe: In konfokale Schnitte auf der Ebene der tragenden Zellkerne, kolokalisiert Ad-GFP-Signal mit der tragenden Zellmarker Sox-2. Ad-GFP-Infektion führt zu einer GFP-Expression in Stützzellen nur, und kein Haar Zellen infiziert.

Abbildung 3
Abbildung 3. Adenoviralen Infektion nicht mit dem Tod der Haarzellen oder Stützzellen führen. Utricles wurden mit Ad-GFP bei 4 × 10 8 PFU / ml infiziert. Primordialschläuche wurden mit Antikörpern gegen Myosin 7a (Haar-Zell-Marker) und Sox2 (mit Unterstützung für Zell-Marker) beschriftet. Haarzelle und Unterstützung Zellzahlen waren gleich zur Kontrolle Primordialschläuche und Ad-GFP infiziert Primordialschläuche.

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Discussion

Sensorischen Haarzellen sind anfällig für den Tod von einer Vielzahl von Belastungen, einschließlich Altersstruktur, Knalltrauma, und der Exposition gegenüber ototoxischen Medikamenten, einschließlich der Aminoglykosid-Antibiotika und der Antineoplastikum Cisplatin verursacht. Bei Säugetieren Haare Zelltod führt zu permanentem Hörverlust und / oder Störung Gleichgewicht. In-vitro-Modellsysteme sind entscheidende Werkzeuge für das Studium an der Bestimmung der zellulären und molekularen Mechanismen, die Haare Zelltod, als auch jene zu verhindern oder umzukehren Haar Zelltod Ziel gerichtet . Im Gegensatz zu Haarzellen der Cochlea von erwachsenen Säugetieren, Haarzellen des Utriculus gut überleben in der Kultur. Utriculus Haarzellen reagieren empfindlich auf den Tod vor der Exposition gegenüber den gleichen therapeutischen Medikamenten, die toxisch für Haarzellen der Cochlea sind, und die zellulären Mechanismen ototoxische Haarzelle Tod und Überleben sind ähnlich für beide utrikulären und Haarzellen der Cochlea 12-18. Außerdem, wenn Daten in der Utriculus Modellsystem erhaltenen tested in vivo hat die Vorbereitung Utriculus sich als zuverlässiger Prädiktor für das Überleben der Zelle Haar und Tod in der reifen Schnecke 12, 18-21 sein. Die Maus Utriculus Vorbereitung erlaubt uns auch, die Auswirkungen von spezifischen Proteinen durch die Nutzung Primordialschläuche von transgenen und Knockout-Tieren zu untersuchen.

Die Signale, die das Überleben und den Tod von Haarzellen unter Stress zu vermitteln sind kaum verstanden. Allerdings schlägt Anzeichen dafür, dass andere Zelltypen im Innenohr können eine wichtige Rolle bei der Bestimmung, ob Haarzellen unter Stress letztlich leben oder sterben 11, 22, 23 zu spielen. Der Utriculus Modellsystem verwendet werden, um diese kritischen Zell-Zell-Interaktionen in einem reifen Säugern Sinnesepithel zu untersuchen. Adenovirale Infektion stellt ein Verfahren zur Veränderung der Genexpression in Zellen unterstützt und erleichtert so Studien über die Rolle (n) von Stützzellen im Haar Überleben der Zelle, Tod, Phagozytose und Regeneration.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Interne Forschung am National Institute on Taubheit und andere Kommunikations Erkrankungen unterstützt. Zusätzliche Unterstützung wurde von NIDCD 5R01 DC007613 zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medium 199 GIBCO, by Life Technologies 12350
DMEM/F12 GIBCO, by Life Technologies 11320
Fine forceps (#55) Fine Science Tools 11255-20
Fine forceps (#5) Fine Science Tools 11252-30
Forceps (#3) Fine Science Tools 11231-30
Penicillin G Sigma-Aldrich P3032
Fetal bovine serum Invitrogen 10082-139
Nunc mini-tray Fisher Scientific 12-565-68
Adenovirus-GFP Vector Biolabs 1060*
Cal-Ex decalcifier Fisher Scientific CS510-1D
sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882
Anti-Myosin 7a (polyclonal) Proteus Biosciences 25-6790
Anti-Myosin 7a (monoclonal) Developmental Studies Hybridoma Bank MYO7A 138-1
Anti-Calmodulin Sigma-Aldrich C 3545
Anti-Calbindin Chemicon International AB1778
Fluoromount G SouthernBiotech 0100-01
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1x1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.

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Tags

Neuroscience Ausgabe 61 Haarzelle Ototoxizität Hörverlust Organkultur

Erratum

Formal Correction: Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection
Posted by JoVE Editors on 04/17/2012. Citeable Link.

A correction was made to Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection. The incorrect version of figure 2 was published, the middle initials of the authors were omitted, and the acknowledgements were updated.

Figure 2. Adenovirus-mediated infection of supporting cells was corrected to include a schematic showing the structure of the utricle sensory epithelium. The incorrect figure was inadvertently published. This error does not change the scientific conclusions of the article in any way. The editors apologize for this error.

The acknowledgements were updated to:

The authors are grateful to Dr. Shimon P. Francis for generating the confocal micrographs.

This work was supported by the Division of Intramural Research at the National Institute on Deafness and Other Communication Disorders. Additional support was provided by NIDCD 5R01 DC007613.

From:

This work was supported by the Division of Intramural Research at the National Institute on Deafness and Other Communication Disorders. Additional support was provided by NIDCD 5R01 DC007613.

The authors were updated to:

Carlene S. Brandon, Christina Voelkel-Johnson, Lindsey A. May, Lisa L. Cunningham

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Carlene Brandon, Christina Voelkel-Johnson, Lindsey May, Lisa Cunningham

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