Dissecção da utrículo rato adulto e adenovírus Infecção mediada por células Coadjuvante

Summary

Células ciliadas mecanosensorial são as células receptoras do ouvido interno. A melhor caracterizado

Abstract

A perda de audição e distúrbios de equilíbrio são frequentemente causada pela morte das células ciliadas mecanosensorial, que são as células receptoras do ouvido interno. Uma vez que não há nenhuma linha de células que satisfatoriamente representa células capilares dos mamíferos, a investigação sobre as células ciliadas depende culturas de órgãos principais. A melhor caracterizados in vitro sistema modelo de células maduras de cabelo de mamíferos utiliza culturas de órgãos de utrículos de ratinhos adultos (Figura 1) ^1-6. O utrículo é um órgão vestibular, e as células ciliadas do utrículo são semelhantes em estrutura e função das células ciliadas no órgão auditivo, o órgão de Corti. O adulto preparação utrículo rato representa um epitélio maduro sensorial para os estudos dos sinais moleculares que regulam a sobrevivência, a homeostase e morte dessas células.

Mamífero células ciliadas são terminalmente diferenciadas e não são regenerados, quando são perdidos. Em não-mamvertebrados do Mali, auditivas ou morte celular vestibular cabelo é seguido por regeneração robusta que restaura a audição e equilíbrio funções ^{7, 8.} Regeneração de células ciliadas é mediada por células gliais-like células de suporte, que contactam com as superfícies basolateral de células ciliadas no epitélio sensorial ^{9, 10.} Células de suporte são também mediadores importantes da sobrevivência de células ciliadas e morte ^11. Recentemente, desenvolveu uma técnica para a infecção de células de suporte em utrículos cultivadas utilizando adenovírus. Usando o adenovírus tipo 5 (dE1/E3) para entregar um transgene contendo GFP sob o controlo do promotor de CMV, descobrimos que o adenovírus especificamente e de forma eficiente infecta células de suporte. Suportando eficiência de infecção de células é de aproximadamente 25-50%, e as células do cabelo não estão infectadas (Figura 2). Importante, descobrimos que a infecção adenoviral de células de suporte não resultar em toxicidade para as células ciliadas ou células de suporte, tal como as contagens de células em Ad-GFP infutrículos ected são equivalentes aos da não-infectadas utrículos (Figura 3). Assim adenovírus mediada por expressão gênica em células de suporte de utrículos cultura fornece uma ferramenta poderosa para estudar os papéis de células de suporte, como mediadores da sobrevivência das células ciliadas, morte e regeneração.

Protocol

1. Dissecção utrículo e Cultura

1. Euthanize um adulto (4 semanas de idade ou mais velhos) do mouse através de um protocolo aprovado e decapitar.
2. Cortar o canal auditivo externo em ambos os lados da cabeça e puxar a pele para a frente para o nariz. Bisect a cabeça de trás para a frente e retirar o cérebro de ambos os lados para revelar o labirinto ósseo.
3. Aparar o crânio para longe da cóclea óssea e transferir o labirinto ósseo (incluindo a bolha) para um capuz de cultura de tecidos equipado com um microscópio de dissecação (Nota: Adenovirus trabalho deve ser realizado numa câmara de segurança biológica Classe II).
4. Na capa, transferir cada cóclea para um prato de 35 milímetros de cultura de tecidos contendo estéreis meios de dissecção (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (Figura 1A).
5. Se a bula auditiva ainda está intacto (é possível remover a bolha durante a dissecção macroscópica, inserindo o seu polegar entre a bula eo ápice doa cóclea), utilizar duas pinças (um # 3 e # 5 um) para quebrar a bolha (Figura 1B).
6. Identificar os marcos da preparação cóclea óssea: ápice, base, ossículos, janelas oval e redonda, VIII raiz nervosa, canais semicirculares (Figura 1 C, D).
7. Colocar o ouvido interno no prato com o lado medial voltada para cima, de tal modo que as janelas oval e redonda e ápice estão na parte inferior do prato ea raiz do nervo VIII está virada para cima. Mantenha a preparação usando um # 3 fórceps na região dos canais semicirculares (Figura 1D).
8. Usando um bisturi equipado com uma lâmina de # 11, cortar o ápice da cóclea apenas apical para a raiz do nervo (Figura 1D).
9. Transformar a preparação de modo que a porção de corte é voltada para cima. Use o canal semicircular anterior como uma pega para estabilizar a preparação (Figura 1E).
10. Usando # 5 pinças, remova a cóclea nas modíolo baixopara a base. No ponto onde a região de gancho da cóclea vira para baixo, usar uma sonda fina (metade de um quebradas # 55 fórceps) para levantar a última prateleira óssea do lâmina espiral óssea (Figura 1F), revelando a sáculo. Apenas sob o sáculo é a platina do estribo, que é um marco importante. O utrículo é imediatamente adjacente ao platina do estribo (Figura 1G), e é rodeado por osso. Use a sonda para lascar o osso distância suficiente para revelar aproximadamente 1/3 do utrículo. Retire cuidadosamente o utrículo usando # 55 fórceps (Figura 1H). Este procedimento normalmente irá resultar na remoção do epitélio pigmentado telhado como o utrículo é puxada a partir da preparação óssea. No entanto, se o utrículo é removido com o epitélio telhado intacto, o telhado pode ser removida utilizando # 55 fórceps.
11. Utrículos para a infecção por adenovirus (ou experiências para imagens ao vivo) deve ter o otoconia removido durante a dissecção (antes da infecção).Neste caso, usar uma seringa Luer-Lock que é preenchida com os meios de dissecação e equipada com uma agulha de pequeno calibre (geralmente 26-28 manométrica). Segure o utrículo na borda usando # 55 fórceps (Figura 1I). Traga a ponta da agulha perto do utrículo com o bisel da agulha apontando para baixo. Use um fluxo de dissecar mídia para explodir o otoconia (Figura 1J). Alternativamente, otoconia pode ser removido por escovagem-los fora usando uma ferramenta de pestana (Ted Pella, Inc. # 113). Utrículos que não vão se submeter a infecção adenoviral são normalmente cultivadas de livre flutuação em placas de 24 poços de cultura de tecidos com o otoconia intacta (veja abaixo a correção pós-remoção otoconia, que é mais fácil).
12. Uma vez que todos os utrículos são dissecados, alterar os meios de comunicação de dissecação para meios de cultura estéril: DMEM F12 (Gibco # 11320) suplementado com 5% de FBS e 50 U / ml de penicilina G (Sigma).
13. Utrículos são cultivadas a 37 ° C e 5% de CO _2. Se as culturas são para ser maintaINED por mais de 48 horas, metade dos meios de cultura deve ser mudada a cada dois dias. Culturas pode ser mantida, durante uma semana ou mais.

2. Infecção por adenovírus de Células de Apoio

Importante: Trabalhando com o adenovírus exige Nível de Biossegurança 2 (BSL2) procedimentos e certificação. Verifique com o seu Diretor de Biossegurança Institucional para a orientação e treinamento sobre BSL2 procedimentos.

1. Dissecar utrículos como acima em meios de dissecção (sem soro). Remover otoconia como acima.
2. Quando pronto para infectar, transferir um utrículo (células ciliadas acima) em cada poço de uma mini-Nunc bandeja-(Fisher # 12-565-68) contendo 15 uL DMEM isento de soro F12 (isto é importante porque o soro pode inactivar o vírus) . Esta transferência é mais fácil com um 1,5 milímetros microcurette (# 10082-15 de Ferramentas Ciência Belas).
3. O nosso Ad-GFP é serotipo 5 com os genes virais E1 e E3 e apagados do promotor de CMV humano dirigindo o transgeno (GFP). Este vírus foi obtido a partir de Vector Biolabs (Philadelphia, PA vectorbiolabs.com ). Os vírus de Stock são fornecidos em títulos de 1,0-4,0 × ¹⁰ 10 PFU / ml. Adicionar 0,5-2 ul de estoque de vírus a cada poço contendo um utrículo (Figura 1D). A quantidade real utilizada varia, dependendo do título do vírus e do material. Nós normalmente infectam cada utrículo com 1,0-4,0 × 10 ⁷ PFU.
4. Cultura os utrículos em vírus, contendo meios a 37 ° C / _5% de CO2 durante 2 horas. Após 2 horas, transferir os utrículos de volta para a placa de cultura de 24 poços contendo meio de cultura de tecidos com o soro. Cultura os utrículos durante a noite a 37 ° C / 5% de CO _2.
5. Utrículos pode ser usado no dia seguinte para experiências para imagens ao vivo, ou eles podem ser fixados para imunoquímica de células ciliadas (ver abaixo). Aumentos transgene virais expressão ao longo do tempo, por isso, se a expressão do transgene é baixa de 24 horas pós-infecção, ele podebenéfico para células de cultura de um período adicional de 24 horas em soro contendo meios de comunicação. Se você ver toxicidade celular de cabelo, reduzir a quantidade de vírus utilizado.

3. Fixação utrículo, Remoção otoconia e Imunoquímica

1. No final do período de cultura, fixar utrículos em paraformaldeído a 4%, quer para 3 horas à temperatura ambiente (numa plataforma de agitação) ou durante a noite a 4 ° C. Utrículos de lavagem (3 vezes, 15 min cada) em 0,1 M (1X) pH tampão de Sorensen fosfato 7,4. Estes passos são realizados numa placa de cultura de 24 poços de tecido.
2. Otoconia remoção: Nota: otoconia deve ser removido antes da infecção com adenovírus (ver passo 1,11, supra). No entanto, utrículos que não são para ser infectadas podem ser cultivadas e fixada com o otoconia ainda intacta. Neste caso, use os passos descritos aqui para remover o otoconia após a fixação. Inspecione utrículos para qualquer epitélio pigmentado telhado restante. Remova cuidadosamente qualquer epitélio telhado restante usando dois f # 55orceps. Para remover o otoconia, substituir tampão de Sorensen de fosfato com 750-1000 uL Cal-Ex descalcificante (Fisher # CS510-1D). Deixe Cal-Ex em utrículos por 1 minuto e 40 segundos (não ultrapassar 2 minutos). Substituir Cal-Ex com 0,1 M de tampão fosfato de Sorensen e de lavagem (5 vezes, 5 min cada).
3. Incubar utrículos em boro-hidreto de sódio (Sigma # 452,882, 1% em água desionizada) durante 10 mins. Lavar utrículos em tampão fosfato 0,1 M de Sorensen (5 vezes, 5 min cada).
4. Utrículos lugar em solução de bloqueio (PBS + 2% de albumina sérica bovina + 0,8% do normal soro de cabra + 0,4% de Triton X-100) durante 3 horas à temperatura ambiente numa plataforma oscilante.
5. Adicionar anticorpos primários e incubar durante a noite a 4 ° C. Anti-Miosina 7a (quer Proteus Biosciences # 25-6790 ou # 138-1 MYO7A a partir do Developmental Estudos Hybridoma Bank) em 1:100 em solução de bloqueio rótulos todas as células ciliadas. Para separadamente rotular células ciliadas striolar e não-striolar, utilizou-se um duplo Protoco-labell com anticorpo monoclonal anti-calmodulina (Sigma # 3545 C; 1:150) e policlonais anti-calbindina (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, EUA; 1:200). Os anticorpos secundário (geralmente Alexa Fluor anticorpos secundários conjugados de Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) são diluídos 1:500 em solução de bloqueio e incubadas durante 4 horas no escuro à temperatura ambiente em uma plataforma de agitação.
6. Utrículos montagem em lâminas de vidro usando Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, EUA).

4. Os resultados representativos

Utrículos cultivadas utilizando este método reter complementos da tanto as células do cabelo e células de suporte (Figura 2). As células capilares nas culturas saudáveis ​​mostram redondos perfis nucleares rodeadas por finas regiões citoplasmáticas que são miosina 7a-positivo (Figura 2, painel superior). Células de suporte (marcado com anti-Sox2) são menores e mais densamente do que células ciliadas (Figura 2, painel inferior). Adeadenovírus infecta 25-50% das células de suporte na utrículo, e não as células ciliadas são infectadas (Figura 2, o Ad-GFP painéis). Deve notar-se que o título óptima de trabalho de cada adenovírus devem ser determinadas empiricamente, dado que a morte celular de cabelo é possível se o título virai é muito alta. Além disso, as regiões de danos mecânicos (causados ​​durante a dissecção) vai ocupar grandes quantidades de vírus. Estas regiões de danos mecânicos são facilmente distinguíveis por uma linha contínua de células com níveis muito elevados de expressão da GFP e células ciliadas ausentes. Isto está em contraste com a expressão da GFP dispersa em células de suporte de uma cultura danificado (Figura 2).

Figura 1. Utrículo Dissection. A: C A bula é quebrada usando duas pinças robustas::. Auditivo bulla (AB) B. Cóclea Bony (RW = janela redonda, S =. artéria estapediano, C = cóclea, st = estribo) D: A lâmina de bisturi (SB) é usado para cortar o ápice da cóclea apical do nervo craniano VIII (8 ^º N) ASC = E canal semicircular anterior..: A preparação é mantida firmemente usando uma pinça # 3 com um garfo inserido no canal semicircular anterior (ASC) eo outro sobre o osso mais exterior (setas). O labirinto membranoso é removido utilizando fórceps F:. Com o labirinto membranoso removido, o giro basal da lâmina espiral óssea é visível perto da região de gancho. Uma sonda fina é inserido por baixo desta prateleira ósseo para levantar a prateleira para cima e removê-la (seta) G:. Após a remoção do sáculo, utrículo (U) é visível imediatamente adjacente à platina do estribo (SF) H:. Utrículo (U ) é removido usando um fórceps # 55 (seta) SF = platina do estribo I:.. utrículo com otoconia (O) parcialmente removida umad sensoriais epitélio (SE) por baixo visíveis J:. otoconia (O) são removidos do utrículo com uma corrente de material fornecido por uma seringa com uma agulha de calibre 26. A sombra da agulha (S) é visível na parte inferior da imagem de K:. Utrículo com otoconia removido e epitélio sensorial (SE) L visível:. Infecção adenoviral: cada utrículo (U) é colocado em um poço individual de um mini -bandeja. Células de suporte são infectadas com adenovírus por pipetagem de vírus para dentro do poço (P = ponta de pipeta).

Figura 2. Adenovírus mediada infecção de células de suporte. Utrículos foram infectadas com adenovírus de condução de expressão da proteína fluorescente verde (Ad-GFP). Mostrado são imagens confocais da camada de células do cabelo e da camada de células de suporte na mesma área de um utrículo. As células ciliadas são rotulados com um anticorpo contra 7a Miosina(Magenta). Células de suporte são rotulados com um anticorpo contra Sox2 (vermelho). Esquemática mostra a estrutura do epitélio utricular sensorial e as localizações das células ciliadas (HC) e células de suporte (SC). Localizações de confocal (óptico) secções mostradas na parte superior (U) e inferior (L) Os painéis são indicadas por linhas tracejadas na esquemática. Os painéis superiores: Em imagens confocais tomadas ao nível dos núcleos de células ciliadas, Ad-GFP sinal aparece nos espaços entre as células ciliadas e não se sobrepõem com o cabelo 7a Miosina célula marcador. Os painéis inferiores: Em secções confocal ao nível dos núcleos das células de suporte, Ad-GFP sinal colocalizes com o marcador de células de suporte Sox-2. Resultados anúncio GFP-infecção em GFP expressão em células de suporte apenas, e não células ciliadas estão infectados.

Figura 3. Infecção adenoviral não resultar na morte das células ciliadas ou células de suporte. Utricles foram infectadas com o Ad-GFP em 4 × 10 ⁸ PFU / ml. Utrículos foram marcadas com anticorpos contra Miosina 7a (marcador de células ciliadas) e Sox2 (suportando marcador de células). Células ciliadas e contagem de células de apoio foram iguais para utrículos controle e Ad-GFP utrículos infectados.

Discussion

As células pilosas sensitivas são susceptíveis à morte provocada por uma variedade de tensões, incluindo o envelhecimento, trauma de ruído, e exposição a drogas ototóxicas, incluindo os antibióticos aminoglicósidos e da cisplatina agente antineoplásico. Em mamíferos cabelo resulta de morte celular em perda permanente da audição e / ou distúrbio do equilíbrio. Em sistemas de modelo in vitro são ferramentas importantes para estudos que visem determinar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes a morte celular de cabelo, bem como aquelas destinadas a prevenir ou reverter a morte das células ciliadas . Ao contrário das células ciliadas de mamíferos adultos, as células ciliadas do utrículo sobreviver bem em cultura. Células ciliadas utrículo são sensíveis à morte da exposição aos mesmos fármacos terapêuticos que são tóxicos para as células ciliadas, e os mecanismos celulares subjacentes a morte celular ototóxica cabelo e sobrevivência são semelhantes para as células ciliadas utriculares tanto e coclear ^12-18. Além disso, quando os dados obtidos no sistema de modelo TE utrículo sãosted in vivo, a preparação utrículo tem provado ser um preditor de confiança de sobrevivência de células ciliadas e morte na cóclea madura ^{12, 18-21.} A preparação utrículo mouse também nos permite examinar os efeitos de proteínas específicas, utilizando utrículos de animais transgênicos e knockout.

Os sinais que medeiam a sobrevivência ea morte de células pilosas sensitivas sob tensão são pouco compreendidos. No entanto, a evidência emergente sugere que outros tipos de células do ouvido interno podem desempenhar papéis importantes em determinar se as células ciliadas sob estresse em última análise, viver ou morrer ^{11, 22, 23.} O sistema de modelo utrículo pode ser usado para examinar estes críticos interacções célula-célula em um epitélio sensorial em mamíferos madura. Infecção adenoviral proporciona um método de alterar a expressão de genes em células de suporte, facilitando assim os estudos do papel (s) de células de suporte na sobrevivência de células ciliadas, a morte, fagocitose e regeneração.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium 199	GIBCO, by Life Technologies	12350
DMEM/F12	GIBCO, by Life Technologies	11320
Fine forceps (#55)	Fine Science Tools	11255-20
Fine forceps (#5)	Fine Science Tools	11252-30
Forceps (#3)	Fine Science Tools	11231-30
Penicillin G	Sigma-Aldrich	P3032
Fetal bovine serum	Invitrogen	10082-139
Nunc mini-tray	Fisher Scientific	12-565-68
Adenovirus-GFP	Vector Biolabs	1060*
Cal-Ex decalcifier	Fisher Scientific	CS510-1D
sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882
Anti-Myosin 7a (polyclonal)	Proteus Biosciences	25-6790
Anti-Myosin 7a (monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	MYO7A 138-1
Anti-Calmodulin	Sigma-Aldrich	C 3545
Anti-Calbindin	Chemicon International	AB1778
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1x1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.