Summary
تم وصف طريقة لتحليل التوزيع من الأسلاف نخاع العظام المكونة للدم في التدفق الخلوي، وكذلك لعزل بكفاءة عالي النقاء الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs). ويستند أساسا لإجراء العزل في تخصيب المغناطيسي للخلايا + C-كيت والخلية فرز لتنقية HSCs للدراسات الخلوية والجزيئية.
Abstract
نخاع العظام هو الموقع الرئيسي حيث HSCs وأكثر نضجا الأسلاف نسب خلايا الدم الموجودة وتفرق في كائن بالغ. HSCs يشكل سكان الخلية الدقيقة من الخلايا المحفزة قادرة على توليد خلايا الدم كل الأنساب لبعض الوقت والحياة 1. تشريح الجزيئي للتوازن HSCs في نخاع العظم لديها آثار مهمة في تكون الدم والأورام والطب التجديدي. وصفنا للبروتوكول وضع العلامات مع الأجسام المضادة فلوري والإجراءات المعزولة الإلكترونية في التدفق الخلوي ليسجل فرعية السلف المكونة للدم وتوزيع HSCs في الفئران الفردية (الشكل 1). وبالإضافة إلى ذلك، ونحن تصف طريقة لتخصيب على نطاق واسع الأسلاف المكونة للدم، وكذلك على المدى الطويل (LT) وعلى المدى القصير (ST) إعادة تشكيل HSCs من تجميع المعلقات العظام خلية نخاع بواسطة التخصيب المغناطيسي للخلايا التعبير عن C-كيت. يمكن استخدامها في إعداد الخلية الناتجة لفرز فرعية المختارة لفي المختبر، وفي الدراسات المجراة وظيفي (الشكل 2).
كلا بانيات التربيقية 2،3 و 4 جيبية البطانة تشكل منافذ وظيفية دعم HSCs في نخاع العظام. عدة آليات في محراب بانية للعظم، بما في ذلك مجموعة فرعية من الخلايا بانية العظم + N-كادهيرين (3) والتفاعل بين مستقبلات التيروزين كيناز Tie2 أعرب في HSCs مع angiopoietin-1 يجند 5 منه نتفق في تحديد HSCs السكون. "السبات" في نخاع العظام أمر بالغ الأهمية لحماية HSCs من التكرار والإرهاق في نهاية المطاف على النشاط المفرط للدراجات 6. يمكن للمنبهات الخارجية تعمل على خلايا نظام المناعة الفطرية مثل يغاندس مستقبلات على الرقم (7) ومثل انترفيرون-α 6 تحفز أيضا الانتشار وتمايز HSCs إلى الأسلاف الملتزم النسب. مؤخرا، يبلغ عدد سكانها HSCs الماوس نائمة داخل لين - C-كيت + هيئة السلع التموينية-1 + CD150 + CD48 - CD34 - وصفت سكان 8. فرز الخلايا استنادا CD34 التعبير عن تعليق الخلية المكونة للدم الأسلاف التخصيب كما هو موضح هنا يسمح للعزلة هادئة على حد سواء الذاتي تجديد LT-HSCs وST-HSCs 9. وقد تم إجراء مماثل على أساس استنفاد الخلايا إيجابية نسب والفرز من LT-شهادة الثانوية العامة مع CD48 و Flk2 الأجسام المضادة التي سبق وصفها 10. في هذا التقرير نقدم بروتوكول للتوصيف المظهري والسابقين تحليل دورة الخلية الحية من أسلاف المكونة للدم، والتي يمكن أن تكون مفيدة لرصد تكون الدم في مختلف الظروف الفسيولوجية والمرضية. وعلاوة على ذلك، ونحن تصف FACS الفرز الداخلي لHSCs، والتي يمكن استخدامها لتحديد العوامل والآليات التي تنظم احترامهن لتجديد وتوسيع والتمايز في بيولوجيا الخلية والمقايسات نقل الإشارة، وكذلك للزرع.
Protocol
1. إعداد تعليق خلية من نخاع العظام
- الموت ببطء الماوس ووضع الحيوان في مقلاة غير القابل للصدأ والايثانول رش 70٪ على البطن والظهر. جمع عظم الفخذ والساق من رجليه الخلفيتين، والعمود الفقري.
- إزالة بقايا بدقة جميع الأنسجة اللينة من العمود الفقري مع مقص حاد وطرف من عظام الأرجل مع الشاش. عظام مخزن في أنبوب 50 مل الصقر مع 30 مل من المتوسط RPMI التي تحتوي على 10٪ حرارة المعطل الجنين مصل بقري (FBS)، على أن تستكمل مع 50 ميكرومتر المركابتويثانول β-، 100 ميكرون MEM غير الضرورية الأحماض الأمينية، 1 الصوديوم MEM البيروفات مم، 2 ملي L-الجلوتامين، 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل و 100 البنسلين يو / مل.
- تغطية الجزء السفلي من قذائف الهاون من قبل تعقيمها مع مرشحات معقمة.
- نقل عظام في الهاون وتغطيتها بطبقة من المرشحات من أجل تجميع سطح الاحتكاك.
- إعداد 50 أنبوب الصقر مل قدمت مع فلتر الصقر.
- سحق عظاممع مساعدة من مدقة حتى الحصول على تعليق خلية متجانسة.
- نقل تعليق في أنبوب.
- إضافة إلى 5 مل هاون متوسطة RPMI جديدة كاملة لغسل وحصاد الخلايا المتبقية.
- تكرار الماضي نقطتين حتى عظام المتجانس تظهر واضحة.
- نقل وتصفية في أنبوب جديد لتعليق الخلية من أجل القضاء على حطام الأنسجة المتبقية.
- منبذة الأنبوب في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق وإزالة بعناية وطاف بواسطة طموح. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه الخلية.
2. المظهري التحليل
- Resuspend وغسل خلايا من الفئران الفردية في 15 مل من برنامج تلفزيوني وFBS 2٪.
- منبذة الأنبوب في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق وإزالة بعناية وطاف بواسطة طموح. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه.
- تعليق بيليه في برنامج تلفزيوني 5 مل و 2٪ FBS وخلايا العد.
- نقل 1 × 10 6 خلية / جيدا في قاع الآبار 96 جولةلوحة.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- إعداد مزيج من MABS الموجهة ضد علامات سطح التالية. تخفف منها كما هو مبين في برنامج تلفزيوني، و 2٪ FBS إلى وصمة عار على الخلايا.
- CD4، CD8، CD3، CD45R، CD19، GR1، Ter119، NK1.1 مترافق إلى PE-Cy5 1:200
- ج كيت مترافق إلى APC 1:100
- يضاف إلى البيوتين 01:50 Sca1
- يضاف إلى FITC 1:50 CD34
- يضاف إلى 1:100 PE FcγR
- IL-7R مترافق إلى PE-Cy7 1:100
- تجاهل طاف وإضافة 50 ميكرولتر من مزيج MABS إلى كل بئر. فصل في الخلايا واحد من قبل pipetting.
- احتضان خلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام في 4 درجة مئوية.
- غسل الخلايا مرتين مع 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني و 2٪ FBS.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق والتخلص من طاف بواسطة لوحة للقلب.
- تمييع streptavidin في برنامج تلفزيوني، و 2٪ FBS كما هو مبين على وصمة عار على الخلايا.
- Streptavidin conjuبوابات إلى APC-Cy7 1:300
- إضافة 50 ميكرولتر من حل كل بئر. فصل في تعليق خلية واحدة بواسطة pipetting.
- احتضان خلايا لمدة 10 دقيقة في الظلام في 4 درجة مئوية.
- غسل الخلايا مرتين مع 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني و 2٪ FBS.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق والتخلص من طاف.
- Resuspend الخلايا في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وFBS 2٪.
- الحصول على العينات في نظام مراقبة الأصول الميدانية.
3. المغناطيسي التخصيب من خلايا + C-كيت
- يعد حل العازلة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.2، و 0.5٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، و 2 ملي EDTA.
- المخفف Resuspend الخلية بيليه من عظم كوسا المستمدة من الفئران لا يقل عن 10 في 1 مل من محلول يحتوي على عازلة C-كيت خريطة موقع مترافق إلى APC 01:50.
- احتضان خلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام في 4 درجة مئوية.
- غسل مرتين الخلايا مع 40 مل من محلول العازلة.
- منبذة الأنبوب في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق وإزالة بعناية تيانه طاف بواسطة طموح. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه.
- Resuspend خلية بيليه وإضافة 50 ميكرولتر المضادة للAPC MicroBeads لكل فأر الموت الرحيم مباشرة إلى بيليه.
- تخلط جيدا واحتضان لمدة 20 دقيقة في الظلام في 4 درجة مئوية.
- غسل الخلايا من خلال إضافة 40 مل من محلول العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. نضح طاف تماما.
- Resuspend خلية بيليه في العديد من 4 مل من محلول العازلة كل الفئران 3 الموت الرحيم.
- مكان MACS الأعمدة ليرة سورية في المجال المغناطيسي للفاصل MACS مناسب. استخدم 1 عمود كل الفئران 3 الموت الرحيم.
- تعد الأعمدة التي الشطف مع 4 مل من محلول العازلة.
- تطبيق تعليق على الخلية الأعمدة.
- جمع الخلايا غير المسماة التي تمر عبر ويغسل عمود مع 4 مل من محلول العازلة. تنفيذ خطوات الغسيل عن طريق إضافة 4 مل من محلول العازلة ثلاث مرات. إضافة العازلة الجديدة عندما يتم إفراغ الخزان عمود.
- إزالة الأعمدة من فاصل وPLACه كل واحد على أعلى من 15 أنابيب صقر مل.
- ماصة 4 مل من محلول عازلة على كل عمود. طرد فورا خارج الخلايا المسمى مغناطيسيا عن طريق دفع المكبس في العمود.
- منبذة الأنابيب في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق وإزالة بعناية وطاف بواسطة طموح.
- Resuspend كل بيليه مع 1 مل من حل العازلة وكريات مجموعة واحدة في 15 مل أنبوب صقر.
4. فرز من الخلايا الجذعية المكونة للدم والأسلاف الملتزم النسب
- إعداد مزيج من MABS الموجهة ضد علامات سطح التالية. تخفف منها كما هو مبين في 500 برنامج تلفزيوني ميكرولتر وFBS 2٪ لصبغ الخلايا.
- CD4، CD8، CD3، CD45R، CD19، GR1، Ter119، NK1.1 مترافق إلى PE-Cy5 1:200
- ج كيت مترافق إلى APC 1:100
- هيئة السلع التموينية-1 مترافق على البيوتين 01:50
- يضاف إلى FITC 1:50 CD34
- يضاف إلى 1:100 PE FcγR
- منبذة الأنبوب من previouق في 1500 دورة في الدقيقة القسم لمدة 5 دقائق وإزالة بعناية وطاف بواسطة طموح.
- إضافة مزيج MABS لبيليه. فصل في تعليق خلية واحدة بواسطة pipetting.
- احتضان خلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام في 4 درجة مئوية.
- غسل مرتين الخلايا مع 14mL من برنامج تلفزيوني وFBS 2٪.
- منبذة الأنبوب في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق والتخلص من طاف.
- تمييع streptavidin كما هو مبين في 500 برنامج تلفزيوني و 2٪ ميكرولتر FBS لصبغ الخلايا.
- Streptavidin مترافق إلى APC-Cy7 1:300
- إضافة حل للأنبوب. فصل في تعليق خلية واحدة بواسطة pipetting.
- احتضان خلايا لمدة 10 دقيقة في الظلام في 4 درجة مئوية.
- غسل مرتين الخلايا مع 14 مل من برنامج تلفزيوني و 2٪ FBS.
- منبذة الأنبوب في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق والتخلص من طاف.
- Resuspend الخلايا في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وFBS 2٪.
- نقل وتصفية تعليق الخلية في أنبوب جديد 5 مل من أجل ايليminate المجاميع الخلوية التي يمكن أن تتداخل مع إجراءات الفرز.
- إضافة 5 ميكرولتر من AAD-7 (استخدامه المخفف 1:100) الى تعليق خلية من أجل استبعاد 7-AAD + ميتا خلايا من السكان التي تم فرزها.
- نوع الخلايا مع FACSAria دينار بحريني وفقا لالظواهر التالية:
- خلايا LKS: لين - C-كيت + هيئة السلع التموينية-1 +
- LT-HSCs: LKS CD34 -
- ST-HSCs: LKS CD34 +
- GMPs: لين - C-كيت + هيئة السلع التموينية-1 FcγR ارتفاع منخفض CD34 +
- البرلمان الأوروبي: لين - C-كيت + هيئة السلع التموينية-1 FcγR منخفض منخفض CD34 -
- CMPS: لين - C-كيت + هيئة السلع التموينية-1 FcγR منخفض منخفض CD34 +
5. ممثل النتائج
ويوضح الشكل 1 ومثال على إجراء النابضة الالكترونية لدرجة الأسلاف اللمفاوية المشتركة (CLPs)، ولين - / ج كيت الصغرى / انترلوكين (ايل)-7R + الخلايا؛ لين - / ج كيت + / هيئة السلع التموينية-1 + (LKS)، ولين - / ج كيت + / هيئة السلع التموينية -1 الصغرى (C-كيت +) الخلايا، من طراز C-كيت بوابة +، ويتم تحديد الأسلاف النخاعي المشتركة (CMPS) كما لو خلايا FcγR + CD34، الأسلاف محببة / الوحيدات (GMPs) ومرحبا الخلايا FcγR + CD34 والنواء / ويتم تحديد من بوابة LKS، LT شهادة الثانوية العامة وشهادة الثانوية العامة، كما ST CD34 - CD34 + والخلايا، على التوالي؛ الخلايا - الأسلاف كرات الدم الحمراء (البرلمان الأوروبي) كما لو FcγR CD34. يمكن إثراء هذا خلية نخاع العظم لخلايا تعليق + C-كيت مع حبات المغناطيسي (الشكل 2)؛ LT-شهادة الثانوية العامة وشهادة الثانوية العامة ST-ومن ثم يمكن تصنيفها حسب CD34 التعبير، فضلا عن الأسلاف الأخرى وفقا لالنمط الظاهري هو موضح أعلاه.
ويمكن أن تكون آنا HSCs lyzed في التصوير المجهري المباشر مبائر كما هو مبين في الشكل (4)، حيث CD34 - تم صبغ الخلايا التي تحتوي على مركب النوكليوتيدات ملزم كيناكرين 11 وكذلك النووية الحمراء (DRAQ5). في HSCs، ولكن ليس GMPs، كيناكرين إيجابية حويصلات واضحة في ال 12 السيتوبلازم. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام HSCs فرزها في التجارب الفنية كما هو موضح في الشكل (5)، مما يدل على زيادة في الكالسيوم عصاري خلوي 2 + في HSC-LT بواسطة تنشيط مستقبلات P2 purinergic عند التعرض لثلاثي الفوسفات، الأدينوزين (ATP) وionomycin 12.
الشكل 1. الممثل تحليل مؤامرة نقطة من لين-BM الخلايا. ملطخة الالكترونية إجراء المعزولة في عداد الكريات تدفق لتحديد وتسجيل الأسلاف المكونة للدم وHSCs من نخاع العظم تعليق خلية كما هو موضح في نص البروتوكول.
pload/3736/3736fig2.jpg "/>
الشكل 2. خطة لتخصيب انتقائية من الخلايا + C-مجموعة من نخاع العظام.
الشكل 3 خلية تحليل دورة LKS إلكترونيا بوابات CD34 - HSCs في الاصحاء والفئران مع بنك التنمية بين الامريكتين ملطخة الضد-67 كي ودابي. تم إصلاح الخلايا وpermeabilized مع ليز / فيكس وبيرم مخازن تليها تلطيخ مع مترافق FITC كي 67 و دابي في 1 ميكروغرام / لتر. خلايا الدراجات هي إذا بالكاد في كل كشف في LKS CD34 - HSCs مقصورة من الاصحاء 12.
. الشكل 4 لايف التصوير المجهري متحد البؤر من FACS فرز CD34 - HSCs وGMPs ملطخة كيناكرين مركب النوكليوتيدات ملزمة وأحمر النووية (DRAQ5). الأرباع صغيرة تظهر كيناكرين نقاط البيعحويصلات مكنته الكشف في السيتوبلازم من HSCs لكن GMPs لا.
الشكل 5. عصاري خلوي كا 2 + الارتفاعات في HSCs فرز محملة Fura-2، وحفزت مع ATP وionomycin. وتظهر آثار من خلايا مفردة. وكانت جميع الخلايا تستجيب لاعبي التنس المحترفين خارج الخلية تظهر زيادة بارزة في كاليفورنيا عصاري خلوي 2 + بعد إضافة للاعبي التنس المحترفين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الموصوفة هنا يمكن تحليل سريع ودقيق من تكون الدم في الفئران الفردية (الشكل 1). هذا التحليل في إعدادات التجريبية المختلفة، بما في ذلك نماذج الفئران من الالتهاب، والمناعة الذاتية، نقص المناعة، والأمراض التنكسية، واضطرابات الأيض والسرطان، ويتيح معالجة آثار الحالات المرضية على تكون الدم. ويبين الشكل 3 تحليل للنشاط الدراجات خلية في LKS بوابات إلكترونية CD34 - خلايا من الفئران والجرذان صحية مع مرض التهاب الامعاء (البنك) 13 بواسطة تلطيخ مع كي 67-MAB ودابي. عرض الأخيرة زيادة كبيرة من الخلايا في S / G / 2 M مراحل دورة الخلية. هذا التحليل في التدفق الخلوي يوضح تأثير تي خلية بوساطة التهاب في نشاط ركوب الدراجات HSC 12.
مزيج من العلامات المغناطيسية وتخصيب خلايا نخاع العظام معربا عن C-كيت مع الخلية الفرز في تدفق cytometrذ يسمح عزل عالي النقاء الأسلاف النسب المكونة للدم وHSCs. ويمكن استخدام السكان الخلية التي تم الحصول عليها في عدد من فحوصات لدراسة بيولوجيا الخلية (الشكل 4)، نقل الإشارة (الشكل 5)، تنظيم التعبير الجيني وتنمويا في المختبر وكذلك في إمكانية الوظيفية المجراة من خلية فرعية متميزة. في الواقع، واستخدمت اليورانيوم مغناطيسيا C-كيت + الخلايا إلى المضيفين غير المشع تدبر بنجاح لدراسة التغير الديناميكي للنشاط الدراجات HSCs في حالة مستقرة والالتهابات 14. في أيدينا الإجراء الموضح هنا يسمح للانتعاش أكثر كفاءة وأسرع من خلايا نخاع العظام من عظم بيغ مع متوسط العائد من الخلايا LKS 200000 في الماوس. عدد قليل جدا من HSCs هادئة والتي يمكن عزلها من الكوسا العظام المجمعة من الفئران متعددة يشكل حدا لنهج التجريبية التي تتطلب المزيد من الخلايا. لتفادي إلى هذا الحد، في كثير من الحالات الأوليةلا يمكن أن يؤديها دراسات على المزيد من الخلايا LKS وفيرة للتفكير تحليلات أكثر تركيزا والتزاما التي يتعين القيام بها في CD34 - HSCs هادئة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر نوبويوكي Onai، تاكيزاوا هيتوشي ومانز ماركوس للحصول على المشورة الثمينة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل العلم السويسري مؤسسة وطنية، السويسري دوري السرطان وFondazione Ticinese في لوس انجليس من Ricerca Cancro سول.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 | |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| PenStrep | Gibco | 15070 | |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 | |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 | |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 | |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 | |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 | |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 | |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 | |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 | |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 | |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 | |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 | |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 | |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 | |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 | |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
- Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-161 (2004).
- Essers, M. A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, 904-908 (2009).
- Nagai, Y. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity. 24, 801-812 (2006).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, 1118-1129 (2008).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Lo Celso, C., Scadden, D., D, Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs. J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).
- Romanello, M. Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).
- Casati, A. Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).
- Bouma, G., Strober, W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).
- Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation. J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).
