Summary
Метод анализа распределения костного мозга гемопоэтических предшественников в проточной цитометрии, а также эффективно изолировать высокой степени очистки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) описывается. Изоляция процедуры по существу на основе магнитного обогащения с-Kit + клеток и сортировку, чтобы очистить ГСК на клеточных и молекулярных исследований.
Protocol
1. Подготовка суспензии клеток из костного мозга
- Усыпить мышью и поместить животное в кастрюле из нержавеющей и спрей 70% этанола на его животе и спине. Соберите бедра и голени от задних ног, и позвоночник.
- Аккуратно удалите все остатки мягких тканей позвоночника с острыми ножницами кончик и с ног костей с марлей. Магазин кости в 50 мл трубку Сокол с 30 мл RPMI среде, содержащей 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), дополненная 50 мкМ β-меркаптоэтанол, 100 мкМ MEM без незаменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия MEM, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг / мл стрептомицина и 100 ЕД / мл пенициллина.
- Покройте дно предварительно стерилизованный раствор стерильной фильтров.
- Передача кости в ступке и покрыть их слоем фильтры для того, чтобы собрать поверхности трения.
- Подготовьте 50 мл Сокол трубку с фильтром Сокол.
- Разбейте костис помощью пестика до получения однородной суспензии клеток.
- Передача суспензии в трубке.
- Добавить в раствор 5 мл свежей RPMI полной среды для мытья и уборки оставшихся клеток.
- Повторите два последних пункта до усредненного костей появляются ясно.
- Передача и фильтрации в новую пробирку клеточной суспензии для того, чтобы устранить оставшиеся обломки ткани.
- Центрифуга трубки при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и осторожно удалите супернатант аспирацией. Убедитесь в том, чтобы не потревожить осадок клеток.
2. Фенотипический анализ
- Ресуспендируйте и промыть клетки отдельных мышей в 15 мл PBS и 2% ЭТС.
- Центрифуга трубки при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и осторожно удалите супернатант аспирацией. Убедитесь в том, чтобы не нарушить гранул.
- Приостановить гранул в 5 мл PBS и 2% ЭТС и количество клеток.
- Передача 1 × 10 6 клеток / лунку в 96 лунок круглым дномпластину.
- Центрифуга пластине при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин.
- Подготовьте смесь моноклональных антител направлено против следующих маркеров поверхности. Развести их, как указано в PBS и 2% FBS для окрашивания клеток.
- CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 конъюгированных с PE-Cy5 1:200
- с-Kit сопряженных с APC 1:100
- СЦА1 конъюгированных с биотином 1:50
- CD34, конъюгированных с FITC 1:50
- FcγR конъюгированных с PE 1:100
- IL-7R сопряженных с PE-Cy7 1:100
- Удалите супернатант и внести по 50 мкл смеси моноклональных антител в каждую лунку. Распадаются на отдельные клетки с помощью пипетки.
- Инкубируйте клетки в течение 20 минут в темноте при 4 ° C.
- Промойте клетки в два раза с 150 мкл PBS и 2% ЭТС.
- Центрифуга пластине при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и отказаться от супернатант обращения пластины.
- Развести стрептавидином в PBS и 2% FBS, как показано на пятно клеток.
- Стрептавидин сопряжениезакрытого для APC-Cy7 1:300
- Добавить 50 мкл раствора в каждую лунку. Диссоциируют на суспензии отдельных клеток с помощью пипетки.
- Инкубируйте клетки в течение 10 мин в темноте при 4 ° C.
- Промойте клетки в два раза с 150 мкл PBS и 2% ЭТС.
- Центрифуга пластине при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и отказаться от супернатант.
- Ресуспендируйте клеток в 100 мкл PBS и 2% ЭТС.
- Получить образцы FACS.
3. Магнитное обогащение с-Kit + клетки
- Подготовить буфер раствор, содержащий PBS, рН 7,2, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 2 мМ ЭДТА.
- Ресуспендируйте осадок клеток костного кабачки, полученные, по меньшей мере 10 мышей в 1 мл раствора, содержащего буфер с-Kit МКА, конъюгированных с APC разбавляют 1:50.
- Инкубируйте клетки в течение 20 минут в темноте при 4 ° C.
- Мыть два раза клеток с 40 мл буферного раствора.
- Центрифуга трубки при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и осторожно удалите тОн супернатант аспирацией. Убедитесь в том, чтобы не нарушить гранул.
- Ресуспендируют осадок клеток и добавить 50 мкл против APC микрошарики для каждого эвтаназии мыши непосредственно в гранулы.
- Хорошо перемешайте и выдержите в течение 20 минут в темноте при 4 ° C.
- Вымойте клеток путем добавления 40 мл буферного раствора и центрифуги при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант полностью.
- Ресуспендируют осадок клеток в нескольких из 4 мл буферного раствора каждые три мыши эвтаназии.
- Место MACS LS столбцов в магнитное поле подходящей сепаратор MACS. Используйте 1 раз в три колонки мышей эвтаназии.
- Подготовить столбцов путем промывания 4 мл буферного раствора.
- Применение клеточной суспензии на столбцы.
- Соберите немеченого клеток, которые проходят через колонки и стирать с 4 мл буферного раствора. Выполните промывки путем добавления 4 мл буферного раствора в три раза. Добавить новый буфер, когда колонна водохранилища опустели.
- Удалить столбцы из сепаратора и НОАКэлектронной каждый один на 15 мл труб сокола.
- Внесите 4 мл буферного раствора на каждую колонку. Немедленно промыть магнитно меченых клеток, нажимая на поршень в колонну.
- Центрифуга труб при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и осторожно удалите супернатант аспирацией.
- Ресуспендируйте каждый шарик с 1 мл буферного раствора и группа гранул в одной трубки 15 мл сокола.
4. Сортировка гемопоэтических стволовых клеток и Lineage совершенных прародителей
- Подготовьте смесь моноклональных антител направлено против следующих маркеров поверхности. Развести их, как указано в 500 мкл PBS и 2% FBS для окрашивания клеток.
- CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 конъюгированных с PE-Cy5 1:200
- с-Kit сопряженных с APC 1:100
- ССС-1, конъюгированные с биотином 1:50
- CD34, конъюгированных с FITC 1:50
- FcγR конъюгированных с PE 1:100
- Центрифуга трубки от previouсекцией при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и осторожно удалите супернатант аспирацией.
- Добавьте смесь моноклональных антител к осадку. Диссоциируют на суспензии отдельных клеток с помощью пипетки.
- Инкубируйте клетки в течение 20 минут в темноте при 4 ° C.
- Мыть два раза клеток с 14 мл ФСБ и 2% ЭТС.
- Центрифуга трубки при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и отказаться от супернатант.
- Развести стрептавидин, как указано в 500 мкл PBS и 2% FBS окрасить клетки.
- Стрептавидин сопряженных с APC-Cy7 1:300
- Добавить решение к трубе. Диссоциируют на суспензии отдельных клеток с помощью пипетки.
- Инкубируйте клетки в течение 10 мин в темноте при 4 ° C.
- Мыть два раза клеток с 14 мл PBS и 2% ЭТС.
- Центрифуга трубки при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и отказаться от супернатант.
- Ресуспендируйте клеток в 500 мкл PBS и 2% ЭТС.
- Передача и фильтрации суспензии клеток в новом 5 мл трубку для того, чтобы Элиminate сотовых агрегатов, которые могут повлиять на процедуру сортировки.
- Добавьте 5 мкл 7-AAD (использовать разбавленный 1:100) к клеточной суспензии для того, чтобы исключить 7-AAD + мертвых клеток из отсортированных населения.
- Сортировка клеток с BD FACSAria в соответствии со следующими фенотипами:
- ЛКС клеток: Лин - с-Kit + SCA-1 +
- LT-ГСК: ЛКС CD34 -
- ST-ГСК: ЛКС CD34 +
- ГИП: Лин - с-Kit + ССС-1 низкий FcγR высокой CD34 +
- Депутаты Европарламента: Лин - с-Kit + ССС-1 низкий FcγR низкий CD34 -
- CMPS: Лин - с-Kit + ССС-1 низкий FcγR низкий CD34 +
5. Представитель Результаты
Рисунок 1 показывает и пример процедуры электронного стробирования дляоценка общей лимфоидных предшественников (CLPs), а Лин - / с-Kit вот / интерлейкин (IL)-7R + клеток Lin - / с-Kit + / SCA-1 + (ЛКС) и Лин - / с-Kit + / Sca -1 вот (с-Kit +) клетки, из с-Kit + ворота, общий миелоидных предшественников (CMPS) определены как FcγR вот CD34 + клеток, гранулоцитов / моноцитов предшественников (GMP), а FcγR привет CD34 + клеток и мегакариоцитов / эритроцитов предшественники (Европарламента), а вот FcγR CD34 - клеток, из ЛКС ворота, LT-HSC и ST-HSC определены как CD34 - и CD34 + клеток соответственно. Эта клетка костного мозга подвески может быть обогащен с-Kit + клетки с магнитными шариками (рис. 2), LT-HSC и ST-HSC может быть отсортирован по CD34 выражения, а также других предшественников по фенотипу, описанных выше.
ГСК может быть ана проанализированы в живых изображений конфокальной микроскопии, как показано на рисунке 4, где CD34 - клеток окрашивали нуклеотидов обязательной составной акрихин 11, а также ядерных красный (DRAQ5). В ГСК, но не ГМР, акрихин-положительных пузырьки видны в цитоплазме 12. Кроме того, отсортированных ГСК могут быть использованы в функциональных экспериментах, как показано на рисунке 5, которая показывает рост цитозольного Са 2 + в LT-HSC путем активации рецепторов пуринергическими Р2 при воздействии аденозин-трифосфата (АТФ) и иономицином 12.
Рисунок 1. Представитель точкой сюжета анализе Лин-БМ клеток. Электронные процедуры стробирования в проточной цитометрии для определения и забить кроветворные предшественники и ГСК из костного суспензии клеток костного мозга окрашивали, как описано в текст протокола.
pload/3736/3736fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Схема для селективного обогащения с-Kit + клеток из костного мозга.
Рисунок 3 клеточного цикла анализа электронных закрытого ЛКС CD34 -. ГСК у здоровых людей и мышей с IBD окрашивали Ki-67 и антител DAPI. Клетки были установлены и проницаемыми с лизировать / Fix и Пермского буферов последующим окрашиванием с FITC сопряженных Ki-67 и DAPI на 1 мкг / мл. Велоспорт клетки едва ли вообще обнаружить в ЛКС CD34 - ГСК отделении здоровых 12.
Рис. 4 Живи изображений конфокальной микроскопии СУИМ отсортированы CD34 - ГСК и ГИП окрашивали нуклеотидов обязательным акрихин соединения и ядерной красный (DRAQ5). Небольшой квадранта показывают акрихин возтельным пузырьки обнаруживаются в цитоплазме ГСК, но не ГМР.
Рисунок 5. Цитозольного Са 2 + высот в отсортированном ГСК загружены Фура-2 и стимулированной АТФ и иономицином. Следы от одной клетки показано на рисунке. Все клетки реагируют на внеклеточные АТФ показывает резкое увеличение цитозольного Са 2 + после добавления АТФ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь метод позволяет быстро и точного анализа кроветворения в отдельных мышей (рис. 1). Этот анализ в различных экспериментальных условиях, в том числе мышиных моделях воспаления, аутоиммунные заболевания, иммунодефицит, дегенеративные заболевания, нарушения обмена веществ и рака, позволяет ликвидации последствий патологических состояний на кроветворение. Рисунок 3 показывает анализ активности клеток велоспорту на электронном закрытого ЛКС CD34 - клеток от здоровых мышей и мышей с воспалительным заболеванием кишечника (ВБК) 13 окрашиванием Ki-67 МАБ и DAPI. Последний показал значительное увеличение клеток в S / G 2 / M фазах клеточного цикла. Этот анализ в проточной цитометрии демонстрирует воздействие опосредованное воспаление T ячейки HSC деятельность езда на велосипеде 12.
Сочетание магнитного маркировки и обогащение клеток костного мозга выражения с-Kit с клеточной сортировки в потоке cytometrу позволяет изоляции высокоочищенных гемопоэтических предшественников линии и ГСК. Полученные клеточных популяций могут быть использованы в ряде тестов для изучения клеточной биологии (рис. 4), передача сигнала (рис. 5), умственно регулировать экспрессию генов и в пробирке, а также в естественных функциональных возможностей различных подмножеств клеток. Действительно, магнитно обогащенный с-Kit + клетки были использованы для успешно прижился необлученных узлов для изучения динамических изменений активности велосипедные ГСК в стационарном состоянии и воспаления 14. В наших руках процедура, описанная здесь, позволяет более эффективно и более быстрому восстановлению клеток костного мозга, чем кости промывки при средней урожайности 200000 ЛКС клеток на мышь. Очень небольшое количество покоя ГСК, которые могут быть изолированы от объединенных костей кабачки нескольких мышей является пределом для экспериментальных подходов, требующих более клеток. Для устранения этого ограничения, во многих случаях предварительноеисследования могут быть выполнены на более обильные клеток ЛКС предусмотреть более целенаправленной и пунктуальный анализы должны быть выполнены в CD34 - покоя ГСК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Нобуюки Onai, Хитоси Такизава и Маркус Манц за ценные советы. Эта работа финансировалась Швейцарский национальный научный фонд, Швейцарская лига рака и Фондом Ticinese в ла суль RIcerca Cancro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 | |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| PenStrep | Gibco | 15070 | |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 | |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 | |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 | |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 | |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 | |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 | |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 | |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 | |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 | |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 | |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 | |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 | |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 | |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 | |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
- Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-161 (2004).
- Essers, M. A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, 904-908 (2009).
- Nagai, Y. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity. 24, 801-812 (2006).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, 1118-1129 (2008).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Lo Celso, C., Scadden, D., D, Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs. J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).
- Romanello, M. Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).
- Casati, A. Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).
- Bouma, G., Strober, W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).
- Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation. J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).
