Summary
प्रवाह cytometry में अस्थि मज्जा hematopoietic progenitors के वितरण के रूप में अच्छी तरह से कुशलतापूर्वक अलग उच्च शुद्ध hematopoietic स्टेम सेल (HSCs) का विश्लेषण विधि वर्णित है. अलगाव की प्रक्रिया अनिवार्य रूप से सी किट + कोशिकाओं और सेल के लिए आणविक और सेलुलर अध्ययन के लिए HSCs शुद्ध छँटाई के चुंबकीय संवर्धन पर आधारित है.
Protocol
1. सेल सस्पेंशन की अस्थि मज्जा से तैयारी
- इस माउस Euthanize पशु और एक स्टेनलेस और अपने पेट और पीठ पर स्प्रे 70% इथेनॉल पैन में जगह है. जांध की हड्डी और टिबिअ, पिछले पैरों से और स्पाइनल कॉलम लीजिए.
- सही स्पाइनल कॉलम से एक तेज टिप कैंची के साथ और धुंध साथ पैर की हड्डियों से सभी नरम ऊतक अवशेषों को हटाने. एक 50 एमएल फाल्कन ट्यूब में RPMI मध्यम युक्त 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम, 50 माइक्रोन β mercaptoethanol, 100 माइक्रोन सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड के साथ पूरक, 1 मिमी सदस्य सोडियम पाइरूवेट, 2 के 30 एमएल के साथ हड्डियों स्टोर एल glutamine मिमी, 100 μg / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन और 100 यू / मिलीलीटर पेनिसिलिन.
- बाँझ फिल्टर के साथ एक पहले से निष्फल मोर्टार के नीचे कवर.
- मोर्टार में हड्डियों स्थानांतरण और उन्हें फिल्टर की एक परत के साथ कवर के क्रम में एक घर्षण सतह को इकट्ठा.
- 50 एमएल फाल्कन फाल्कन फिल्टर के साथ प्रदान की ट्यूब तैयार.
- हड्डियों लूटएक सजातीय सेल निलंबन प्राप्त करने से जब तक एक पैर की मदद से.
- ट्यूब में निलंबन स्थानांतरण.
- शेष कोशिकाओं को धोने और फसल ताजा RPMI पूरा मध्यम मोर्टार 5 एमएल जोड़ें.
- दोहराएँ पिछले दो अंकों तक homogenized हड्डियों स्पष्ट दिखाई देते हैं.
- स्थानांतरण और एक नया ट्यूब में फिल्टर सेल निलंबन आदेश में शेष ऊतक मलबे को समाप्त.
- 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और ध्यान से आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला हटाने. सुनिश्चित करें कि सेल गोली परेशान नहीं.
2. प्ररूपी विश्लेषण
- Resuspend और पीबीएस और 2% FBS की 15 एमएल में व्यक्तिगत चूहों की कोशिकाओं को धो लो.
- 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और ध्यान से आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला हटाने. सुनिश्चित करें कि गोली को परेशान नहीं.
- 5 एमएल पीबीएस और 2% FBS और गिनती कोशिकाओं में गोली निलंबित.
- 1 स्थानांतरण × 10 6 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक 96 कुओं दौर नीचे मेंथाली.
- 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर थाली अपकेंद्रित्र.
- निम्नलिखित सतह मार्कर के खिलाफ निर्देशित Mabs का एक मिश्रण तैयार करें. उन्हें पतला के रूप में पीबीएस में संकेत दिया और 2% FBS कोशिकाओं दाग.
- सीडी 4, सीडी 8, CD3, CD45R, CD19, GR1, Ter119, NK1.1 1:200 पीई - Cy5 संयुग्मित
- सी किट 1:100 APC संयुग्मित
- Sca1 1:50 बायोटिन संयुग्मित
- CD34 1:50 FITC संयुग्मित
- का संयुग्मित FcγR पीई 1:100 के लिए
- आईएल 7R 1:100 पीई - Cy7 संयुग्मित
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एक अच्छी तरह Mabs मिश्रण के 50 μL जोड़ने. Pipetting द्वारा एकल कक्षों में अलग कर देना.
- अंधेरे में 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं
- पीबीएस के 150 μL और FBS 2% के साथ कोशिकाओं को दो बार धो.
- अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर थाली और inverting थाली से सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- पीबीएस में streptavidin पतला FBS और 2% के रूप में कोशिकाओं दाग संकेत दिया.
- Streptavidin conju1:300 APC - Cy7 के लिए gated
- प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए समाधान के 50 μL जोड़ें. Pipetting द्वारा एकल कक्ष निलंबन में अलग कर देना.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में कोशिकाओं को सेते हैं
- पीबीएस के 150 μL और FBS 2% के साथ कोशिकाओं को दो बार धो.
- 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर थाली अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- पीबीएस और 2% FBS 100 μL में कोशिकाओं Resuspend.
- FACS पर नमूने मोल.
3. सी किट + कोशिकाओं की चुंबकीय संवर्धन
- एक बफर PBS, 7.2 पीएच 0.5% गोजातीय सीरम albumin (BSA), और 2 मिमी EDTA के समाधान युक्त तैयार.
- Marrows हड्डी सेल गोली बफर सी किट APC संयुग्मित मैब युक्त समाधान के 1 एमएल में कम से कम 10 चूहों से प्राप्त Resuspend 01:50 पतला.
- अंधेरे में 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं
- बफर समाधान के 40 एमएल के साथ दो कक्षों बार धो लें.
- 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और ध्यान हटाने के टीवह आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला. सुनिश्चित करें कि गोली को परेशान नहीं.
- Resuspend सेल गोली और प्रत्येक euthanized माउस के लिए का विरोधी APC microbeads की 50 μl सीधे जोड़ने गोली.
- अच्छी तरह मिक्स और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं
- बफर समाधान और अपकेंद्रित्र के 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर 40 एमएल जोड़कर कोशिकाओं से धो लें. पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन).
- हर तीन चूहों euthanized बफर समाधान की 4 एमएल के कई में resuspend सेल गोली.
- एक उपयुक्त एमएसीएस विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में जगह रास कॉलम एमएसीएस. 1 हर तीन चूहों euthanized स्तंभ का उपयोग करें.
- बफर समाधान के 4 एमएल के साथ rinsing द्वारा तैयार कॉलम.
- सेल निलंबन स्तंभों पर लागू करें.
- Unlabeled कोशिकाओं है कि के माध्यम से गुजरती हैं और बफर समाधान की 4 एमएल के साथ स्तंभ धो लीजिए. बफर समाधान की 4 एमएल तीन बार जोड़कर धोने चरणों का पालन करें. जोड़ें नई बफर जब स्तंभ जलाशय खाली कर दिया है.
- विभाजक और plac से स्तंभ निकालेंई 15 एमएल बाज़ ट्यूबों के शीर्ष पर हर एक.
- विंदुक प्रत्येक स्तंभ पर 4 बफर समाधान के एमएल. तुरंत बाहर स्तंभ में सवार धक्का द्वारा चुंबकीय लेबल की कोशिकाओं फ्लश.
- 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र और ध्यान से आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला हटाने.
- बफर समाधान और एक एकल 15 एमएल बाज़ ट्यूब में समूह छर्रों का 1 एमएल के साथ प्रत्येक गोली Resuspend.
4. Hematopoietic स्टेम सेल और वंश प्रतिबद्ध progenitors की छंटनी
- निम्नलिखित सतह मार्कर के खिलाफ निर्देशित Mabs का एक मिश्रण तैयार करें. उन्हें पतला के रूप में 500 μL पीबीएस और 2% FBS में संकेत करने के लिए कोशिकाओं दाग.
- सीडी 4, सीडी 8, CD3, CD45R, CD19, GR1, Ter119, NK1.1 1:200 पीई - Cy5 संयुग्मित
- सी किट 1:100 APC संयुग्मित
- Sca 1 1:50 बायोटिन संयुग्मित
- CD34 1:50 FITC संयुग्मित
- का संयुग्मित FcγR पीई 1:100 के लिए
- पिछले से अपकेंद्रित्र ट्यूब5 मिनट के लिए 1500 rpm पर अनुभाग और ध्यान से आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला हटाने.
- गोली के Mabs मिश्रण जोड़ें. Pipetting द्वारा एकल कक्ष निलंबन में अलग कर देना.
- अंधेरे में 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं
- पीबीएस की के 14mL और 2% FBS के साथ दो कक्षों बार धो लें.
- 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- Streptavidin पतला के रूप में 500 μL पीबीएस में संकेत दिया और 2% FBS कोशिकाओं दाग.
- 1:300 APC - Cy7 संयुग्मित streptavidin
- ट्यूब का हल जोड़ें. Pipetting द्वारा एकल कक्ष निलंबन में अलग कर देना.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में कोशिकाओं को सेते हैं
- पीबीएस के 14 एमएल और FBS 2% के साथ दो कक्षों बार धो लें.
- 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- पीबीएस और 2% FBS 500 μL में कोशिकाओं Resuspend.
- स्थानांतरण और एक नया 5 एमएल ट्यूब के सेल निलंबन फ़िल्टर आदेश में एलीसेलुलर समुच्चय minate कि सॉर्टिंग प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.
- सेल निलंबन 7 AAD 5 μL इसका इस्तेमाल 1:100 पतला जोड़ें क्रम में हल आबादी से 7 AAD + मृत कोशिकाओं को बाहर.
- एक बी.डी. FACSAria के साथ निम्नलिखित phenotypes के अनुसार क्रमबद्ध करें कोशिकाओं:
- LKS कोशिकाओं: लिन - सी किट + Sca - 1 +
- LT-HSCs: CD34 LKS
- ST-HSCs: LKS CD34 +
- GMPs: लिन - सी किट उच्च Sca-1 कम FcγR CD34 +
- MEPs के लिन - सी किट + Sca 1 कम FcγR कम CD34
- CMPs: लिन - सी किट + Sca-1 कम FcγR कम CD34 +
5. प्रतिनिधि परिणाम
1 से पता चलता है और इलेक्ट्रॉनिक gating प्रक्रिया के उदाहरण के लिए चित्रास्कोर लिन के रूप में आम lymphoid (CLPs) progenitors / सी किट लो / इंटरल्यूकिन (आईएल) 7R कोशिकाओं, लिन / सी किट + / Sca-1 (LKS) और लिन + / सी किट + / Sca -1 लो (सी किट +) कोशिकाओं, सी किट + गेट से आम माइलॉयड progenitors (CMPs) FcγR लो CD34 + कोशिकाओं, FcγR हाय CD34 + कोशिकाओं और / महामूललोहितकोशिका के रूप में granulocyte / एककेंद्रकश्वेतकोशिका progenitors (GMPs) के रूप में पहचाने जाते हैं लो FcγR CD34 के रूप में एरिथ्रोसाइट (MEPs) progenitors कोशिकाओं LKS गेट, LT-HSC और अनुसूचित जनजाति HSC से CD34 के रूप में पहचान कर रहे हैं - और CD34 + कोशिकाओं, क्रमशः. यह अस्थि मज्जा सेल निलंबन चुंबकीय मोती छवि (2) के साथ सी किट + कोशिकाओं के लिए समृद्ध किया जा सकता है, LT-HSC और अनुसूचित जनजाति HSC फिर CD34 अभिव्यक्ति के रूप में अच्छी तरह से अन्य progenitors के अनुसार ऊपर वर्णित phenotype के अनुसार हल किया जा सकता है.
HSCs एना हो सकता है रहते इमेजिंग confocal माइक्रोस्कोपी में lyzed चित्रा 4, जहां CD34 के रूप में दिखाया गया - कोशिकाओं nucleotide बाध्यकारी यौगिक 11 quinacrine के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परमाणु लाल (DRAQ5) के साथ दाग रहे थे. HSCs में लेकिन GMPs नहीं है, quinacrine पॉजिटिव vesicles के cytoplasm के 12 में दिखाई दे रहे हैं. इसके अलावा, हल HSCs कार्यात्मक प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में 5 आंकड़ा है, जो जोखिम पर purinergic p2 के रिसेप्टर्स की सक्रियण द्वारा साइटोसोलिक CA में 2 + LT-HSC में वृद्धि दर्शाता है में प्रदर्शन (एटीपी) एक यौगिक जो न्यूक्लिइक अम्ल से प्राप्त होता है जो शर्करा तथा एडीनाइन से बना होता है, डी - राइबोज triphosphate और 12 ionomycin.
चित्रा 1 लिन बी.एम. कोशिकाओं की प्रतिनिधि डॉट साजिश विश्लेषण. प्रवाह की पहचान और hematopoietic progenitors और HSCs अस्थि मज्जा सेल निलंबन से स्कोर कोशिकामापी पर इलेक्ट्रॉनिक gating प्रक्रिया दाग प्रोटोकॉल पाठ में वर्णित के रूप में.
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आंकड़ा 2. सी किट अस्थि मज्जा से + कोशिकाओं के चयनात्मक संवर्धन के लिए एक योजना है.
चित्रा 3 सेल इलेक्ट्रॉनिक gated CD34 LKS का चक्र विश्लेषण स्वस्थ नियंत्रण और IBD के साथ चूहों की 67 एंटीबॉडी और DAPI के साथ दाग में HSCs. कोशिकाओं तय किया गया और के साथ permeabilized / Lyse फिक्स और μg 1 / एमएल FITC की में संयुग्मित 67 और DAPI के साथ धुंधला के बाद buffers के पेर्म. साइकिल कोशिकाओं मुश्किल से CD34 LKS में सभी detectable अगर स्वस्थ 12 नियंत्रण के HSCs डिब्बे.
. HSCs और GMPs के परिसर nucleotide बाध्यकारी quinacrine और परमाणु लाल (DRAQ5) के साथ दाग - चित्रा 4 CD34 हल FACS confocal माइक्रोस्कोपी इमेजिंग जीते. छोटे quadrants quinacrine स्थिति दिखाने केitive vesicles HSCs की cytoplasm में पाया लेकिन GMPs नहीं.
चित्रा 5 साइटोसोलिक सीए 2 + हल Fura-2 के साथ भरी हुई है और एटीपी और ionomycin के साथ प्रेरित HSCs में उन्नयन. एकल कक्षों से निशान दिखाए जाते हैं. सभी कोशिकाओं कोशिकी एटीपी के बाद इसके अलावा साइटोसोलिक CA में 2 प्रमुख वृद्धि दिखा एटीपी के लिए उत्तरदायी थे.
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Discussion
यहां वर्णित विधि व्यक्तिगत चूहों (चित्रा 1) में hematopoiesis की तेजी से और सटीक विश्लेषण में सक्षम बनाता है. सूजन की murine मॉडल, स्वरोगक्षमता, इम्यूनो, अपक्षयी रोगों, चयापचय संबंधी विकार और कैंसर सहित विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग, में यह विश्लेषण hematopoiesis पर रोग की स्थिति के प्रभाव को संबोधित करने की अनुमति देता है चित्रा 3 इलेक्ट्रॉनिक gated LKS पर सेल साइकिल गतिविधि के विश्लेषण से पता चलता है. CD34 स्वस्थ चूहों और सूजन आंत्र रोग 13 (IBD) के साथ चूहों से कोशिकाओं की 67 मैब और DAPI के साथ धुंधला. बाद कोशिका चक्र के एस / जी / 2 एम चरणों में कोशिकाओं की एक उल्लेखनीय वृद्धि का प्रदर्शन किया. प्रवाह cytometry में यह विश्लेषण HSC साइकिल चालन के 12 गतिविधि पर टी सेल की मध्यस्थता सूजन के प्रभाव को दर्शाता है.
चुंबकीय लेबलिंग और अस्थि मज्जा की कोशिकाओं का संवर्धन सेल के साथ सी किट व्यक्त की संयोजन प्रवाह cytometr में छँटाईy अत्यधिक hematopoietic वंश progenitors और HSCs शुद्ध अलगाव की अनुमति देता है. प्राप्त सेल आबादी assays की एक संख्या में इस्तेमाल किया जा सकता है और कोशिका जीव विज्ञान (चित्रा 4), संकेत पारगमन (चित्रा 5), developmentally विनियमित जीन अभिव्यक्ति और के रूप में अच्छी तरह के रूप में अलग सेल सबसेट के कार्यात्मक संभावित vivo में इन विट्रो अध्ययन. वास्तव में, चुंबकीय समृद्ध सी किट + कोशिकाओं सफलतापूर्वक पैवंद करना गैर विकिरणित मेजबान के स्थिर राज्य और 14 सूजन में HSCs साइकिल गतिविधि के गतिशील परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया. हमारे हाथ में यहां वर्णित प्रक्रिया 200,000 माउस प्रति LKS कोशिकाओं के एक औसत उपज के साथ निस्तब्धता हड्डी से अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के अधिक कुशल और तेजी से वसूली की अनुमति देता है. मौन HSCs है कि जमा एकाधिक चूहों की हड्डी marrows से अलग किया जा सकता है की बहुत छोटी संख्या अधिक कक्षों की आवश्यकता प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के लिए एक सीमा का गठन किया है. कई प्रारंभिक मामलों में इस सीमा के लिए, निराकरणअध्ययन अधिक प्रचुर मात्रा में LKS कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया जा सकता है के लिए और अधिक ध्यान केंद्रित और समयनिष्ठ CD34 में प्रदर्शन किया जा विश्लेषण की परिकल्पना मौन HSCs.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम Nobuyuki Onai, हितोशी Takizawa और Markus Manz कीमती सलाह के लिए धन्यवाद. यह काम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, स्विस कैंसर लीग और Fondazione Ticinese प्रति ला RIcerca के sul Cancro के द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 | |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| PenStrep | Gibco | 15070 | |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 | |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 | |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 | |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 | |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 | |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 | |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 | |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 | |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 | |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 | |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 | |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 | |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 | |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 | |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
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