Summary
フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit +細胞と細胞および分子研究のための造血幹細胞を精製するために細胞選別の磁気濃縮に基づいています。
Abstract
骨髄は、造血幹細胞とより成熟した血液細胞系列の前駆細胞が存在すると成人生体内で分化する主要なサイトです。造血幹細胞は、生命時間1のすべての血液細胞系列を生成することができる多能性細胞の分細胞集団を構成しています。骨髄中の造血幹細胞恒常性の分子解剖は、造血、腫瘍学、再生医療において重要な意味を持っています。我々は個々のマウス（ 図1）造血前駆細胞サブセットと造血幹細胞の分布を獲得するためにフローサイトメトリーで蛍光抗体、電子ゲートの手順でラベルプロトコルを記述します。加えて、我々は広範囲に造血前駆細胞と同様に長期的（LT）およびc-Kitを発現する細胞の磁気濃縮によりプールされた骨髄細胞懸濁液から造血幹細胞を再構成する短期（ST）を豊かにする方法について説明します。得られた細胞調製物は、in vitroで選択したサブセットをソートするために使用することができ、生体機能研究である（ 図2）。
両方の海綿骨芽細胞2,3と類 洞内皮4は、骨髄中の造血幹細胞をサポートする機能的なニッチを構成しています。そのリガンドであるアンジオポエチン-1 5とN-カドヘリン+骨芽細胞3とHSCで発現する受容体チロシンキナーゼTie2の相互作用のサブセットを含む、骨芽細胞ニッチのいくつかのメカニズムは、造血幹細胞の休止を決定する際に同意する。骨髄中の"休止状態"は、レプリケーションや過度のサイクリング活動の6時の最終的な疲労から造血幹細胞を保護するために重要である。そのようなToll様受容体リガンドとしての自然免疫系の細胞7、インターフェロン-α6に作用する外因性の刺激はまた系統コミットされた前駆細胞に造血幹細胞の増殖と分化を誘導することができる。最近では、LIN内で休眠中のマウスの造血幹細胞の集団-のc-Kit + Sca-1は+ CD150 + CD48 - CD34 -人口が8に記載されています。ここで説明したように造血前駆細胞に富む細胞懸濁液からCD34の発現に基づいてセルの並べ替えは、静止自己再生LT-HSCとST-HSCの9の両方の分離を可能にします。系統陽性細胞の枯渇とCD48とFlk2抗体とLT-HSCのソートに基づいて同様の手順では、以前に10に記載されている。本報告では、表現型の特性と異なる生理学的および病理学的条件下で造血を監視するために有用である造血前駆細胞のex vivoでの細胞周期解析のためのプロトコルを提供しています。さらに、細胞生物学、シグナル伝達アッセイと同様に移植のために彼らの自己再生、拡大と分化を制御する要因とメカニズムを定義するために使用することができ造血幹細胞、の手順をソートFACSを説明します。
Protocol
1。骨髄からの細胞懸濁液の調製
- マウスを安楽死させると、その腹部と背面にステンレスパンとスプレー70％エタノール中に動物を配置します。後ろ足、と脊柱からの大腿骨と脛骨を収集します。
- 正確に鋭い先端をハサミでとガーゼで足の骨から脊柱からすべての軟組織の残留物を除去する。 50μMβ-メルカプトエタノールを添加した10％の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI培地30mLを、100μMのMEM非必須アミノ酸、1 mMのMEMピルビン酸ナトリウム、2 50mLのファルコンチューブに店の骨mM L-グルタミン、100μg/ mlのストレプトマイシン、100 U / mlペニシリン。
- 滅菌フィルターで予め滅菌乳鉢の底をカバーしています。
- モルタルに骨を移し、摩擦面を組み立てるために、フィルターの層でそれらをカバーしています。
- ファルコンフィルタが設けられた50mLのファルコンチューブを準備します。
- 骨を砕く均一な細胞懸濁液が得られるまで乳棒の助けを借りて。
- チューブに懸濁液を移す。
- 残りの細胞を洗浄し、収穫する新鮮なRPMI完全培地中のモルタル5mLに追加します。
- 均質化された骨が明らかに表示されるまで、最後の2点を繰り返します。
- 残りの組織片を除去するために細胞懸濁液を移し、新しいチューブにフィルタリングします。
- 5分間1,500 rpmでチューブを遠心分離し、慎重に吸引して上清を除去します。細胞ペレットを乱さないようにしてください。
2。表現型分析
- PBS、2％FBS 15mLに個々のマウスの細胞を再懸濁し、洗浄してください。
- 5分間1,500 rpmでチューブを遠心分離し、慎重に吸引して上清を除去します。ペレットを乱さないことを確認してください。
- 5 mLのPBS、2％FBSおよびcount細胞のペレットを一時停止します。
- 転送1×10 6細胞/ウェル、96ウェル丸底でプレート。
- 5分間1,500 rpmでプレートを遠心分離します。
- 以下の表面マーカーに対するモノクローナル抗体のミックスを調製する。それらの細胞を染色するためにPBS、2％FBSに示されている希釈します。
- PE-Cy5で1:200に結合したCD4、CD8、CD3、CD45R、CD19、GR1、TER119、NK1.1
- APC 1:100に結合したc-Kitの
- ビオチン1:50〜共役SCA1
- FITC 1:50〜共役CD34
- PE 1:100に結合したFcγRと
- PE-Cy7 1:100に結合したIL-7R
- 上清を捨て、各ウェルにモノクローナル抗体ミックス50μLを追加します。ピペッティングにより単一細胞に解離する。
- 4℃で暗所で20分間細胞をインキュベート
- PBS150μLの2％FBSで細胞を2回洗浄します。
- 5分間1500rpmでプレートを遠心分離し、反転板により上清を捨てる。
- PBS中でストレプトアビジンを希釈し、2％FBSは、細胞を染色することが示された。
- ストレプトアビジンコンジュAPC-Cy7 1:300にゲート
- 各ウェルに溶液50μLを追加します。ピペッティングによって単一細胞懸濁液に解離する。
- 4℃で暗所で10分間細胞をインキュベート
- PBS150μLの2％FBSで細胞を2回洗浄します。
- 5分間1,500 rpmでプレートを遠心し、上清を捨てる。
- PBS、2％FBSを100μLに細胞を再懸濁します。
- FACSでサンプルを取得します。
3。のc-Kit +細胞の磁気濃縮
- PBS、pHは7.2、（BSA）0.5％ウシ血清アルブミン、および2mM EDTAを含む緩衝液を準備します。
- 骨の細胞ペレットを再懸濁し1:50に希釈し、APCに結合したc-KitのmAbを含む緩衝液1mLに少なくとも10匹のマウスから派生した髄。
- 4℃で暗所で20分間細胞をインキュベート
- 緩衝液40mLで2回細胞を洗浄します。
- 5分間1,500 rpmでチューブを遠心分離し、慎重にtを削除する彼は、吸引によって上清。ペレットを乱さないことを確認してください。
- 再懸濁し、細胞ペレットとペレットに直接各安楽死させたマウスの抗APC MicroBeadsは50μlを加える。
- よく混ぜ、4℃で暗所で20分間インキュベート
- 5分間1,500 rpmで緩衝液、遠心分離を40 mLを加えることにより細胞を洗浄します。完全に上清を吸引除去する。
- 緩衝液4 mLの安楽死させたすべての3匹のマウスの複数の再懸濁し、細胞ペレット。
- 適当なのMACS Separatorの磁場内の場所MACS LSカラム。すべての3匹安楽死させた1列を使用しています。
- 緩衝液4 mLで洗浄してカラムを準備します。
- カラムに細胞懸濁液を適用します。
- を通過し、緩衝液4 mLでカラムを洗浄し非標識の細胞を収集します。緩衝液4 mLの三回を追加することによって、洗濯の手順を実行します。カラムのリザーバーが空にされた新しいバッファを追加します。
- セパレータとPLACから列を削除します。電子15mlファルコンチューブの上に各1。
- 各カラムに緩衝液をピペットで4mlの。すぐに列にプランジャーを押すことにより、磁気標識された細胞を洗い流す。
- 5分間1,500 rpmでチューブを遠心し、注意深く吸引により上清を除去します。
- シングル15mlファルコンチューブに緩衝液およびグループのペレットを1 mLの各ペレットを再懸濁します。
4。造血幹細胞およびリネージュコミットされた前駆細胞の選別
- 以下の表面マーカーに対するモノクローナル抗体のミックスを調製する。それらの細胞を染色するために500μLのPBS、2％FBSに示されている希釈します。
- PE-Cy5で1:200に結合したCD4、CD8、CD3、CD45R、CD19、GR1、TER119、NK1.1
- APC 1:100に結合したc-Kitの
- ビオチン1:50〜Sca-1は共役
- FITC 1:50〜共役CD34
- PE 1:100に結合したFcγRと
- 先行するからチューブを遠心sは5分間1500 rpmでセクションを注意深く吸引して上清を除去します。
- ペレットにモノクローナル抗体ミックスを追加します。ピペッティングによって単一細胞懸濁液に解離する。
- 4℃で暗所で20分間細胞をインキュベート
- PBS、2％FBSの14mLで2回細胞を洗浄します。
- 5分間1,500 rpmでチューブを遠心し、上清を捨てる。
- ストレプトアビジンなどの細胞を染色するために500μLのPBS、2％FBSに示されている希釈します。
- APC-Cy7 1:300に結合したストレプトアビジン
- チューブへの解決策を追加します。ピペッティングによって単一細胞懸濁液に解離する。
- 4℃で暗所で10分間細胞をインキュベート
- PBS 14 mLおよび2％FBSで2回細胞を洗浄します。
- 5分間1,500 rpmでチューブを遠心し、上清を捨てる。
- PBS、2％FBSを500μLに細胞を再懸濁します。
- イーライするために、新しい5 mlチューブに細胞懸濁液を移し、フィルタリングソート手順を妨げる可能性の細胞凝集体をminate。
- ソートされた集団から7-AAD +死細胞を除外するために、細胞懸濁液に7-AADの5μL（それは1:100に希釈し使用）を追加します。
- 以下の表現型に基づいてBD FACSAriaでソート細胞：
- LKS細胞：LIN -のc-Kit + Sca-1は+
- LT-造血幹細胞：LKS CD34 -
- ST-造血幹細胞：CD34 + LKS
- GMPに：LIN -のc-Kit + Sca-1は低 FcγRと高い CD34 +
- 欧州議会：LIN -のc-Kit + Sca-1は低 FcγRと低い CD34 -
- のCMP：LIN - CD34のc-Kit + Sca-1は低 FcγRと低い+
5。代表的な結果
1に示すように、電子ゲー手順の例を図スコアリンなどの一般的なリンパ球前駆細胞（CLPの） - / c-KitのLO /インターロイキン（IL）-7R +細胞;林- / c-Kitの+ / SCA-1 +（LKS）とリン- / c-Kitの+ / SCA -1 LO（のc-Kit +）細胞は、c-Kitの+ゲートから、共通の骨髄前駆細胞（CMPの）はFcγRとLO CD34 +細胞は、FcγRとハイ CD34 +細胞および/ 巨核球などの顆粒球/単球前駆細胞（GMPに）として識別されます。 FcγRとLO CD34などの赤血球前駆細胞（MEPS） -細胞; -それぞれとCD34 +細胞、LKSゲート、LT-HSCとST-HSCからCD34として同定されています。その後、上記の表現型に基づいてCD34の発現だけでなく、他の前駆細胞に応じて並べ替えることができLT-HSCとST-HSC、この骨髄細胞懸濁液を磁気ビーズ（ 図2）のc-Kit +細胞を濃縮することができます。
HSCはANAになります 図4に示すように、ライブイメージング共焦点顕微鏡で溶菌ここで、CD34 -細胞はヌクレオチド結合化合物キナクリン11と同様に核赤（DRAQ5）で染色した。造血幹細胞ではなく、GMPには、キナクリン陽性小胞は細胞質12に表示されます。 + LT-HSCの暴露プリンP2受容体の活性化による細胞内Ca 2の増加を示し、図5に示すようにまた、ソートされた造血幹細胞は、機能の実験で使用することができアデノシン三リン酸（ATP）とイオノマイシン12。
図1 LIN-BM細胞の代表的なドットプロット解析。プロトコルのテキストで説明したように骨髄細胞懸濁液から造血前駆細胞と造血幹細胞を識別し、得点するためのフローサイトメーターでの電子ゲートの手順では、染色した。
pload/3736/3736fig2.jpg "/>
図2骨髄からのc-Kit +細胞の選択的濃縮のためのスキーム。
図3電子ゲートLKS CD34の細胞周期分析-健常者とKi-67抗体およびDAPIで染色したIBDを有するマウスにおける造血幹細胞。細胞が溶解/修正し、1μg/ mlでFITCコンジュゲートのKi-67およびDAPIで染色し、続いてバッファーをパーマで固定し、浸透させた。 LKS CD34内のすべての検出可能であればサイクリング細胞がほとんどです-健常者の造血幹細胞コンパートメント12。
図4 CD34をソートFACSのイメージング共焦点顕微鏡をライブ- HSCとGMPには、ヌクレオチド結合化合物のキナクリンと核赤（DRAQ5）で染色した。小さいの象限は、キナクリンposを表示itive小胞は造血幹細胞の細胞質内に検出されましたが、GMPにはありません。
図5。ソートされた造血幹細胞における細胞内Ca 2 +上昇がフラ-2をロードおよびATPとイオノマイシンで刺激した。単一細胞からのトレースが表示されます。すべての細胞は細胞外ATPは細胞質ゾルのCa 2の顕著な増加を示す+ ATPの添加後に反応した。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで説明する方法は、個々のマウス（ 図1）における造血の迅速かつ正確な分析を可能にします。マウス炎症モデルでは、自己免疫疾患、免疫不全、変性疾患、代謝性疾患および癌を含む様々な実験設定ではこの分析は、造血における病理学的条件の影響に対処することができます。 図3は、電子的にゲートLKSにおける細胞周期活性の分析を示しています。 CD34 - Ki-67のmAb及びDAPIで染色することにより炎症性腸疾患（IBD）13と、健康なマウスとマウス由来の細胞。後者は、細胞周期のS / G 2 / M期の細胞の有意な増加が表示されます。フローサイトメトリーでこの分析では、HSCのサイクリング活動12のT細胞媒介性の炎症の影響を示しています。
フローcytometrの細胞選別でのc-Kitを発現する骨髄細胞の磁気標識と充実の組み合わせyは非常に造血系前駆細胞と造血幹細胞を精製分離することができます。得られた細胞集団は細胞生物学（ 図4）、シグナル伝達（ 図5）、発達調節遺伝子発現と in vitroと同様に異なる細胞サブセットの生体機能のポテンシャルを勉強する多くのアッセイで使用することができます。確かに、磁気的濃縮のc-Kit +細胞は定常状態と炎症14で造血幹細胞のサイクリング活動の動的変化を研究するために首尾よく生着、非照射のホストに使用されました。私たちの手の中にここで説明する手順では、マウスあたり20万LKS細胞の平均的な収率でフラッシング骨より骨髄細胞をより効率的かつ迅速に回復することができます。複数のマウスのプールされた骨の髄から単離することができる静止造血幹細胞の非常に小さな数は、複数のセルを必要とする実験的アプローチの限界を構成しています。予備多くのケースでは、この制限に未然に防ぐために静止造血幹細胞-研究はCD34で実行するより集中的および時間厳守の分析を想定する方が多いLKS細胞に行うことができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
我々は、貴重なアドバイスを信行紀夫、仁滝沢とマルクスマンツに感謝します。この作品は、スイス国立科学財団、スイスのがんリーグとFondazione Ticinese当たりラ未公表スルCancroによって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 | |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| PenStrep | Gibco | 15070 | |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 | |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 | |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 | |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 | |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 | |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 | |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 | |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 | |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 | |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 | |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 | |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 | |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 | |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 | |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
- Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-161 (2004).
- Essers, M. A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, 904-908 (2009).
- Nagai, Y. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity. 24, 801-812 (2006).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, 1118-1129 (2008).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Lo Celso, C., Scadden, D., D, Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs. J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).
- Romanello, M. Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).
- Casati, A. Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).
- Bouma, G., Strober, W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).
- Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation. J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).
