Summary
En metod för att analysera fördelningen av benmärgsceller hematopoietiska progenitorer i flödescytometri samt att effektivt isolera höggradigt renade hematopoietiska stamceller (HSC: er) beskrivs. Isoleringen Förfarandet är i huvudsak baserad på magnetiska anrikning av c-Kit + celler och cell sortering för att rena HSC för cellulära och molekylära studier.
Abstract
Benmärgen är den viktigaste platsen där HSC och mer mogna blodkroppar härstamning progenitorer bor och differentierar i en vuxen organism. HSC utgör en minut cellpopulation av pluripotenta celler med förmåga att generera alla blodcellinjer under en livstid 1. Den molekylära dissektion av HSC homeostas i benmärgen har viktiga följder i blodbildningen, onkologi och regenerativ medicin. Vi beskriver märkningen protokollet med fluorescerande antikroppar och den elektroniska gating förfarandet i flödescytometri att göra mål hematopoetiska progenitorceller delmängder och HSC distribution i enskilda möss (Fig. 1). Dessutom beskriver vi en metod för att omfattande berika hematopoetiska progenitorceller och lång sikt (LT) och kortsiktiga (ST) rekonstituering HSC från poolade celler från benmärg suspensioner genom magnetisk anrikning av celler som uttrycker c-Kit. Den resulterande cellen preparatet kan användas för att sortera valda underuppsättningar för in vitro-ochin vivo funktionella studier (fig. 2).
Båda trabekulära osteoblaster 2,3 och sinusformad endotelet 4 utgör funktionella nischer stöd HSC i benmärgen. Flera mekanismer i den osteoblastiska nisch, inklusive en deluppsättning av N-cadherin + osteoblaster 3 och interaktion av receptorn tyrosinkinas Tie2 uttryckt i HSC: er med dess ligand angiopoietin-1 5 sammanfaller vid bestämning HSC: er vila. "Viloläge" i benmärgen är avgörande för att skydda HSC från replikering och slutligen utmattning efter alltför cykla aktivitet 6. Exogena stimuli som verkar på celler i det medfödda immunförsvaret som Toll-like receptor ligander 7 och interferon-a-6 kan också inducera proliferation och differentiering av HSC i härstamning stamceller. Nyligen en population av vilande mus HSC inom lin - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - befolkningen har beskrivits 8. Sortering av celler baserat på CD34-uttryck från den hematopoetiska progenitorer-anrikade cellsuspension som beskrivits här möjliggör isolering av både vilande självförnyande LT-HSC: er och ST-HSC: er 9. Ett liknande förfarande baserat på förbrukningen av härstamning positiva celler och sortering av LT-HSC med CD48 och Flk2 antikroppar har tidigare beskrivits 10. I denna rapport ger vi ett protokoll för fenotypiska karakterisering och ex vivo cellcykeln analys av hematopoetiska stamceller, vilka kan vara användbara för övervakning hematopoes i olika fysiologiska och patologiska tillstånd. Dessutom beskriver vi en FACS sortering förfarande för HSC, som kan användas för att definiera faktorer och mekanismer som reglerar deras självförnyelse, expansion och differentiering i cell biologi och signal analyser transduktionsmekanismer samt för transplantation.
Protocol
1. Framställning av cellsuspension från benmärg
- Euthanize musen och placera djuret i en rostfri kastrull och spraya 70% etanol på sin mage och rygg. Samla lårben och skenben från bakbenen och ryggraden.
- Noggrant bort alla mjukdelar rester från ryggraden med en vass spets sax och från ben ben med en gasbinda. Lagra ben i en 50 ml Falcon-rör med 30 ml RPMI-medium innehållande 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), kompletterat med 50 | iM β-merkaptoetanol, 100 | iM MEM icke-essentiella aminosyror, 1 mM MEM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin, 100 | ig / ml streptomycin och 100 U / ml penicillin.
- Täcka botten av ett tidigare steriliserat mortel med sterila filter.
- Överföra de ben in i mortel och täcka dem med ett skikt av filter för att montera en friktionsyta.
- Framställa en 50 ml Falcon-rör försett med en Falcon-filter.
- Krossa benenmed hjälp av en mortelstöt tills man erhåller en homogen cellsuspension.
- Överföra suspensionen in i röret.
- Tillsätt till murbruk 5 ml färskt RPMI fullständigt medium för att tvätta och skörda de återstående cellerna.
- Upprepa de sista två punkterna tills homogeniserade benen är klar.
- Överföra och filtrera i ett nytt rör cellsuspensionen för att eliminera den kvarvarande vävnaden skräp.
- Centrifugera röret vid 1500 rpm under 5 min och noggrant avlägsna supernatanten genom avsugning. Se till att inte störa cellpelleten.
2. Fenotypisk analys
- Resuspendera och tvätta cellerna i individuella möss i 15 ml PBS och 2% FBS.
- Centrifugera röret vid 1500 rpm under 5 min och noggrant avlägsna supernatanten genom avsugning. Se till att inte störa pelleten.
- Häng upp pelleten i 5 ml PBS och 2% FBS och celler räknas.
- Överföring 1 x 10 6 celler / brunn i en 96 brunnar med rund bottenplatta.
- Centrifugera plattan vid 1500 vpm under 5 minuter.
- Förbered en blandning av mAbs riktade mot följande ytmarkörer. Späda ut dem vad som anges i PBS och 2% FBS för att färga cellerna.
- CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 konjugerade till PE-Cy5 1:200
- c-Kit konjugerad till APC 1:100
- Sca1 konjugerad till biotin 1:50
- CD34 konjugerad till FITC 1:50
- FcyR konjugerad till PE 1:100
- IL-7R konjugerad till PE-Cy7 1:100
- Kasta bort supernatanten och tillsätt 50 | il av mAb blandningen till varje brunn. Dissociera till enstaka celler genom pipettering.
- Inkubera cellerna i 20 min i mörker vid 4 ° C.
- Tvätta celler två gånger med 150 | il PBS och 2% FBS.
- Centrifugera plattan vid 1500 rpm under 5 min och kasta supernatanten genom att vända på plattan.
- Späd streptavidin i PBS och 2% FBS som anges för att färga cellerna.
- Streptavidin conjugated till APC-Cy7 1:300
- Tillsätt 50 pl av lösningen till varje brunn. Dissociera till enkelcellsuspension genom pipettering.
- Inkubera cellerna i 10 minuter i mörker vid 4 ° C.
- Tvätta celler två gånger med 150 | il PBS och 2% FBS.
- Centrifugera plattan vid 1500 rpm under 5 min och avlägsna supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i 100 | il PBS och 2% FBS.
- Skaffa prover på FACS.
3. Magnetisk Anrikning av c-kit +-celler
- Framställa en buffertlösning innehållande PBS, pH 7,2, 0,5% bovint serumalbumin (BSA) och 2 mM EDTA.
- Resuspendera cellpelleten av benmärg härledd från minst 10 möss i 1 ml buffert innehållande c-Kit-mAb konjugerad med APC späddes 1:50.
- Inkubera cellerna i 20 min i mörker vid 4 ° C.
- Tvätta två gånger cellerna med 40 ml av buffertlösning.
- Centrifugera röret vid 1.500 rpm i 5 min och ta försiktigt bort tHan supernatanten genom aspiration. Se till att inte störa pelleten.
- Återsuspendera cellpellet och tillsätt 50 pl anti-APC Mikropärlor för varje avlivas musen direkt till pelleten.
- Blanda väl och inkubera under 20 minuter i mörker vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna genom tillsats av 40 ml av buffertlösning och centrifugera vid 1500 rpm under 5 minuter. Aspirera supernatanten fullständigt.
- Återsuspendera cellpelleten i multipel av 4 ml buffertlösning var tre möss avlivas.
- Ställe MACS LS kolumner i det magnetiska fältet av en lämplig separator MACS. Använd 1 kolumn var tre möss avlivas.
- Framställ kolonner av sköljning med 4 ml av buffertlösning.
- Applicera cellsuspension på kolumnerna.
- Samla omärkta celler som passerar genom och tvätta kolonnen med 4 ml av buffertlösning. Utföra tvättsteg genom tillsats av 4 ml buffert-lösning tre gånger. Lägg till ny buffert när kolumnen behållaren töms.
- Ta bort kolumner från separatorn och Place var och en på toppen av 15 ml Falcon-rör.
- Pipett 4 ml buffertlösning till varje kolonn. Omedelbart spola ut de magnetiskt märkta cellerna genom att trycka in kolven in i kolonnen.
- Centrifugera rören vid 1500 rpm under 5 min och noggrant avlägsna supernatanten genom avsugning.
- Ätersuspendera varje pellet med 1 ml buffertlösning och pellets grupp i en enda 15 ml Falcon-rör.
4. Sortering av hematopoietiska stamceller och Lineage bundna stamfäder
- Förbered en blandning av mAbs riktade mot följande ytmarkörer. Späda ut dem vad som anges i 500 | il PBS och 2% FBS för att färga cellerna.
- CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 konjugerade till PE-Cy5 1:200
- c-Kit konjugerad till APC 1:100
- Sca-1 konjugerad till biotin 1:50
- CD34 konjugerad till FITC 1:50
- FcyR konjugerad till PE 1:100
- Centrifugera röret från previousektionen vid 1.500 rpm i 5 min och ta försiktigt bort supernatanten genom aspiration.
- Tillsätt mAb blandning till pelleten. Dissociera till enkelcellsuspension genom pipettering.
- Inkubera cellerna i 20 min i mörker vid 4 ° C.
- Tvätta två gånger cellerna med 14 ml av PBS och 2% FBS.
- Centrifugera röret vid 1500 rpm under 5 min och avlägsna supernatanten.
- Späd streptavidin såsom anges i 500 | il PBS och 2% FBS för att färga cellerna.
- Streptavidin konjugerat till APC-Cy7 1:300
- Tillsätta lösningen till röret. Dissociera till enkelcellsuspension genom pipettering.
- Inkubera cellerna i 10 minuter i mörker vid 4 ° C.
- Tvätta två gånger cellerna med 14 ml PBS och 2% FBS.
- Centrifugera röret vid 1500 rpm under 5 min och avlägsna supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i 500 | il av PBS och 2% FBS.
- Överföra och filtrera cellsuspensionen i en ny 5 ml rör för att eliär tända cellulära aggregat som kan interferera med sorteringsproceduren.
- Tillsätt 5 | il av 7-AAD (använda den utspäddes 1:100) till cellsuspensionen för att utesluta 7-AAD + döda celler från de sorterade populationer.
- Sortera celler med en BD FACSAria enligt följande fenotyper:
- LKS celler: Lin - c-Kit + Sca-1 +
- LT-HSC: LKS CD34 -
- ST-HSC: er: LKS CD34
- GMP: Lin - c-Kit + Sca-1 låg FcyR högt CD34 +
- Ledamöterna: Lin - c-Kit + Sca-1 låg FcyR låg CD34 -
- CMPs: Lin - c-Kit + Sca-1 låg FcyR låg CD34 +
5. Representativa resultat
Figur 1 visar och exempel på den elektroniska gating förfarandet tillpoäng vanliga lymfoidprogenitorer (CLPS) som Lin - / c-Kit lo / interleukin (IL)-7R + celler, Lin - / c-Kit + / Sca-1 + (LKS) och Lin - / c-Kit + / Sca -1 lo (c-Kit +)-celler, från c-Kit + grind, är vanliga myeloida stamceller (CMPs) identifierats som FcyR lo CD34 + celler, granulocyter / monocyt föregångare (GMP) som FcyR hi CD34 + celler och megakaryocyt / erytrocyter stamfäder (ledamöter) som FcyR lo CD34 - celler, från LKS porten, LT-HSC och ST-HSC identifieras som CD34 - och CD34 + celler. Denna suspension av benmärgsceller kan berikas för c-kit +-celler med magnetiska kulor (Fig. 2); LT-HSC och ST-HSC kan sedan sorteras i enlighet med CD34-uttryck såväl som andra progenitorer enligt fenotypen som beskrivits ovan.
HSC kan ana lyserades i live imaging konfokalmikroskopi som visas i figur 4, där CD34 - celler färgades med nukleotid-bindande förening kinakrin 11 samt nukleär röd (DRAQ5). I HSC: er, men inte genetiskt modifierade växter, kinakrin-positiva vesiklar är synliga i cytoplasman 12. Dessutom kan sorteras HSC: er användas i funktionella experiment som visas i figur 5, som visar ökningen i cytosolisk Ca 2 + i LT-HSC genom aktivering av purinerga P2-receptorer vid exponering för adenosin-trifosfat (ATP) och jonomycin 12.
Figur 1. Representativa plot-analys av Lin-BM-celler. Elektronisk gating förfarande vid flödescytometer för att identifiera och poäng hematopoetiska progenitorceller och HSC från benmärg cellsuspension färgade som beskrivs i protokollet texten.
pload/3736/3736fig2.jpg "/>
Figur 2. Ett system för selektiv anrikning av c-kit +-celler från benmärg.
Figur 3 Cellcykelanalys av elektroniskt styrda LKS CD34 -. HSC hos friska kontroller och möss med IBD som färgats med Ki-67 antikropp och DAPI. Cellerna fixerades och permeabiliserades med Lyse / Fix och Perm buffertar följt av färgning med FITC-konjugerat Ki-67-och DAPI vid 1 | ig / ml. Cyklande celler är knappt eller inte alls upptäckas i LKS CD34 - HSC fack friska kontroller 12.
. Figur 4 Live avbildning konfokalmikroskopi av FACS sorterade CD34 - HSC och god tillverkningssed som färgats med nukleotid-bindande förening kinakrin och nukleära röd (DRAQ5). De små kvadranter visar kinakrin postiva vesiklar detekteras i cytoplasman av HSC: er men inte genetiskt modifierade växter.
Figur 5. Cytosolisk Ca 2 + förhöjda sorterade HSC lastade med Fura-2 och stimulerades med ATP och jonomycin. Spår från enstaka celler visas. Alla celler reagerar på extracellulära ATP visar framstående ökning i cytosoliska Ca 2 + efter tillsats av ATP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs här möjliggör snabb och noggrann analys av hematopoies i individuella möss (figur 1). Denna analys i olika experimentella inställningar, inklusive musmodeller av inflammation, autoimmunitet, immunbrist, degenerativa sjukdomar, metabola sjukdomar och cancer kan ta itu med konsekvenserna av patologiska tillstånd på blodbildningen. Figur 3 visar analysen av cellcykeln aktivitet på elektronisk gated LKS CD34 - celler från friska möss och möss med inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) 13 från färgning med Ki-67-mAb och DAPI. Den senare visas en signifikant ökning av celler i S / G2 / M faser av cellcykeln. Denna analys i flödescytometri visar effekterna av T-cell-medierad inflammation på HSC cykling aktivitet 12.
Kombination av magnetisk märkning och anrikning av benmärgsceller som uttrycker c-kit med cellsortering i flödet cytometry kan isolering av höggradigt renat hematopoetiska härstamning föregångare och HSC. De erhållna cellpopulationer kan användas i ett antal analyser för att studera cellbiologi (figur 4), signaltransduktion (figur 5), utvecklingsmässigt reglerad genexpression och in vitro såväl som in vivo funktionell potential distinkta cellundergrupper. I själva verket var magnetiskt berikade c-Kit + celler används för att framgångsrikt ympa icke bestrålade värdar för att studera dynamiska variationen av HSC cykla aktivitet i steady state och inflammation 14. I våra händer som beskrivs här kan bli effektivare och snabbare återhämtning av benmärgsceller än ben spolning med en genomsnittlig avkastning på 200.000 LKS celler per mus. Det mycket låga antalet passiva HSC som kan isoleras från poolade benmärg av flera möss utgör en gräns för experimentella metoder som kräver fler celler. För att undanröja denna begränsning, i många fall preliminärastudier kan utföras på fler rikliga LKS cellerna att förutse mer fokuserade och punktlig analyser som skall utföras i CD34 - passiva HSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa och Markus Manz för värdefulla råd. Detta arbete har finansierats av schweiziska National Science Foundation, Schweiz Cancer League och Fondazione Ticinese per la Ricerca sul Cancro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 | |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| PenStrep | Gibco | 15070 | |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 | |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 | |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 | |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 | |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 | |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 | |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 | |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 | |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 | |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 | |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 | |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 | |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 | |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 | |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
- Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-161 (2004).
- Essers, M. A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, 904-908 (2009).
- Nagai, Y. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity. 24, 801-812 (2006).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, 1118-1129 (2008).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Lo Celso, C., Scadden, D., D, Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs. J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).
- Romanello, M. Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).
- Casati, A. Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).
- Bouma, G., Strober, W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).
- Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation. J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).
