Summary
En fremgangsmåde til at analysere fordelingen af knoglemarvsceller hæmatopoietiske progenitorceller i flowcytometri samt effektivt isolere stærkt oprensede hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) er beskrevet. Isoleringsproceduren er hovedsagelig baseret på magnetisk berigelse af c-Kit +-celler og cellesortering at oprense HSC'er for cellulære og molekylære undersøgelser.
Abstract
Knoglemarven er det vigtigste sted, hvor HSC'er og mere modne blodceller afstamning progenitorer opholde sig og differentiere i en voksen organisme. HSC'er udgør et minut cellepopulation af pluripotente celler i stand til at generere alle blod cellelinier for et liv-tid 1. Den molekylære dissektion af HSC'er homeostase i knoglemarven har vigtige implikationer i bloddannelsen, onkologi og regenerativ medicin. Vi beskriver mærkning protokol med fluorescerende antistoffer og den elektroniske gating fremgangsmåden i flowcytometri scorer hæmatopoietiske progenitordelmængder og HSC'er distribution i individuelle mus (Fig. 1). Derudover beskriver vi en metode til omfattende berige hæmatopoietiske stamfædre såvel som på lang sigt (LT) og kortsigtede (ST) rekonstituering HSC'er fra sammenlagte knoglemarv cellesuspensioner ved magnetisk berigelse af celler, der udtrykker c-Kit. Den resulterende celle præparat kan anvendes til at sortere udvalgt delmængder til in vitro ogin vivo funktionelle studier (fig. 2).
Begge trabekulære osteoblaster 2,3 og sinusformet endotel 4 udgør funktionelle nicher understøtter HSC'er i knoglemarven. Adskillige mekanismer i osteoblastisk niche, herunder en delmængde af N-cadherin + osteoblaster 3 og vekselvirkning af receptor-tyrosinkinase Tie2 udtrykt i HSC'er med dets ligand angiopoietin-1 5 deler at bestemme HSC'er hviletilstand. "Dvale" i knoglemarven er afgørende for at beskytte HSC'er fra replikation og eventuel udmattelse ved overdreven cykling aktivitet 6. Exogene stimuli, der virker på celler i det medfødte immunsystem, såsom Toll-lignende receptorligander 7 og interferon-a 6 kan også inducere proliferation og differentiation af HSC'er i linietilknyttede progenitorer. For nylig, en befolkning på hvilende mus HSC'er i Lin - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - befolkningen er blevet beskrevet 8. Sortering af celler baseret på CD34-ekspression fra det hæmatopoietiske progenitorer-berigede cellesuspension som beskrevet her tillader isolering af både hvilende selvfornyende LT-HSC'er og ST-HSC'er 9. En lignende procedure baseret på depletering af afstamningsceller positive celler og sortering af LT-HSC med CD48 og Flk2 antistoffer er tidligere blevet beskrevet 10. I nærværende rapport tilvejebringer vi en protokol for den fænotypiske karakterisering og ex vivo cellecyklusanalyse af hæmatopoietiske progenitorceller, som kan være nyttige til overvågning af hæmatopoiese i forskellige fysiologiske og patologiske tilstande. Desuden beskriver vi en FACS-sortering procedure HSC'er, som kan anvendes til at definere faktorer og mekanismer, der regulerer deres selvfornyelse, ekspansion og differentiering cellebiologi og signaltransduktion assays samt til transplantation.
Protocol
1. Fremstillinq af cellesuspension fra knoglemarv
- Aflive mus og placere dyret på en rustfri gryde og spray 70% ethanol på dets underliv og tilbage. Saml lårben og skinneben fra bagbenene, og rygsøjlen.
- Nøjagtig fjerne alle bløde væv rester fra rygsøjlen med en skarp spids saks, og fra ben knogler med et stykke gaze. Lagrer knogler i et 50 ml Falcon-rør med 30 ml RPMI-medium indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), suppleret med 50 uM β-mercaptoethanol, 100 uM MEM ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM MEM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin, 100 ug / ml streptomycin og 100 U / ml penicillin.
- Dække bunden af en tidligere steriliseret morter med sterile filtre.
- Overfør knoglerne i morter og dække dem med et lag af filtre med henblik på at samle en friktionsoverflade.
- Fremstilling af en 50 mL Falcon rør forsynet med en Falcon filter.
- Smadre knoglerneved hjælp af en pistil, indtil der opnås en homogen cellesuspension.
- Overføre suspensionen ind i røret.
- Tilsættes til mørtlen 5 ml frisk RPMI komplet medium til at vaske og høste de resterende celler.
- Gentag de sidste to punkter, indtil de homogeniserede knoglerne synes klar.
- Overførsel og filtreres i et nyt rør cellesuspensionen for at fjerne det resterende vævsrester.
- Centrifuger røret ved 1500 rpm i 5 minutter og fjern supernatanten ved aspiration. Sørg for ikke at forstyrre cellepelleten.
2. Fænotypisk analyse
- Resuspenderes og vaskes celler i individuelle mus i 15 ml PBS og 2% FBS.
- Centrifuger røret ved 1500 rpm i 5 minutter og fjern supernatanten ved aspiration. Sørg for ikke at forstyrre pellet.
- Suspendere pellet i 5 ml PBS og 2% FBS og tæl cellerne.
- Overførsel 1 x 10 6 celler / brønd i en 96 brønde rundbundetplade.
- Centrifugeres pladen ved 1500 rpm i 5 min.
- Fremstilling af en blanding af mAb'er rettet mod følgende overflademarkører. Fortynde dem som angivet i PBS og 2% FBS til farvning af cellerne.
- CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, GR1, Ter119, NK1.1 konjugeret til PE-Cy5 1:200
- c-Kit konjugeret til APC 1:100
- Sca1 konjugeret til biotin 01:50
- CD34 konjugeret til FITC 01:50
- FcyR konjugeret til PE 1:100
- IL-7R konjugeret til PE-Cy7 1:100
- Supernatanten kasseres, og der tilsættes 50 uL af mAb'er blandingen til hver brønd. Dissocierer i enkelte celler ved pipettering.
- Cellerne inkuberes i 20 minutter i mørke ved 4 ° C.
- Vask cellerne to gange med 150 pi PBS og 2% FBS.
- Centrifugeres pladen ved 1500 rpm i 5 minutter, og supernatanten ved at vende pladen.
- Fortynd streptavidin i PBS og 2% FBS som angivet at farve cellerne.
- Streptavidin conjugated til APC-Cy7 1:300
- Tilsættes 50 ul af opløsningen til hver brønd. Dissocierer i enkelt cellesuspension ved pipettering.
- Cellerne inkuberes i 10 minutter i mørke ved 4 ° C.
- Vask cellerne to gange med 150 pi PBS og 2% FBS.
- Centrifugeres pladen ved 1500 rpm i 5 minutter og kassér supernatanten.
- Resuspender celler i 100 pi PBS og 2% FBS.
- Indsamle prøver på FACS.
3. Magnetisk Berigelse af c-Kit +-celler
- Fremstilling af en pufferopløsning indeholdende PBS, pH 7,2, 0,5% bovint serumalbumin (BSA), og 2 mM EDTA.
- Resuspender cellepelleten af knogle græskar afledt fra mindst 10 mus i 1 ml buffer indeholdende c-Kit-mAb konjugeret til APC fortyndet 1:50.
- Cellerne inkuberes i 20 minutter i mørke ved 4 ° C.
- Vaskes to gange celler med 40 ml pufferopløsning.
- Centrifuger røret ved 1500 rpm i 5 minutter og fjern THan supernatanten ved aspiration. Sørg for ikke at forstyrre pellet.
- Resuspender cellepellet og der tilsættes 50 pi anti-APC Mikroperler for hver aflivet mus direkte til pelleten.
- Bland godt og inkuber i 20 minutter i mørke ved 4 ° C.
- Vask cellerne ved tilsætning af 40 ml pufferopløsning og der centrifugeres ved 1500 rpm i 5 min. Aspirer supernatant fuldstændigt.
- Resuspender cellepelleten i multiplum af 4 ml pufferopløsning hver tre mus aflivet.
- Sted MACS LS kolonner i det magnetiske felt af et egnet MACS Separator. Brug 1 kolonne hver tre mus aflivet.
- Forberede søjler ved skylning med 4 ml pufferopløsning.
- Anvendelse cellesuspension på søjlerne.
- Indsamler umærkede celler, der passerer gennem og vaskes søjlen med 4 ml pufferopløsning. Udføre vasketrin ved tilsætning af 4 ml buffer-opløsning tre gange. Tilføje ny buffer, når søjlen reservoiret tømmes.
- Fjern kolonner fra separatoren og place hver ovenpå 15 ml Falcon-rør.
- Pipette 4 ml bufferopløsning på hver søjle. Umiddelbart skylle de magnetisk mærkede celler ved at skubbe stemplet ind i kolonnen.
- Centrifuger rørene ved 1.500 rpm i 5 minutter og fjern supernatanten ved aspiration.
- Resuspender hver pellet med 1 ml pufferopløsning og tilknyttede pellets i en enkelt 15 ml Falcon-rør.
4. Sortering af hæmatopoietiske stamceller og linietilknyttede progenitorer
- Fremstilling af en blanding af mAb'er rettet mod følgende overflademarkører. Fortynde dem som angivet i 500 pi PBS og 2% FBS til farvning af cellerne.
- CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, GR1, Ter119, NK1.1 konjugeret til PE-Cy5 1:200
- c-Kit konjugeret til APC 1:100
- Sca-1 konjugeret til biotin 01:50
- CD34 konjugeret til FITC 01:50
- FcyR konjugeret til PE 1:100
- Centrifuger røret fra previous afdeling ved 1.500 rpm i 5 minutter og fjern forsigtigt supernatanten ved aspiration.
- Tilføje mAb'er blandingen til pelleten. Dissocierer i enkelt cellesuspension ved pipettering.
- Cellerne inkuberes i 20 minutter i mørke ved 4 ° C.
- Vaskes to gange cellerne med 14 ml PBS og 2% FBS.
- Centrifuger røret ved 1500 rpm i 5 minutter og kassér supernatanten.
- Fortyndes streptavidin som angivet i 500 pi PBS og 2% FBS til farvning af cellerne.
- Streptavidin konjugeret til APC-Cy7 1:300
- Tilsættes opløsningen til røret. Dissocierer i enkelt cellesuspension ved pipettering.
- Cellerne inkuberes i 10 minutter i mørke ved 4 ° C.
- Vaskes to gange celler med 14 ml PBS og 2% FBS.
- Centrifuger røret ved 1500 rpm i 5 minutter og kassér supernatanten.
- Resuspender cellerne i 500 pi PBS og 2% FBS.
- Overførsel og filtrere den cellesuspension i en ny 5 ml rør med henblik på at eliminate cellulære aggregater, som kan interferere med sortering procedure.
- Tilsættes 5 pi 7-AAD (bruge den fortyndet 1:100) til cellesuspensionen for at udelukke 7-AAD + døde celler fra de sorterede populationer.
- Sortere celler med en BD FACSAria ifølge følgende fænotyper:
- LKS celler: lin - c-Kit + Sca-1 +
- LT-HSC'er: LKS CD34 -
- ST-HSC'er: LKS CD34 +
- GMP: Lin - c-Kit + Sca-1 lav FcyR høj CD34 +
- MEP'er: Lin - c-Kit + Sca-1 lav FcyR lav CD34 -
- Kystforvaltningsplaner: Lin - c-Kit + Sca-1 lav FcyR lav CD34 +
5. Repræsentative resultater
Figur 1 viser og eksempel på den elektroniske gating procedure tilscore fælles lymfoide progenitorer (CLPs) som Lin - / c-Kit lo / interleukin (IL)-7R +-celler, Lin - / c-Kit + / Sca-1 + (LKS) og Lin - / c-Kit + / Sca -1 LO (c-Kit +) celler fra c-Kit + gate er almindelige myeloide progenitorer (kystforvaltningsplaner) identificeret som FcyR lo CD34 +-celler, granulocytter / monocyt progenitorer (GMP), som FcyR hi CD34 +-celler og megakaryocyt / erythrocyt progenitorer (EP), som FcyR lo CD34 - celler; fra LKS gate, LT-HSC og ST-HSC identificeres som CD34 - og CD34 +-celler. Dette knoglemarv cellesuspension kan beriges for c-Kit +-celler med magnetiske perler (fig. 2), LT-HSC og ST-HSC kan derefter sorteres efter CD34 ekspression såvel som andre progenitorer ifølge fænotype beskrevet ovenfor.
HSC'er kan ana lyzed i levende billeddannelse konfokal mikroskopi, som vist i figur 4, hvor CD34 - celler blev farvet med nukleotid-bindende forbindelse quinacrin 11 og nuklear rød (DRAQ5). I HSC'er, men ikke god fremstillingspraksis, quinacrin-positive vesikler er synlige i cytoplasmaet 12. Endvidere kan sorteres HSC'er anvendes i funktionelle forsøg som vist i figur 5, som viser forøgelsen i cytosolisk Ca2 + i LT-HSC ved aktivering af purinerge P2-receptorer ved udsættelse for adenosin-triphosphat (ATP) og ionomycin 12.
Figur 1 Repræsentative dot plot-analyse af Lin-BM-celler. Elektroniske gating procedure flowcytometer at identificere og scorer hæmatopoietiske progenitorer og HSC'er fra knoglemarv cellesuspension farvet som beskrevet i protokollen teksten.
pload/3736/3736fig2.jpg "/>
Figur 2. En ordning til selektiv berigelse af c-Kit +-celler fra knoglemarv.
Figur 3 Cellecyklusanalyse af elektronisk gatede LKS CD34 -. HSC'er i raske kontrolpersoner og mus med IBD farvet med Ki-67 antistof og DAPI. Cellerne blev fikseret og permeabiliseret med Lyse / Fix og Perm puffere efterfulgt af farvning med FITC-konjugeret Ki-67 og DAPI ved 1 ug / ml. Delende celler næppe, hvis overhovedet påviselig i LKS CD34 - HSC'er rum raske kontroller 12.
. Figur 4 Levende billeddannelse konfokal mikroskopi af FACS sorterede CD34 - HSC'er og GMP farvet med nucleotid-bindende forbindelse quinacrin og nuklear rød (DRAQ5). De små kvadranter viser quinacrine POSitive vesikler påvist i cytoplasmaet af HSC'er men ikke GMP.
Figur 5. Cytosolisk Ca2 + stigninger i sorteret HSC'er fyldt med Fura-2 og stimuleret med ATP og ionomycin. Spor fra enkelte celler er vist. Alle celler blev reagerer ekstracellulære ATP viser fremtrædende forøgelse i cytosolisk Ca2 + efter tilsætning af ATP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne fremgangsmåde muliggør hurtig og nøjagtig analyse af hæmatopoiese i individuelle mus (figur 1). Denne analyse i forskellige eksperimentelle indstillinger, herunder murine modeller med inflammation, autoimmunitet og immundeficiens, degenerative sygdomme, metaboliske sygdomme og cancer, tillader at behandle virkningerne af patologiske tilstande på hæmopoiesis. Figur 3 viser analysen af cellecyklus aktivitet på elektronisk styrede LKS CD34 - celler fra raske mus og mus med inflammatorisk tarmsygdom (IBD) 13 ved farvning med Ki-67 mAb og DAPI. Den sidstnævnte viste en signifikant forøgelse af celler i S / G 2 / M faser af cellecyklussen. Denne analyse i flow-cytometri viser virkningen af T-cellemedieret inflammation på HSC cykling aktivitet 12.
Kombinationen af magnetisk mærkning og berigelse af knoglemarvsceller udtrykker c-kit med cellesortering i strømningsforbindelse cytometry tillader isolering af højrenset hæmatopoietisk linje progenitorer og HSC'er. De opnåede cellepopulationer kan anvendes i en række assays til at studere cellebiologi (figur 4), signaltransduktion (figur 5), udviklingsmæssigt reguleret genekspression og in vitro såvel som in vivo funktionel potentiale af forskellige celle-delmængder. Faktisk blev magnetisk berigede c-Kit +-celler anvendt til vellykket indpode ikke-bestrålede værter at studere dynamisk variation af HSC'er cykling aktivitet i steady state og inflammation 14. I vores hænder den her beskrevne procedure muliggør mere effektiv og hurtigere helbredelse af knoglemarvsceller end knogle skylning med et gennemsnitligt udbytte på 200.000 LKS celler per mus. Det meget lille antal af hvilende HSC'er, der kan isoleres fra poolede knogle græskar af flere mus udgør en grænse for eksperimentelle metoder, som kræver flere celler. For at undgå denne begrænsning, i mange tilfælde indledendeundersøgelser kan udføres på flere rigelige LKS celler til at forestille sig mere målrettede og rettidige analyser, der skal udføres i CD34 - rolige HSC'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa og Markus Manz for værdifulde råd. Dette arbejde blev finansieret af den schweiziske National Science Foundation, schweizisk Cancer League og Fondazione Ticinese per la Ricerca sul Cancro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 | |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| PenStrep | Gibco | 15070 | |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 | |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 | |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 | |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 | |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 | |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 | |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 | |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 | |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 | |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 | |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 | |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 | |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 | |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 | |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
- Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-161 (2004).
- Essers, M. A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, 904-908 (2009).
- Nagai, Y. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity. 24, 801-812 (2006).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, 1118-1129 (2008).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Lo Celso, C., Scadden, D., D, Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs. J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).
- Romanello, M. Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).
- Casati, A. Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).
- Bouma, G., Strober, W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).
- Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation. J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).
