Summary
Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.
Abstract
Das Knochenmark ist der wichtigste Ort, wo HSCs und reifer Blutzellen Abstammung Vorfahren wohnen und differenzieren in einem erwachsenen Organismus. Blutstammzellen bilden eine Minute Zellpopulation von pluripotenten Zellen zu erzeugen vermag alle Blutzelllinien für ein Leben-Zeit ein. Die molekulare Aufklärung von HSK-Homöostase im Knochenmark hat wichtige Auswirkungen in der Hämatopoese, der Onkologie und der regenerativen Medizin. Wir beschreiben die Kennzeichnung Protokoll mit fluoreszierenden Antikörpern und dem elektronischen Gating Verfahren in der Durchflusszytometrie auf hämatopoetischen Vorläuferzellen Teilmengen und HSCs Verteilung in einzelnen Mäusen (Abb. 1) punkten. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, um ausgiebig zu bereichern hämatopoetischen Vorläuferzellen als auch langfristige (LT) und kurzfristige (ST) Rekonstituieren Blutstammzellen aus dem Knochenmark gepoolten Zellsuspensionen von magnetischen Anreicherung von Zellen, die c-Kit. Die resultierende Zelle Herstellung verwendet werden, um ausgewählte Teilmengen für die in vitro zu sortieren undIn-vivo-funktionelle Untersuchungen (Abb. 2).
Beide trabekulären Osteoblasten 2,3 und sinusförmige Endothel 4 bilden funktionale Nischen Unterstützung von Blutstammzellen im Knochenmark. Mehrere Mechanismen in der osteoblastischen Nische, einschließlich einer Teilmenge von N-Cadherin + Osteoblasten 3 und Wechselwirkung des Tie2-Rezeptor-Tyrosinkinase im HSK mit seinem Liganden Angiopoietin-1 5, ausgedrückt stimmen bei der Bestimmung HSK Ruhe. "Ruhezustand" im Knochenmark ist entscheidend für die HSK von der Replikation und eventuelle Erschöpfung bei übermäßiger Aktivität Radfahren 6 zu schützen. Exogene Stimuli, die auf Zellen des angeborenen Immunsystems, wie Toll-like-Rezeptor-Liganden 7 und Interferon-α 6 kann auch induzieren Proliferation und Differenzierung von Blutstammzellen in Linie festgelegte Vorläuferzellen. Kürzlich wurde eine Population von schlafenden Blutstammzellen in der Maus lin - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - Population wurde bisher 8 beschrieben. Sortieren von Zellen auf CD34-Expression aus der hämatopoetischen Vorläuferzellen angereicherten Zellsuspension, wie hier beschrieben Basis ermöglicht die Isolierung von sowohl ruhende selbst erneuernden LT-HSK und ST-HSK 9. Ein ähnliches Verfahren auf Erschöpfung der Linie positive Zellen und Sortierung von LT-HSC mit CD48-Antikörpern und flk2 Basis wurde bereits 10 beschrieben. Im vorliegenden Bericht stellen wir ein Protokoll für die phänotypische Charakterisierung und Ex-vivo-Zellzyklus-Analyse von hämatopoetischen Vorläuferzellen, die nützlich für die Überwachung der Hämatopoese in verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen kann. Darüber hinaus beschreiben wir ein Verfahren FACS-Sortierung für HSK, die verwendet werden, um Faktoren und Mechanismen, die ihre Selbst-Erneuerung, Erweiterung und Differenzierung in der Zellbiologie und Signaltransduktion Assays sowie für die Transplantation definiert werden können.
Protocol
1. Vorbereitung der Zellsuspension aus dem Knochenmark
- Euthanize die Maus und platzieren Sie das Tier in einer Pfanne Edelstahl und Spray 70% Ethanol auf seinen Bauch und Rücken. Sammeln Sie Oberschenkel und Schienbein von Hinterbeinen und Wirbelsäule.
- Exakt entfernen Sie alle Rückstände aus der Weichteile der Wirbelsäule mit einer scharfen Spitze Schere und Beine aus Knochen mit einer Gaze. Shop Knochen in einem 50-ml-Falcon-Röhrchen mit 30 ml RPMI-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), mit 50 uM β-Mercaptoethanol, 100 pM MEM nicht-essentielle Aminosäuren ergänzt, 1 mM MEM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 100 ug / ml Streptomycin und 100 U / ml Penicillin.
- Bedecken Sie den Boden einer zuvor sterilisierten Mörser mit Sterilfilter.
- Übertragen Sie die Knochen in den Mörser und bedecken Sie sie mit einer Schicht von Filtern, um eine Reibungsfläche zu montieren.
- Bereiten Sie eine 50-ml-Falcon-Röhrchen mit einem Falcon-Filter zur Verfügung gestellt.
- Smash die Knochenmit Hilfe eines Stößels, bis eine homogene Zellsuspension.
- Die Suspension in das Rohr.
- Fügen Sie dem Mörtel 5 ml frisches RPMI Vollmedium zu waschen und zu ernten, die übrigen Zellen.
- Wiederholen Sie die letzten beiden Punkte, bis die Knochen homogenisierte klar erscheinen.
- Übertragen und Filtern in ein neues Röhrchen der Zellsuspension, um die verbleibende Gewebe Ablagerungen zu beseitigen.
- Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. Achten Sie darauf, nicht auf das Zellpellet zu stören.
2. Phänotypische Analyse
- Resuspendieren und waschen Sie die Zellen der einzelnen Mäuse in 15 ml PBS und 2% FBS.
- Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen. Stellen Sie sicher nicht, um das Pellet zu stören.
- Hängen Sie das Pellet in 5 ml PBS und 2% FBS und Zählen von Zellen.
- Transfer 1 × 10 6 Zellen / Well in einer 96 Vertiefungen mit rundem BodenPlatte.
- Die Platte bei 1.500 rpm für 5 min.
- Bereiten Sie eine Mischung aus mAbs gegen folgende Oberflächenmarker gerichtet. Verdünnen, wie in PBS und 2% FBS, um die Zellen zu färben.
- CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, TER119, NK1.1 konjugiert PE-Cy5 1:200
- c-Kit konjugiert APC 1:100
- SCA1 an Biotin konjugiert 1.50
- CD34 konjugiert mit FITC 01.50
- FcyR konjugiert mit PE 1:100
- IL-7R, konjugiert an PE-Cy7 1:100
- Überstand verwerfen und 50 ul von mAk-Mix in jede Vertiefung. Distanziere in einzelne Zellen durch Pipettieren.
- Inkubieren Zellen für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit 150 ul PBS und 2% FBS.
- Die Platte bei 1.500 rpm für 5 min und den Überstand verwerfen durch Umdrehen der Platte.
- Verdünnte Streptavidin in PBS und 2% FBS wie angegeben, um die Zellen zu färben.
- Streptavidin konjugiertegated zu APC-Cy7 1:300
- Dann werden 50 ul der Lösung in jede Vertiefung. Distanziere in einzelne Zell-Suspension durch Pipettieren.
- Inkubieren Zellen für 10 min im Dunkeln bei 4 ° C
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit 150 ul PBS und 2% FBS.
- Die Platte bei 1.500 rpm für 5 min und den Überstand verwerfen.
- Die Zellen in 100 ul PBS und 2% FBS.
- Erwerben Proben bei FACS.
3. Magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen
- Planen einer Pufferlösung mit PBS, pH 7,2, 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA.
- Das Zellpellet mit Knochen Zucchini aus mindestens 10 Mäusen in 1 ml Pufferlösung, die c-Kit-mAb, konjugiert an APC abgeleitet 1:50 verdünnt.
- Inkubieren Zellen für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C
- Wasche zweimal die Zellen mit 40 ml Pufferlösung.
- Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min und entfernen Sie vorsichtig ter Überstände durch Absaugen. Stellen Sie sicher nicht, um das Pellet zu stören.
- Zellpellet resuspendieren und 50 ul Anti-APC MicroBeads für jeden eingeschläfert Maus direkt an den Pellets.
- Gut mischen und inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C
- Waschen der Zellen durch Zugabe von 40 ml Pufferlösung und Zentrifuge bei 1.500 rpm für 5 min. Absaugen des Überstandes.
- Resuspendieren Zellpellet in Vielfachen von 4 ml Pufferlösung alle drei Mäusen eingeschläfert werden.
- Platz MACS LS Spalten in dem Magnetfeld eines geeigneten MACS Separator. Verwenden Sie 1 Spalte alle drei Mäuse eingeschläfert werden.
- Planen Spalten durch Spülen mit 4 ml Pufferlösung.
- Anwenden Zellsuspension auf die Säulen.
- Sammle unmarkierten Zellen, die hindurchgehen und Waschkolonne mit 4 ml Pufferlösung. Führen Waschschritte durch Zugabe von 4 ml Pufferlösung dreimal. Fügen Sie neue Puffer, wenn die Spalte Reservoir geleert wird.
- Entfernen von Spalten aus dem Abscheider und place jeweils eine auf der 15-ml-Falcon-Tubes.
- Pipette 4 ml Puffer-Lösung auf jede Spalte. Unmittelbar spülen die magnetisch markierte Zellen, indem Sie den Kolben in die Spalte.
- Die Röhrchen bei 1.500 rpm für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen.
- Resuspendieren jedes Pellet mit 1 ml Pufferlösung und Pellets Gruppe in einem einzigen 15 ml Falcon Röhrchen.
4. Sortieren von hämatopoetischen Stammzellen und Lineage festgelegte Vorläuferzellen
- Bereiten Sie eine Mischung aus mAbs gegen folgende Oberflächenmarker gerichtet. Verdünnen, wie in 500 ul PBS und 2% FBS, um die Zellen zu färben.
- CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, TER119, NK1.1 konjugiert PE-Cy5 1:200
- c-Kit konjugiert APC 1:100
- Sca-1 an Biotin konjugiert 1.50
- CD34 konjugiert mit FITC 01.50
- FcyR konjugiert mit PE 1:100
- Das Röhrchen aus dem früs Abschnitt bei 1.500 rpm für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen.
- Fügen Sie die mAbs Mischung zum Pellet. Distanziere in einzelne Zell-Suspension durch Pipettieren.
- Inkubieren Zellen für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C
- Wasche zweimal die Zellen mit PBS 14mL und 2% FBS.
- Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min und den Überstand verwerfen.
- Verdünnte Streptavidin, wie in 500 ul PBS und 2% FBS, um die Zellen zu färben.
- Streptavidin konjugiert mit APC-Cy7 1:300
- Fügen Sie die Lösung in das Röhrchen. Distanziere in einzelne Zell-Suspension durch Pipettieren.
- Inkubieren Zellen für 10 min im Dunkeln bei 4 ° C
- Wasche zweimal die Zellen mit 14 ml PBS und 2% FBS.
- Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min und den Überstand verwerfen.
- Die Zellen in 500 ul PBS und 2% FBS.
- Übertragen und Filtern der Zellsuspension in einem neuen 5 ml Tube, um Eliminate zelluläre Aggregate, die mit der Sortier-Verfahren stören können.
- 5 l der 7-AAD (verwenden Sie es verdünnt 1:100) zur Zellsuspension, um 7-AAD + toten Zellen aus den sortierten Populationen auszuschließen.
- Sortieren Zellen mit einem BD FACSAria nach folgenden Phänotypen:
- LKS-Zellen: LIN - c-Kit + Sca-1 +
- LT-HSK: LKS CD34 -
- ST-HSK: LKS CD34 +
- GVP: LIN - c-Kit + Sca-1 niedriger FcyR hohe CD34 +
- Abgeordneten: lin - c-Kit + Sca-1 niedriger FcyR niedrigen CD34 -
- CMPs: LIN - c-Kit + Sca-1 niedriger FcyR niedrigen CD34 +
5. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt ein Beispiel des elektronischen Gating Verfahren zuPunktzahl gemeinsamen lymphoiden Vorläuferzellen (CLP) als Lin - / c-Kit lo / Interleukin (IL)-7R + Zellen; Lin - / c-Kit + / Sca-1 + (LKS) und Lin - / c-Kit + / SCA -1 lo (c-Kit +)-Zellen, aus dem c-Kit + Tor, sind gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen (CMPs) als FcyR lo CD34 +-Zellen, Granulozyten / Monozyten-Vorläuferzellen (GVP) als FcyR Hallo CD34 +-Zellen und Megakaryozyten / identifiziert Erythrozyten-Vorläuferzellen (MdEP) als FcyR lo CD34 - Zellen; von der LKS-Tor, LT-und ST-HSC HSC werden als CD34 identifiziert - und CD34 +-Zellen. Das Knochenmark Zellsuspension kann für c-Kit +-Zellen mit magnetischen Beads (Abb. 2) angereichert werden, LT-und ST-HSC HSC kann dann nach CD34 Expression sowie andere Vorläuferzellen nach der oben beschriebenen Phänotyp sortiert werden.
HSK können ana sein lysiert im Live-Imaging-konfokale Mikroskopie, wie in Abbildung 4, wo CD34 gezeigt - Zellen mit dem Nukleotid-bindenden Verbindung Quinacrin 11 sowie nukleare rot (DRAQ5) gefärbt wurden. In HSCs, aber nicht GVP sind Quinacrin-positive Vesikel im Zytoplasma sichtbar 12. Darüber hinaus können sortiert HSK in verschiedene Experimente verwendet werden, wie in 5, die den Anstieg der zytosolischen Ca 2 + in LT-HSC durch Aktivierung von purinergen P2-Rezeptoren bei Belichtung zeigt gezeigt, Adenosin-Triphosphat (ATP) und Ionomycin 12.
Abbildung 1. Vertreter Dot-Plot Analyse von LIN-BM-Zellen. Elektronische Gating Verfahren auf Durchflusszytometer zu ermitteln und ein Tor hämatopoetischen Vorläuferzellen und HSK aus Knochenmark Zellsuspension gefärbt, wie im Protokoll Text beschrieben.
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Abbildung 2. Eine Regelung zur selektiven Anreicherung von c-Kit +-Zellen aus dem Knochenmark.
Abbildung 3 Zellzyklus-Analyse von elektronisch gesteuerten LKS CD34 -. Blutstammzellen bei gesunden Kontrollen und Mäuse, die mit IBD mit Ki-67 Antikörper und DAPI gefärbt. Die Zellen wurden fixiert und permeabilisiert mit Lyse / Fix und Perm Puffer durch Färbung mit FITC-konjugierten Ki-67 und DAPI bei 1 ug / ml gefolgt. Radfahren Zellen sind kaum, wenn überhaupt nachweisbar in der LKS-CD34 - HSC Fach von gesunden Kontrollen 12.
. Abbildung 4 Live-Imaging-konfokale Mikroskopie von FACS sortierten CD34 - HSC und GVP mit dem Nukleotid-bindenden Verbindung Quinacrin und nukleare rot (DRAQ5) gefärbt. Die kleinen Quadranten zeigen Quinacrin POSitive Vesikel im Zytoplasma von HSK erkannt, aber nicht GVP.
Abbildung 5. Cytosolischen Ca 2 + Erhöhungen der HSZ sortiert mit Fura-2 beladen und stimuliert mit ATP und Ionomycin. Spuren von einzelnen Zellen gezeigt werden. Alle Zellen waren als Reaktion auf extrazelluläres ATP zeigt prominente Anstieg der cytosolischen Ca 2 + nach Zugabe von ATP.
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Discussion
Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine schnelle und genaue Analyse der Hämatopoese in einzelnen Mäusen (Abbildung 1). Diese Analyse in verschiedenen experimentellen Einstellungen, einschließlich Mausmodell von Entzündungen, Autoimmunerkrankungen, Immundefizienz, degenerative Erkrankungen, Stoffwechselstörungen und Krebs, ermöglicht der Bewältigung der Folgen von pathologischen Zuständen, auf die Hämatopoese. Abbildung 3 zeigt die Analyse der Zellzyklus-Aktivität auf elektronisch gesteuerte LKS CD34 - Zellen von gesunden Mäusen und Mäusen mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) 13 durch Färbung mit Ki-67-mAb und DAPI. Letztere ein signifikanter Anstieg der Zellen in der S / G 2 / M-Phasen des Zellzyklus. Diese Analyse in der Durchflusszytometrie zeigt die Auswirkungen der T-Zell-vermittelte Entzündung auf HSC Radfahren Tätigkeit 12.
Kombination von magnetischen Markierung und Anreicherung von Knochenmark-Zellen, die c-Kit mit Zellsortierung in Fluss cytometry erlaubt Isolierung hochreiner hämatopoetischen Vorläuferzellen Abstammung und HSK. Die erhaltenen Zellpopulationen in einer Reihe von Tests verwendet werden, um Zellbiologie (4), die Signalübertragung (5), entwicklungsregulierten Expression und in vitro sowie in vivo funktionelle Potential verschiedenen Zellpopulationen zu studieren. Tatsächlich wurden magnetisch angereichert c-Kit +-Zellen, um erfolgreich einprägen nicht bestrahlten Hosts verwendet werden, um dynamische Variation der HSZ Radfahren Aktivität im eingeschwungenen Zustand und Entzündungen 14 zu studieren. In unseren Händen die hier beschriebene Vorgehensweise ermöglicht eine effizientere und schnellere Wiederherstellung von Knochenmarkzellen als Knochen Spülen mit einem durchschnittlichen Ertrag von 200.000 Zellen pro Maus LKS. Die sehr geringe Anzahl von ruhenden HSK, die aus gepoolten Knochen Zucchini aus mehreren Mäusen isoliert werden können stellt eine Grenze für experimentellen Ansätze, die eine mehr Zellen. Um diese Einschränkung zu beseitigen, in vielen Fällen vorläufigeStudien können auf reichlicher LKS-Zellen durchgeführt werden, um zielgerichteter und pünktlicher Analysen in CD34 durchgeführt werden, ins Auge zu fassen - Ruhestrom HSK.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa und Markus Manz für wertvolle Ratschläge. Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds, Krebsliga Schweiz und Tessiner Fondazione per la ricerca sul Cancro finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 | |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| PenStrep | Gibco | 15070 | |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 | |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 | |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 | |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 | |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 | |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 | |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 | |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 | |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 | |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 | |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 | |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 | |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 | |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 | |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
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