Summary
描述的方法来分析流式细胞仪检测骨髓造血祖细胞的分布以及有效地隔离高度纯化造血干细胞（HSCs）。基本上是基于C-kit +细胞和排序，以净化造血干细胞和分子生物学研究细胞的磁富集分离过程。
Abstract
骨髓造血干细胞和更成熟的血细胞谱系祖居住在成年生物体和分化的主要站点。造血干细胞构成的多能干细胞能够产生所有的血细胞谱系的生命时间1分钟的细胞群。在骨髓中的造血干细胞稳态的分子解剖，具有造血，肿瘤学和再生医学的重要意义。我们描述了荧光抗体和流式细胞仪，以取得造血祖细胞亚群及个别小鼠造血干细胞的分布（ 图1）在电子门控过程的标签协议。此外，我们描述了一个方法，广泛丰富造血祖细胞，以及长期（LT）和短期（ST）的重组细胞表达c-kit的磁富集的造血干细胞从汇集的骨髓细胞悬液。由此产生的细胞制剂可用于选定的子集，并在体外进行排序在体内的功能性研究（ 图2）。
2,3都小梁成骨细胞和肝窦内皮细胞4构成支持骨髓中的造血干细胞的功能龛。几个机制中的成骨细胞的利基，包括N-cadherin的成骨细胞3子集和Tie2的表达及其配体血管生成素1 5造血干细胞的受体酪氨酸激酶的相互作用同意确定造血平静。在骨髓中的“休眠”是至关重要的，以保护造血干细胞复制和最终用尽后，过多的骑自行车活动6。外源性刺激作用于细胞的先天免疫系统，如Toll样受体配体7和α-干扰素6也将沿袭承诺祖细胞诱导的造血干细胞的增殖和分化。最近，林内的人口处于休眠状态的小鼠造血干细胞- C-KIT + SCA-1 + CD 150 + CD48 - CD34 -人口已8。细胞排序从此处所述的造血祖细胞富集的细胞悬液，CD34的表达，可以隔离两个静态的自我更新的LT-HSCs和ST-造血干细胞9。一个类似的过程基于血统阳性细胞的枯竭和LT-HSC的排序与CD48和Flk2抗体的先前已描述10。在本报告中，我们提供了一个协议表型特征和体外造血祖细胞，它可以用于监测在不同的生理和病理条件下的造血细胞周期分析。此外，我们描述了流式细胞仪分选造血干细胞的过程，它可以用来定义调节他们的自我更新，在细胞生物学和信号转导检测，以及用于移植的扩张和分化的因素和机制。
Protocol
1。从骨髓细胞悬液的制备
- 安乐死鼠标放置在一个不锈钢锅和喷70％的乙醇，将其腹部和背部的动物。收集后腿和胫骨股骨，脊柱。
- 从脊柱准确地清除所有的软组织残留，用锋利的尖剪刀，从腿的骨头用纱布。在50毫升猎鹰管店骨头与30毫升的RPMI培养基含10％热灭活胎牛血清（FBS），血清，50μM的β-巯基乙醇，100μM的的MEM非必需氨基酸的补充，1毫米的MEM丙酮酸钠，2毫米L-谷氨酰胺，100微克/ ml链霉素和100 U / mL青霉素。
- 覆盖无菌过滤器，先前消毒迫击炮的底部。
- 迫击炮转移到骨骼和他们以组装摩擦表面覆盖层的过滤器。
- 准备一个50毫升的隼管与猎鹰过滤器提供。
- 粉碎的骨头一杵，直至获得均匀的细胞悬液的帮助。
- 转移到管悬挂。
- 添加到砂浆的5毫升新鲜的RPMI完全培养基洗和收获剩余的细胞。
- 重复最后两个点，直到出现明确的同质化骨。
- 转让和筛选，在一个新的管细胞悬液，以消除剩余的组织碎片。
- 在5分钟1500转离心管和吸小心取出上清液。确保不扰乱细胞沉淀。
2。表型分析
- 悬浮和个别小鼠的细胞在15毫升和2％FBS的PBS洗。
- 在5分钟1500转离心管和吸小心取出上清液。确保不打扰沉淀。
- 暂停在5毫升PBS和2％FBS和计数细胞沉淀。
- 转移1×10 6细胞/ 96井圆底板。
- 离心5分钟1500转板。
- 准备了针对以下的表面标志物的单克隆抗体的组合。稀释他们表示在PBS和2％FBS染色细胞。
- CD4，CD8细胞，CD3 +，CD45R，CD19 +，GR1，Ter119，NK1.1结合的PE-Cy5的1:200
- C-套件结合APC的1:100
- SCA1结合生物素1:50
- CD34的共轭FITC标记1:50
- FcγR结合，以体育为1:100
- IL-7R共轭的PE-Cy7 1:100
- 弃上清，每孔加入50μL的单克隆抗体组合。吹打成单个细胞的分离。
- 细胞在4°C孵育20分钟，在黑暗中
- 150μL的PBS和2％FBS洗涤细胞两次。
- 离心5分钟1500转板和丢弃上清液反相板。
- 在PBS稀释链亲和2％FBS，表示染色细胞。
- 链霉亲和共轭门来的APC-Cy7 1:300
- 加入50μL的解决方案，以每口井。吹打成单细胞悬液分离。
- 在4°C孵育10分钟，在黑暗中的细胞
- 150μL的PBS和2％FBS洗涤细胞两次。
- 板和5分钟1500转离心，弃上清。
- 重悬于100μLPBS和2％FBS的细胞。
- 购入流式细胞样本。
3。 C-kit +细胞的磁富集
- 准备一个缓冲液PBS，pH值7.2，0.5％的牛血清白蛋白（BSA），2毫米EDTA。
- 悬浮颗粒骨骨髓细胞来自至少10 1毫升缓冲含c-kit的抗体结合APC的解决方案中的小鼠稀释1:50。
- 细胞在4°C孵育20分钟，在黑暗中
- 40毫升缓冲液洗两次细胞。
- 5分钟1500转离心管，小心取出ţ他上清愿望。确保不打扰沉淀。
- 重悬细胞沉淀，并添加每个安乐死鼠标50μL的反装甲运兵车微珠直接沉淀。
- 拌匀，并在4°C孵育20分钟，在黑暗中
- 清洗细胞，加入40毫升缓冲溶液中，离心5分钟1500转。完全吸出上清液。
- 重悬细胞沉淀在每三个老鼠安乐死的缓冲溶液4毫升多个。
- 地方磁珠在磁场一个合适的磁珠分离LS列。使用1列，每三只老鼠安乐死。
- 准备用4毫升缓冲溶液冲洗列。
- 细胞悬液涂于列。
- 收集未标记的细胞，通过与4毫升缓冲液洗柱。履行加入缓冲溶液4毫升三次洗涤步骤。添加新列时，水库清空缓冲区。
- 删除列的分隔和PLAC北京时间15毫升猎鹰管上每个人。
- 吸取4 mL的缓冲溶液到每列。立即冲洗掉柱塞推入列磁标记细胞。
- 在5分钟1500转离心管和吸小心取出上清液。
- 每1毫升缓冲溶液中和一个15毫升的猎鹰管组颗粒悬浮沉淀。
4。造血干细胞和传承的承诺祖排序
- 准备了针对以下的表面标志物的单克隆抗体的组合。稀释他们表示，在500μL的PBS和2％FBS染色细胞。
- CD4，CD8细胞，CD3 +，CD45R，CD19 +，GR1，Ter119，NK1.1结合的PE-Cy5的1:200
- C-套件结合APC的1:100
- SCA-1结合到生物素1:50
- CD34的共轭FITC标记1:50
- FcγR结合，以体育为1:100
- 离心管的上一页s节在5分钟1500转，并小心地取出吸上清。
- 添加单克隆抗体混合颗粒。吹打成单细胞悬液分离。
- 细胞在4°C孵育20分钟，在黑暗中
- 洗两次细胞的PBS和2％FBS 14mL。
- 在5分钟1500转离心管，弃上清。
- 稀释链霉表明，在500μLPBS和2％FBS染色细胞。
- 链亲和素结合的APC-Cy7 1:300
- 加入该管的解决方案。吹打成单细胞悬液分离。
- 在4°C孵育10分钟，在黑暗中的细胞
- 洗两次细胞14毫升PBS和2％FBS。
- 在5分钟1500转离心管，弃上清。
- 重悬于500μLPBS和2％FBS的细胞。
- 传输和过滤在一个新的5 mL管细胞悬液，以ELIminate细胞的集合体，可以干扰与排序程序。
- 7-AAD的5μL（使用稀释1:100）加入细胞悬液，以7-AAD的+死细胞排除排序人口。
- 与BD FACSAria排序根据以下表型的细胞：
- 李嘉诚细胞：林- C-KIT + SCA-1 +
- LT-造血干细胞：CD34的李嘉诚-
- ST-造血干细胞：CD34的李嘉诚+
- 绿化总纲图：林- C-KIT + SCA-1 低 FcγRCD34的高+
- MEPS：林- C-KIT + SCA-1 低 FcγR 低 CD34的-
- 中医：林- C-KIT + SCA-1 低 FcγR 低 CD34的+
5。代表结果
图1显示，例如电子浇注过程得分淋巴共同祖（CLPs）林- C-KIT / LO /白细胞介素（IL）-7R +细胞;林- / C套件+ / SCA-1 +（LKS）和林- / C-KIT + / SCA 劳 -1（C-KIT +）细胞; C-套装+门，共同髓系祖细胞（中医）确定为FcγR 劳 CD34 +细胞，粒细胞/单核细胞祖细胞FcγR 您好 CD34 +细胞和巨核细胞/（绿化总纲图） FcγR 劳 CD34的红细胞祖细胞（MEPS） -细胞;从李嘉诚门，LT-HSC和ST-HSC的被确定为CD34的-和CD34 +细胞分别。可以丰富的骨髓细胞悬液，C-kit +细胞与磁珠（ 图2）; LT-HSC和ST-造血干细胞，然后可以根据CD34的表达，以及其他祖排序根据以上所述的表型。
造血干细胞可以是全日空在现场共聚焦显微镜成像lyzed显示在图4中 ，其中CD34的-细胞染色与核苷酸结合的复合奎纳克林11以及核红（DRAQ5）。在造血干细胞，但没有绿化总纲图，奎纳克林阳性囊泡可见细胞质中的12个月 。此外，排序的造血干细胞可用于功能的实验，图5表明，这表明在胞内Ca 2 + LT-HSC的嘌呤P2受体激活后，接触的增加，腺苷三磷酸（ATP）和离子霉素12。
图1。代表点积林骨髓细胞分析。电子门控过程识别和取得的造血祖细胞和造血干细胞从骨髓细胞悬液，流式细胞仪染色，在协议文本描述。
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图2：C-KIT +骨髓细胞的选择性富集的计划。
图3门李嘉诚电子CD34的细胞周期分析-文67抗体和DAPI染色与鸡传染性法氏囊病的健康对照组和小鼠造血干细胞。固定细胞裂解/修复和权限与FITC标记的Ki-67的和DAPI染色，在1微克/毫升的缓冲区透。骑自行车细胞几乎没有，如果在所有李嘉诚CD34的检测-造血干细胞车厢的12名健康对照。
图4实时成像流式细胞仪排序CD34的共聚焦显微镜-造血干细胞和核苷酸约束力的化合物的奎纳克林及核红（DRAQ5）染色的绿化总纲图。小象限显示奎纳克林POSitive囊泡检测造血干细胞的细胞质中，但没有绿化总纲图。
图5。胞浆Ca 2 +在海拔排序加载的Fura-2与ATP和ionomycin刺激造血干细胞。从单细胞的痕迹。细胞外ATP除了ATP的胞内Ca 2 +后显着增加的响应。
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Discussion
这里介绍的方法能够快速，准确的分析（ 图1）个别小鼠造血。在分析各种实验设置，包括小鼠模型炎症，自身免疫性疾病，免疫缺陷，退行性疾病，代谢性疾病和癌症，允许解决的病理条件下对造血功能的影响。 图3显示了电子门李嘉诚分析细胞周期活动 CD34 -从健康小鼠的细胞和小鼠炎症性肠病（IBD）的13 Ki-67的人与生物圈计划和DAPI染色。后者显示，在细胞周期的S / G2 / M期细胞显着增加。流式细胞仪分析表明T细胞介导的炎症影响HSC单车活动12。
磁标签和富集骨髓细胞与细胞表达C-套件组合排序流cytometrŸ允许高度纯化造血谱系祖细胞和造血干细胞的分离。获得的细胞群可以使用的检测数量，来研究细胞生物学（ 图4），信号转导（ 图5），发育调控基因表达， 在体外以及体内不同的细胞亚群的功能潜力。事实上，磁丰富的C-kit +细胞成功嫁接的非辐照的主机被用来研究在稳态和炎症14造血干细胞单车活动的动态变化。这里介绍的过程，在我们的手中，可以更加高效，快速，比平均产量200,000李嘉诚小鼠细胞冲洗骨骨髓细胞的恢复。极少数的静态，可以汇集多个小鼠骨髓中分离造血干细胞的实验方法，需要更多的细胞构成的限制。此限制，以避免在初步许多情况下，更丰富的李嘉诚细胞进行研究，可以设想更有针对性和准时分析在CD34 -静态造血干细胞。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢，仁泷泽伸之Onai和Markus曼茨宝贵意见。这项工作是由瑞士国家科学基金会，瑞士癌症联盟的Fondazione Ticinese每找实习SUL Cancro。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 | |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| PenStrep | Gibco | 15070 | |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 | |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 | |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 | |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 | |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 | |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 | |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 | |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 | |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 | |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 | |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 | |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 | |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 | |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 | |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
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