Summary
Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.
Abstract
Het beenmerg is de belangrijkste site waar HSC's en meer volwassen bloedcellen afkomst voorlopercellen verblijven en te differentiëren in een volwassen organisme. HSC's vormen een minuut celpopulatie van pluripotente cellen die in staat het genereren van alle bloed-cellijnen voor een life-time 1. De moleculaire dissectie van HSC homeostase in het beenmerg heeft belangrijke gevolgen voor hematopoiese, oncologie en regeneratieve geneeskunde. We beschrijven de etikettering protocol met fluorescente antilichamen en de elektronische gating procedure in flowcytometrie om hematopoietische voorlopercellen subsets en HSC's in individuele muizen (fig. 1) te scoren. Daarnaast beschrijven we een methode om op grote schaal verrijken hematopoietische voorlopercellen als lange termijn (LT) en korte termijn (ST) reconstructie van HSC uit gepoold beenmerg celsuspensies door magnetische verrijking van cellen die c-Kit. De resulterende cel preparaat kan worden gebruikt om geselecteerde subsets sorteren van in vitro enin vivo studies functionele (Fig. 2).
Beide trabeculaire osteoblasten 2,3 en sinusvormige endotheel 4 vormen functionele niches ondersteunen HSC's in het beenmerg. Een aantal mechanismen in de osteoblastische niche, met inbegrip van een deelverzameling van N-cadherine + osteoblasten 3 en interactie van de receptor tyrosine kinase Tie2 uitgedrukt in HSCs met zijn ligand angiopoietine-1 5 eens bij het bepalen van HSC rust. "Winterslaap" in het beenmerg is cruciaal voor HSC's te beschermen tegen de replicatie en de uiteindelijke uitputting na overmatige fietsen activiteit 6. Exogene stimuli die op cellen van het aangeboren immuunsysteem, zoals Toll-like receptor liganden 7 en interferon-α 6 kan proliferatie en differentiatie van HSC ook leiden tot geslacht toegewijd voorouders. Onlangs heeft een bevolking van slapende muis HSCs binnen de lin - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - de bevolking is beschreven 8. Het sorteren van cellen op basis van CD34 expressie van de hematopoietische voorlopercellen verrijkte celsuspensie zoals hier beschreven kan de isolatie van zowel latente zelfvernieuwende LT-HSC's en ST-HSCs 9. Een soortgelijke procedure op depletie van lijn positieve cellen en sorteren van LT-HSC met CD48 en Flk2 antilichamen is eerder beschreven 10. In dit rapport geven we een protocol voor de fenotypische karakterisatie en ex vivo celcyclus analyse van hematopoietische voorlopercellen, die nuttig kan zijn voor het toezicht hematopoiese in verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Bovendien beschrijven we een FACS sorteren procedure HSCs, die kunnen worden gebruikt om factoren en mechanismen reguleren van hun zelfvernieuwing expansie en differentiatie in celbiologie en signaaltransductie assays en voor transplantatie definiëren.
Protocol
1. Voorbereiding van de celsuspensie uit beenmerg
- Euthanaseren de muis en plaats het dier in een roestvrij pan en spuit 70% ethanol op zijn buik en rug. Verzamel dijbeen en het scheenbeen van de achterbenen en wervelkolom.
- Nauwkeurig verwijder al het zachte weefsel resten van de wervelkolom met een scherpe punt schaar en in de benen botten met een gaasje. Store botten in een 50 ml Falcon buis met 30 ml RPMI medium met 10% hitte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), aangevuld met 50 pM β-mercapto-ethanol, 100 uM MEM niet-essentiële aminozuren, 1 mM natriumpyruvaat MEM, 2 mM L-glutamine, 100 pg / ml streptomycine en 100 U / ml penicilline.
- Bedek de bodem van een gesteriliseerde mortel steriele filters.
- Breng de botten in de mortel bedekken met een laag filters om een wrijvingsvlak monteren.
- Bereid een 50 ml Falcon buis voorzien van een Falcon filter.
- Breek de bottenmet behulp van een stamper tot het verkrijgen van een homogene celsuspensie.
- Breng de suspensie in de buis.
- Voeg toe aan de mortel 5 ml vers RPMI compleet medium te wassen en te oogsten de overige cellen.
- Herhaal de laatste twee punten tot de gehomogeniseerde botten helder.
- Transfer en filteren in een nieuwe buis de celsuspensie om restmateriaal vuil te verwijderen.
- Centrifugeer de buis bij 1.500 toeren per minuut gedurende 5 minuten en voorzichtig het supernatant te verwijderen door aspiratie. Zorg ervoor dat niet naar de cel pellet te verstoren.
2. Fenotypische analyse
- Resuspendeer en wassen cellen van individuele muizen in 15 ml PBS en 2% FBS.
- Centrifugeer de buis bij 1.500 toeren per minuut gedurende 5 minuten en voorzichtig het supernatant te verwijderen door aspiratie. Zorg ervoor dat u de pellet te verstoren.
- Hang de pellet in 5 ml PBS en 2% FBS en aantal cellen.
- Transfer 1 x 10 6 cellen / putje in een 96 wells ronde bodemplaat.
- Centrifugeer de plaat bij 1.500 toeren per minuut gedurende 5 minuten.
- Bereid een mengsel van mAbs, gericht tegen het volgende oppervlaktemerkers. Verdun ze als vermeld in PBS en 2% FBS de cellen vlek.
- CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 geconjugeerd aan PE-Cy5 1:200
- c-Kit geconjugeerd aan APC 1:100
- SCA1 geconjugeerd aan biotine 01:50
- CD34 geconjugeerd aan FITC 01:50
- FcγR geconjugeerd aan PE 1:100
- IL-7R geconjugeerd aan PE-Cy7 1:100
- Verwijder het supernatant en voeg 50 ul van mAb's mix aan elk putje. Dissociate in enkele cellen door pipetteren.
- Incubeer cellen gedurende 20 minuten in het donker bij 4 ° C.
- Tweemaal wassen cellen met 150 pi PBS en 2% FBS.
- Centrifugeer de plaat bij 1.500 toeren per minuut gedurende 5 minuten Verwijder de bovenstaande vloeistof door het omkeren van de plaat.
- Verdun streptavidine in PBS en 2% FBS aangegeven om de cellen vlek.
- Streptavidine conjugated om APC-Cy7 1:300
- Voeg 50 ul van de oplossing in elk putje. Dissociate in enkele cel schorsing door pipetteren.
- Incubeer cellen gedurende 10 minuten in het donker bij 4 ° C.
- Tweemaal wassen cellen met 150 pi PBS en 2% FBS.
- Centrifugeer de plaat bij 1.500 toeren per minuut gedurende 5 minuten en gooi het supernatant.
- Resuspenderen cellen in 100 pi PBS en 2% FBS.
- Verwerven monsters FACS.
3. Magnetische Verrijking van c-Kit + cellen
- Bereid een bufferoplossing met PBS, pH 7,2, 0,5% runderserumalbumine (BSA), en 2 mM EDTA.
- Resuspendeer de celpellet van beenmerg afgeleid van tenminste 10 muizen in 1 ml van een bufferoplossing met c-kit mAb geconjugeerd APC 1:50 verdund.
- Incubeer cellen gedurende 20 minuten in het donker bij 4 ° C.
- Was tweemaal de cellen met 40 ml bufferoplossing.
- Centrifugeer de buis bij 1.500 toeren per minuut gedurende 5 minuten en verwijder voorzichtig thij supernatant door aspiratie. Zorg ervoor dat u de pellet te verstoren.
- Resuspendeer celpellet en 50 ul van Anti-APC microbolletjes direct toe te voegen voor elke euthanized muis om de pellet.
- Meng goed en incubeer gedurende 20 minuten in het donker bij 4 ° C.
- Was cellen door toevoeging 40 ml bufferoplossing en centrifuge bij 1500 rpm gedurende 5 minuten. Zuig volledig supernatant.
- Hersuspenderen celpellet in veelvoud van 4 ml bufferoplossing drie muizen euthanized.
- Place MACS LS kolommen in het magneetveld van een geschikte MACS Separator. Gebruik een kolom om de drie muizen euthanized.
- Bereid kolommen spoelen met 4 ml bufferoplossing.
- Breng celsuspensie op de kolommen.
- Verzamel ongelabelde cellen die passeren en was kolom met 4 ml bufferoplossing. Voer wasstappen door toevoeging van 4 ml bufferoplossing driemaal. Voeg nieuwe buffer wanneer de kolom reservoir leeg is.
- Verwijder kolommen uit de afscheider en place een ieder op de top van 15 ml Falcon buizen.
- Pipetteer 4 ml bufferoplossing op elke kolom. Onmiddellijk spoelen van de magnetisch gelabelde cellen door de zuiger in de kolom.
- Centrifugeer de buizen bij 1.500 toeren per minuut gedurende 5 minuten en voorzichtig het supernatant te verwijderen door aspiratie.
- Resuspenderen elke pellet met 1 ml van een bufferoplossing en groep pellets in een 15 ml Falcon buis.
4. Het sorteren van hematopoietische stamcellen en Lineage betrokken voorouders
- Bereid een mengsel van mAbs, gericht tegen het volgende oppervlaktemerkers. Verdun ze als vermeld in 500 pi PBS en 2% FBS de cellen vlek.
- CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 geconjugeerd aan PE-Cy5 1:200
- c-Kit geconjugeerd aan APC 1:100
- Sca-1 geconjugeerd aan biotine 01:50
- CD34 geconjugeerd aan FITC 01:50
- FcγR geconjugeerd aan PE 1:100
- Centrifugeer de buis van de eerder gemaaktes deel bij 1.500 toeren per minuut gedurende 5 minuten en voorzichtig het supernatant te verwijderen door aspiratie.
- Voeg de mAbs mengsel aan de pellet. Dissociate in enkele cel schorsing door pipetteren.
- Incubeer cellen gedurende 20 minuten in het donker bij 4 ° C.
- Was twee keer de cellen met 14ml van PBS en 2% FBS.
- Centrifugeer de buis bij 1.500 toeren per minuut gedurende 5 minuten en gooi het supernatant.
- Verdun streptavidine zoals in 500 pi PBS en 2% FBS de cellen vlek.
- Streptavidine geconjugeerd aan APC-Cy7 1:300
- Voeg de oplossing in de buis. Dissociate in enkele cel schorsing door pipetteren.
- Incubeer cellen gedurende 10 minuten in het donker bij 4 ° C.
- Was twee keer de cellen met 14 ml PBS en 2% FBS.
- Centrifugeer de buis bij 1.500 toeren per minuut gedurende 5 minuten en gooi het supernatant.
- Resuspenderen cellen in 500 pi PBS en 2% FBS.
- Overdracht en filteren van de celsuspensie in een nieuwe 5 mL buis om te eliminate mobiele aggregaten die kunnen interfereren met het sorteren procedure.
- Voeg 5 pi 7 AAD (gebruiken 1:100 verdund) aan de celsuspensie om 7 AAD + dode cellen sluiten van de gesorteerde populaties.
- Sorteer cellen met een BD FACSAria volgens de volgende fenotypes:
- LKS cellen: lin - c-Kit + Sca-1 +
- LT-HSCs: LKS CD34 -
- ST-HSCs: LKS CD34 +
- GMP: lin - c-Kit + Sca-1 lage FcγR hoge CD34 +
- EP-leden: lin - c-Kit + Sca-1 lage FcγR lage CD34 -
- CPM: lin - c-Kit + Sca-1 lage FcγR lage CD34 +
5. Representatieve resultaten
Figuur 1 toont en voorbeeld van het elektronisch gating procedurescore gemeenschappelijke lymfoïde voorlopers (CLPS) als Lin - / c-Kit lo / interleukine (IL)-7R + cellen; Lin - / c-Kit + / SCA-1 + (LKS) en Lin - / c-Kit + / Sca lo -1 (c-Kit +) cellen van de c-Kit + poort, worden gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CPM) geïdentificeerd als FcγR lo CD34 + cellen, granulocyten / monocyt voorlopers (GMP) als FcγR hi CD34 + cellen en megakaryocyt / erythrocyten voorlopers (MEP's) als FcγR lo CD34 - cellen van de LKS poort, LT-HSC en ST-HSC worden geïdentificeerd als CD34 - en CD34 + cellen, respectievelijk. Deze beenmerg celsuspensie worden verrijkt c-kit + cellen met magnetische korrels (Fig. 2) LT-HSC en ST-HSC kan vervolgens worden gesorteerd CD34 expressie en andere voorlopers volgens fenotype hierboven beschreven.
HSCs kan ana lyzed in levende imaging confocale microscopie zoals getoond in figuur 4, waarbij CD34 - cellen werden aangekleurd met de nucleotide-bindende verbinding chinacrine 11 en nucleaire rood (DRAQ5). In HSCs, maar niet GMP, chinacrine-positieve vesicles zichtbaar in het cytoplasma 12. Bovendien kan gesorteerd HSCs worden gebruikt functionele experimenten zoals in figuur 5, die de stijging van cytosolische Ca2 + LT-in HSC door activering van purinerge P2 receptoren bij blootstelling toont voor adenosine-trifosfaat (ATP) en ionomycine 12.
Figuur 1. Vertegenwoordiger dot plot analyse van de Lin-BM cellen. Elektronische gating procedure op flow cytometer te identificeren en scoren hematopoietische stamcellen en HSCs van beenmerg celsuspensie gekleurd zoals beschreven in de tekst protocol.
pload/3736/3736fig2.jpg "/>
Figuur 2. Een regeling voor selectieve verrijking van c-Kit + cellen uit het beenmerg.
Figuur 3 Celcyclus analyse van elektronisch gated LKS CD34 -. HSCs bij gezonde controles en muizen met IBD gekleurd met Ki-67 antilichaam en DAPI. Cellen werden gefixeerd en gepermeabiliseerd met Lyse / retoucheren en Perm buffers gevolgd door kleuring met FITC-geconjugeerd Ki-67 en DAPI bij 1 ug / ml. Fietsen cellen zijn nauwelijks of helemaal niet detecteerbaar in de LKS CD34 - HSC compartiment van gezonde controles 12.
. Figuur 4 live beeldvorming confocale microscopie van FACS gesorteerd CD34 - HSC's en GMP's gekleurd met de nucleotide-bindende verbinding quinacrine en nucleaire rood (DRAQ5). De kleine kwadranten tonen quinacrine postieve vesicles gedetecteerd in het cytoplasma van HSCs maar GMP.
Figuur 5. Cytosolic Ca 2 + verhogingen van de gesorteerde HSCs geladen met Fura-2 en gestimuleerd met ATP en ionomycine. Sporen uit enkele cellen worden weergegeven. Alle cellen werden reagerend op extracellulaire ATP met prominente toename cytosolische Ca2 + na toevoeging van ATP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode is een snelle en nauwkeurige analyse van hematopoiesis in individuele muizen (figuur 1). Deze analyse in verschillende experimentele instellingen, waaronder muismodellen van ontsteking, auto-immuniteit, immunodeficiëntie, degeneratieve ziekten, metabole aandoeningen en kanker, maakt het mogelijk om de gevolgen van pathologische condities op hematopoiese. Figuur 3 toont de analyse van cel fietsen activiteit op elektronisch gated LKS CD34 - cellen van gezonde muizen en muizen met een inflammatoire darmziekte (IBD) 13 door kleuring met Ki-67 MAB en DAPI. Deze laatste vertoonde een significante toename van cellen in S / G 2 / M fasen van de celcyclus. Deze analyse in flowcytometrie toont de impact van de T-cel gemedieerde ontsteking op HSC fietsen activiteit 12.
Combinatie van magnetische etikettering en de verrijking van beenmerg cellen die c-Kit met celsortering in flow cytometry kan isolatie van sterk gezuiverd hematopoietische stam voorlopers en HSC. De verkregen celpopulaties kan worden gebruikt in een aantal analyses te celbiologie (figuur 4), signaaltransductie (figuur 5), ontwikkelingsgewijs gereguleerde genexpressie en in vitro als in vivo functionele mogelijkheden verschillende celpopulaties bestuderen. Inderdaad, werden magnetisch verrijkt c-Kit + cellen die worden gebruikt om met succes inenten niet-bestraalde hosts om dynamische variatie van HSC fietsen activiteit studeren in steady-state en ontsteking 14. In onze handen de hier beschreven procedure, des te efficiënter en sneller herstel van beenmergcellen dan bot te spoelen met een gemiddelde opbrengst van 200.000 LKS cellen per muis. De zeer kleine aantal latente HSC's die kunnen worden geïsoleerd uit gepoold beenmerg van meerdere muizen vormt een limiet voor experimentele benaderingen die meer cellen. Om te voorkomen deze beperking, in veel gevallen eerstestudies kunnen worden uitgevoerd op meer overvloedig LKS cellen om meer gerichte en tijdige analyses uit te voeren in CD34 overwegen - rustig HSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa en Markus Manz voor het kostbare advies. Dit werk werd gefinancierd door de Zwitserse National Science Foundation, de Zwitserse Liga tegen Kanker en de Fondazione Ticinese per la ricerca sul Cancro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 | |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| PenStrep | Gibco | 15070 | |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 | |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 | |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 | |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 | |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 | |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 | |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 | |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 | |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 | |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 | |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 | |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 | |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 | |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 | |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
- Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-161 (2004).
- Essers, M. A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, 904-908 (2009).
- Nagai, Y. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity. 24, 801-812 (2006).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, 1118-1129 (2008).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Lo Celso, C., Scadden, D., D, Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs. J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).
- Romanello, M. Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).
- Casati, A. Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).
- Bouma, G., Strober, W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).
- Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation. J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).
