Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

doi: 10.3791/3736 Published: July 8, 2012

Summary

שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.

Abstract

מח העצם הוא האתר העיקרי שבו HSCs ובוגרת יותר כדוריות הדם אבות השושלת מתגוררים ולהבחין באורגניזם הבוגר. HSCs מהווים אוכלוסייה תא גזע pluripotent דקה של תאים המסוגלים לייצר את כל שושלות תאים דם בפעם חיים 1. דיסקציה המולקולרי של הומאוסטזיס HSCs במח העצם יש השלכות חשובות hematopoiesis, אונקולוגיה ורפואה רגנרטיבית. אנו מתארים את פרוטוקול סימון נוגדנים הניאון הליך gating אלקטרוני cytometry זרימת להבקיע תת אבות היווצרות הדם והפצה HSCs בעכברים בודדים (איור 1). בנוסף, אנו מתארים שיטה בהרחבה להעשיר אבות hematopoietic כמו גם לטווח ארוך (LT) ו לטווח קצר (ST) לשחזר HSCs מ אספו מח עצם השעיות התא על ידי העשרת המגנטי של תאים המבטאים C-Kit. הכנת התא וכתוצאה מכך ניתן להשתמש כדי למיין תת שנבחרו במבחנהבמחקרים תפקודית ב vivo (איור 2).

שני osteoblasts trabecular 2,3 ו -4 האנדותל סינוסי מהוות נישות תפקודית התומכים HSCs במח העצם. מספר מנגנונים בנישה osteoblastic, כולל משנה של N-cadherin + osteoblasts 3 ואינטראקציה של הקולטן טירוזין קינאז Tie2 לידי ביטוי HSCs עם angiopoietin-1 ליגנד שלה 5 מסכים בקביעת קפאון HSCs. "מצב שינה" במח העצם הוא חיוני כדי להגן על HSCs מ שכפול תשישות בסופו של דבר על פעילות רכיבה על אופניים יתר 6. גירויים חיצוניים הפועלים על תאים של מערכת החיסון המולדת כגון חיוג כמו ligands הקולטן 7 ו אינטרפרון אלפא-6 יכול גם לגרום ריבוי והתמיינות של HSCs לתוך אבות מסורים השושלת. לאחרונה, אוכלוסיית HSCs עכבר רדומים בתוך לין - C-Kit + SCA-1 + CD150 + CD48 - CD34 - האוכלוסייה תוארה 8. מיון של התאים על ביטוי CD34 מן ההשעיה אבות מועשר hematopoietic התא כמתואר כאן מאפשר בידוד של שניהם שוקט עצמית חידוש LT-HSCs ו ST-HSCs 9. הליך דומה על דלדול של תאים החיוביים השושלת ומיון של LT-HSC עם CD48 ו Flk2 נוגדנים תוארה קודם לכן 10. בדו"ח הנוכחי אנו מספקים פרוטוקול אפיון פנוטיפי ו vivo לשעבר לתא מחזור ניתוח של אבות היווצרות הדם, אשר יכול להיות שימושי עבור ניטור hematopoiesis בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. יתר על כן, אנו מתארים FACS מיון הליך HSCs, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להגדיר את גורמי ומנגנוני ויסות עצמי חידוש שלהם, הרחבת והבחנה בביולוגיה של התא התמרה מבחני אות כמו גם להשתלה.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת תרחיף תאים ממח העצם

  1. להרדים את העכבר ולמקם את בעל החיים בסיר נירוסטה ואתנול ספריי 70% על הבטן ועל הגב. איסוף עצם הירך לבין עצם השוק מן הרגליים האחוריות, ואת עמוד השדרה.
  2. להסיר את כל שאריות מדויק של רקמות רכות של עמוד השדרה עם מספריים קצה חד לבין מעצמות הרגליים עם גזה. חנות הכלים צינור 50 פלקון מ"ל עם 30 מ"ל של מדיום RPMI המכיל 10% מומת חום בסרום שור עוברית (FBS), השלימו עם 50 mercaptoethanol β-מיקרומטר, 100 מיקרומטר ממ לא חיוניות חומצות אמינו, 1 MEM mM פירובט נתרן, 2 mM L-גלוטמין, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - 100 סטרפטומיצין U / ml פניצילין.
  3. מכסים את תחתית מרגמה מעוקר בעבר עם מסנני סטריליים.
  4. מעבירים את העצמות אל תוך המדוכה ומכסים אותם בשכבה של מסננים על מנת להרכיב שטח החיכוך.
  5. הכן 50 מ"ל צינור פלקון מסופק עם מסנן פלקון.
  6. לרסק את העצמותבעזרת העלי עד קבלת ההשעיה התא הומוגנית.
  7. מעבירים את ההשעיה לתוך הצינור.
  8. הוסף מ"ל מרגמה 5 של המדיום RPMI טרי שלם לכבס למסוק את התאים הנותרים.
  9. חזור על שתי הנקודות האחרונות עד עצמות ומעורים נראה ברור.
  10. להעביר ולסנן בצינור חדש ההשעיה התא כדי לחסל את פסולת ברקמות הנותרים.
  11. בצנטריפוגה צינור בסל"ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע תא גלולה.

2. פנוטיפי ניתוח

  1. Resuspend ולשטוף בתאים של עכברים בודדים 15 מ"ל של PBS ו FBS 2%.
  2. בצנטריפוגה צינור בסל"ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה.
  3. להשעות גלולה של 5 מ"ל PBS ו 2% FBS ותאי הספירה.
  4. העברת 1 × 10 6 תאים / גם בתחתית בארות 96 עגולצלחת.
  5. בצנטריפוגה צלחת בסל"ד 1500 דקות 5.
  6. להכין תערובת של מבז המכוונים נגד סמני פני הבאים. לדלל אותם המצוין PBS ו - 2% FBS להכתים את התאים.
    • CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 מצומדות ל PE-Cy5 1:200
    • C-Kit מצומדות כדי APC 1:100
    • מצומדות כדי ביוטין 1:50 Sca1
    • מצומדות כדי FITC 1:50 CD34
    • מצומדות כדי PE 1:100 FcγR
    • IL-7R מצומדות ל PE-Cy7 1:100
  7. מחק supernatant ולהוסיף 50 μL תמהיל מבז היטב כל אחד מהם. לנתק לתוך תאים בודדים ידי pipetting.
  8. דגירה תאים עבור 20 דקות בחושך ב 4 ° C.
  9. לשטוף את התאים פעמיים עם μL 150 של PBS ו 2% FBS.
  10. בצנטריפוגה צלחת בסל"ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant ידי צלחת היפוך.
  11. לדלל streptavidin ב PBS ו - 2% FBS כמצוין להכתים את התאים.
    • Streptavidin conjuמגודרת כדי APC-Cy7 1:300
  12. הוסף 50 μL הפתרון היטב כל אחד מהם. לנתק את ההשעיה תא בודד על ידי pipetting.
  13. דגירה תאים עבור 10 דקות בחושך ב 4 ° C.
  14. לשטוף את התאים פעמיים עם μL 150 של PBS ו 2% FBS.
  15. בצנטריפוגה צלחת בסל"ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant.
  16. Resuspend תאים μL 100 של PBS ו FBS 2%.
  17. להשיג דגימות ב FACS.

3. העשרה המגנטי של C-Kit + תאים

  1. הכן פתרון מאגר המכיל PBS, pH 7.2, 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA), ו 2 mM EDTA.
  2. Resuspend תא גלולה של העצם הדלועים נגזר לפחות 10 עכברים 1 מ"ל של תמיסת מאגר המכיל C-Kit MAB מצומדות כדי APC בדילול 1:50.
  3. דגירה תאים עבור 20 דקות בחושך ב 4 ° C.
  4. לשטוף פעמיים את התאים עם 40 מ"ל של תמיסת המאגר.
  5. בצנטריפוגה צינור בסל"ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר tהוא supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה.
  6. Resuspend תא גלולה ולהוסיף 50 μl של Anti-APC microbeads על העכבר בכל להרדים ישירות גלולה.
  7. מערבבים היטב דגירה של 20 דקות בחושך ב 4 ° C.
  8. לשטוף את התאים על ידי הוספת 40 מ"ל של תמיסת חיץ צנטריפוגות בסל"ד 1500 דקות 5. Aspirate supernatant לחלוטין.
  9. Resuspend תא גלולה ב כפולה של 4 מ"ל של הפתרון למאגר כל שלושה עכברים להרדים.
  10. מקום MACS טורים LS בשדה המגנטי של מפריד MACS מתאים. 1 השתמש בעמודה אחת לשלושה עכברים להרדים.
  11. הכינו עמודות על ידי שטיפה עם 4 מ"ל של תמיסת חיץ.
  12. החל ההשעיה התא על העמודים.
  13. איסוף התאים שהוסרו מהן תוויות העוברים ולשטוף טור עם 4 מ"ל של תמיסת המאגר. לבצע פעולות כביסה ידי הוספת 4 מ"ל של תמיסת חיץ שלוש פעמים. הוסף חוצץ חדש כאשר המאגר טור מתרוקנת.
  14. הסרה של עמודות מ מפריד ו placה כל אחד על גבי 15 צינורות מ"ל פלקון.
  15. פיפטה 4 מ"ל של תמיסת חיץ על כל עמודה. מיד לשטוף את התאים המסומנים מגנטית על ידי לחיצה על הבוכנה לתוך הטור.
  16. בצנטריפוגה צינורות בסל"ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה.
  17. Resuspend כל גלולה עם 1 מ"ל של תמיסת חיץ כדורי קבוצתיות צינור יחיד פלקון 15 מ"ל.

4. מיון של בתאי גזע hematopoietic ואת אבות מסורים השושלת

  1. להכין תערובת של מבז המכוונים נגד סמני פני הבאים. לדלל אותם כפי שעולה 500 PBS μL ו FBS 2% להכתים את התאים.
    • CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 מצומדות ל PE-Cy5 1:200
    • C-Kit מצומדות כדי APC 1:100
    • SCA-1 מצומדות כדי ביוטין 1:50
    • מצומדות כדי FITC 1:50 CD34
    • מצומדות כדי PE 1:100 FcγR
  2. בצנטריפוגה צינור מ לשנים הקודמותשל סעיף בסל"ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה.
  3. מוסיפים את תערובת מבז כדי גלולה. לנתק את ההשעיה תא בודד על ידי pipetting.
  4. דגירה תאים עבור 20 דקות בחושך ב 4 ° C.
  5. לשטוף פעמיים את התאים עם 14mL של PBS ו FBS 2%.
  6. בצנטריפוגה צינור בסל"ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant.
  7. לדלל streptavidin כמפורט 500 PBS μL ו 2% FBS להכתים את התאים.
    • Streptavidin מצומדות כדי APC-Cy7 1:300
  8. הוסף הפתרון הצינור. לנתק את ההשעיה תא בודד על ידי pipetting.
  9. דגירה תאים עבור 10 דקות בחושך ב 4 ° C.
  10. לשטוף פעמיים את התאים עם 14 מ"ל של PBS ו - 2% FBS.
  11. בצנטריפוגה צינור בסל"ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant.
  12. Resuspend תאים μL 500 של PBS ו FBS 2%.
  13. להעביר ולסנן את ההשעיה תא צינור חדש 5 מ"ל כדי אליminate אגרגטים הסלולר זה יכול להפריע הליך המיון.
  14. הוסף 5 μL של 7-AAD (להשתמש בו בדילול 1:100) על השעיית התא על מנת להוציא 7-AAD + מתים תאים ממוינים האוכלוסיות.
  15. מיין תאים עם FACSAria BD פי פנוטיפים את הבאים:
    • LKS תאים: לין - C-Kit + SCA-1 +
    • LT-HSCs: LKS CD34 -
    • ST-HSCs: LKS CD34 +
    • GMPs: לין - C-Kit + SCA-1 FcγR נמוכה גבוהה CD34 +
    • חברי הפרלמנט האירופי: לין - C-Kit + SCA-1 FcγR נמוך נמוך CD34 -
    • CMPs: לין - C-Kit + SCA-1 FcγR נמוך נמוך CD34 +

5. נציג תוצאות

איור 1 מציג ודוגמא הליך gating אלקטרונייםהנפוצים הציון אבות הלימפה (CLPs) כמו - לין / c-Kit וראה זה / אינטרלוקין (IL)-7R + תאים, לין - / c-Kit + / SCA-1 + (LKS) ולין - / c-Kit + / SCA וראה זה -1 (C-Kit +) תאים, מ C-Kit + שער, אבות מיאלואידית משותף (CMPs) מזוהים FcγR וראה זה CD34 + תאים, אבות granulocyte / מונוציטים (GMPs) כמו FcγR היי CD34 + תאים megakaryocyte / אבות כדורית אדומה (חברי הפרלמנט האירופי) כמו FcγR Lo CD34 - תאים, משער LKS, LT-HSC ו ST-HSC מזוהים CD34 - ו CD34 + תאים, בהתאמה. מח העצם זו ההשעיה התא יכול להיות מועשר על C-Kit + תאים עם חרוזים מגנטיים (איור 2): LT-HSC ו ST-HSC לאחר מכן ניתן למיין על פי ביטוי CD34, כמו גם אבות אחרים על פי הפנוטיפ המתואר לעיל.

HSCs יכולה להיות אנה lyzed במיקרוסקופ הדמיה חיה confocal כפי שמוצג באיור 4, שם CD34 - תאים הוכתמו מתחם נוקלאוטיד מחייב quinacrine 11 כמו גם הגרעין האדום (DRAQ5). ב HSCs, אבל לא GMPs, quinacrine חיובי שלפוחית ​​נראים 12 הציטופלסמה. יתר על כן, HSCs מיון יכול לשמש בניסויים פונקציונליים כמו הפגינו 5 דמות, אשר מציג את העלייה cytosolic Ca 2 + ב HSC-LT ידי הפעלת קולטנים-P2 purinergic בחשיפה טריפוספט-אדנוזין (ATP) ו ionomycin 12.

איור 1
באיור 1. נציג ניתוח נקודה העלילה של לין-BM תאים. הליך gating אלקטרונית על cytometer זרימת לזהות להבקיע אבות hematopoietic ו HSCs מן ההשעיה מח עצם התא מוכתם כמתואר בטקסט פרוטוקול.

pload/3736/3736fig2.jpg "/>
איור 2. תוכנית להעשרת סלקטיבית של C-Kit + תאים ממח העצם.

איור 3
איור 3 מחזור התא ניתוח אלקטרונית LKS סגורות CD34 -. HSCs ב בריאים ועכברים עם IBD מוכתמים נוגדנים-67 קי ו DAPI. התאים היו קבועים permeabilized עם Lyse / תקן ו פרם מאגרים ואחריו מכתים עם מצומדות FITC Ki-67 ו DAPI ב 1 מיקרוגרם / מ"ל. תאים רכיבה הם בקושי אם בכלל לזיהוי LKS CD34 - תא HSCs של פקדים בריא 12.

איור 4
. איור 4 לחיות מיקרוסקופיה הדמיה confocal של FACS מיון CD34 - HSCs ו GMPs מוכתמים quinacrine נוקלאוטיד מחייב את המתחם הגרעיני ואדום (DRAQ5). את הרביעים קטנים להראות quinacrine קופהשלפוחית ​​itive זוהה בציטופלסמה של HSCs אך לא GMPs.

איור 5
איור 5. Cytosolic Ca 2 + עליות HSCs מיון עמוסות פורעה-2 ו מגורה עם ה-ATP ו ionomycin. עקבות של תאים בודדים מוצגים. כל התאים היו מגיבים ATP תאי מראה עלייה בולטת cytosolic Ca 2 + אחרי תוספת של ATP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח מהיר ומדויק של hematopoiesis בעכברים בודדים (איור 1). זה ניתוח במסגרות ניסיוניות שונות, כולל מודלים Murine של דלקת, אוטואימוניות, כשל חיסוני, מחלות ניווניות, הפרעות מטבוליות וסרטן, מאפשרת מענה את ההשפעה של התנאים פתולוגיים על hematopoiesis. איור 3 מציג ניתוח של פעילות רכיבה על התא LKS מגודרת באופן אלקטרוני CD34 - תאים בעכברים בריאים ועכברים עם מחלות מעי דלקתיות (IBD) 13 על ידי מכתימה עם Ki-67 מב ו DAPI. זה האחרון להציג גידול משמעותי של תאים S / G 2 / M שלבי מחזור התא. זה ניתוח cytometry זרימת מדגים את ההשפעה של דלקת תא T מתווכת על פעילות רכיבה על אופניים HSC 12.
שילוב של תיוג מגנטי והעשרה של תאים במח העצם ביטוי c-Kit עם תא ומיון cytometr זרימתy מאפשר בידוד של מטוהרים מאוד אבות היווצרות הדם ואת השושלת HSCs. האוכלוסיות סלולריים שהתקבלו ניתן להשתמש במספר מבחני ללמוד ביולוגיה של התא (איור 4), התמרה האות (איור 5), ביטוי גנים מוסדר מבחינה התפתחותית ו במבחנה, כמו גם בפוטנציאל תפקודית vivo של תת תאים נפרדים. אכן, מועשר מגנטית C-Kit + התאים שימשו לא מוקרן המארחים נקלטים בהצלחה ללמוד וריאציה דינמי של פעילות רכיבה על אופניים HSCs במצב יציב דלקת 14. בידינו ההליך המתואר כאן מאפשר התאוששות יעילה יותר ומהירה יותר של תאים במח העצם מאשר עצם שטיפה עם תשואה ממוצעת של 200,000 תאים LKS לכל עכבר. מספר קטן מאוד של HSCs הצייתניים כי יכול להיות מבודד קישואים אספו עצם של עכברים רבים מהווה מגבלה עבור גישות ניסיוניות הדורשים תאים נוספים. כדי לייתר את מגבלה זו, במקרים רבים ראשונייםמחקרים ניתן לבצע על שפע תאים LKS יותר לדמיין ניתוח ממוקד יותר דייקן שיבוצעו ב - CD34 HSCs הצייתניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Acknowledgments

אנו מודים Nobuyuki Onai, היטושי Takizawa ומרקוס Manz לייעוץ יקר. עבודה זו מומנה על ידי השוויצרי הקרן הלאומית למדע, השוויצרי סרטן הליגה Fondazione Ticinese לכל la RIcerca sul Cancro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Gibco 42401
MEM NEAA 100X Gibco 11140
Sodium Pyruvate Gibco 11360
PenStrep Gibco 15070
PBS Gibco 20012
FBS Gibco 16000
Cell Strainer 40 μm BD Falcon 352340
7-AAD Staining solution BD Pharmingen 559925
Lyse/Fix buffer BD Pharmingen 558049
Perm buffer III BD Pharmingen 558050
Ki-67 BD Pharmingen 556026
DAPI Invitrogen D21490
CD4 (GK1.5) eBioscience 150041
CD8 (53-6.7) eBioscience 150081
CD3 (145-2C11) eBioscience 150031
CD45R (RA3-6B2) eBioscience 150452
CD19 (6D5) eBioscience 150193
Gr1 (RB6-8C5) eBioscience 155931
Tre119 (TER-119) eBioscience 155921
NK-1.1 (PK136) eBioscience 455941
c-Kit (2B8) eBioscience 171171
Sca-1 (D7) eBioscience 135981
CD34 (RAM34) eBioscience 110341
FcγR (2.4G2) eBioscience 553145
Anti-APC MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-855
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
  3. Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
  4. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  5. Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-161 (2004).
  6. Essers, M. A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, 904-908 (2009).
  7. Nagai, Y. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity. 24, 801-812 (2006).
  8. Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, 1118-1129 (2008).
  9. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
  10. Lo Celso, C., Scadden, D., D, Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs. J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).
  11. Romanello, M. Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).
  12. Casati, A. Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).
  13. Bouma, G., Strober, W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).
  14. Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation. J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).
ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors. J. Vis. Exp. (65), e3736, doi:10.3791/3736 (2012).More

Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors. J. Vis. Exp. (65), e3736, doi:10.3791/3736 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter