Summary
Un método para analizar la distribución de progenitores hematopoyéticos de médula ósea en citometría de flujo, así como para aislar eficazmente altamente purificadas células madre hematopoyéticas (HSC) se describe. El procedimiento de aislamiento se basa esencialmente en el enriquecimiento magnética de c-kit + células y células de clasificación para purificar las CMH para los estudios celulares y moleculares.
Abstract
La médula ósea es el lugar principal donde las CMH y más maduras las células sanguíneas progenitoras de linaje residen y se diferencian en un organismo adulto. CMH constituyen una población de células minuto de células pluripotentes, capaces de generar todos los linajes de células sanguíneas para un tiempo de vida 1. La disección molecular de la homeostasis del CMH en la médula ósea tiene implicaciones importantes en la hematopoyesis, oncología y medicina regenerativa. Se describe el protocolo de etiquetado con anticuerpos fluorescentes y el procedimiento de puerta electrónica en citometría de flujo para anotar subconjuntos progenitoras hematopoyéticas y distribución HSCs en ratones individuales (Fig. 1). Además, se describe un método para enriquecer ampliamente progenitores hematopoyéticos, así como a largo plazo (LT) ya corto plazo (ST) la reconstitución de HSCs agrupados de suspensiones de células de médula ósea por enriquecimiento magnética de las células que expresan c-kit. La preparación de células resultante se puede utilizar para ordenar los subconjuntos seleccionados para in vitro een estudios in vivo funcionales (fig. 2).
Tanto los osteoblastos trabeculares 2,3 y 4 endotelio sinusoidal constituyen nichos funcionales de apoyo CMH en la médula ósea. Hay varios mecanismos que en el nicho de los osteoblastos, como un subconjunto de N-cadherina + 3 osteoblastos y la interacción de la Tie2 tirosina quinasa del receptor se expresa en las CMH con su angiopoyetina-1 ligando 5 de acuerdo en la determinación de la quietud CMH. "Hibernación" en la médula ósea es crucial para proteger a las HSCs de replicación y eventual agotamiento en la actividad un ciclo excesivo 6. Estímulos exógenos que actúan sobre las células del sistema inmune innato como ligandos de los receptores Toll-like 7 y el interferón-alfa 6 también se puede inducir la proliferación y diferenciación de las CEH en el linaje de los progenitores comprometidos. Recientemente, una población de HSC de ratón latentes dentro de la lin - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - la población ha sido descrito 8. Clasificación de las células CD34 sobre la base de expresión de la suspensión de células hematopoyéticas progenitoras enriquecido como se ha descrito aquí permite el aislamiento de ambos quiescente autorrenovación LT-HSC y ST-CMH 9. Un procedimiento similar basado en el agotamiento de linaje de células positivas y la clasificación de LT-HSC con CD48 y Flk2 anticuerpos ha sido descrita previamente 10. En el presente informe se proporciona un protocolo para la caracterización fenotípica y ex vivo de células análisis del ciclo de progenitores hematopoyéticos, que pueden ser útiles para el seguimiento de la hematopoyesis en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. Además, se describe un FACS sorting procedimiento para CMH, que pueden ser utilizados para definir los factores y mecanismos que regulan su auto-renovación, expansión y diferenciación en la biología celular y ensayos de transducción de señales, así como para el trasplante.
Protocol
1. Preparación de la suspensión de la célula de la médula ósea
- Practicar la eutanasia con el ratón y colocar al animal en una sartén inoxidable y el etanol de pulverización 70% sobre su abdomen y la espalda. Recoger fémur y la tibia de las patas traseras, y la columna vertebral.
- Con precisión todos los residuos de los tejidos blandos de la columna vertebral con unas tijeras de punta afilados y de los huesos de las piernas con una gasa. Huesos en tienda a un tubo Falcon de 50 ml con 30 ml de medio RPMI que contenía 10% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), suplementado con 50 mM β-mercaptoetanol, 100 uM MEM no aminoácidos esenciales, 1 mM de piruvato sódico MEM, 2 mM de L-glutamina, 100 ug / ml de estreptomicina y penicilina 100 U / ml.
- Cubrir el fondo de un mortero previamente esterilizado con filtros estériles.
- Transferencia de los huesos en el mortero y los cubren con una capa de filtros con el fin de montar una superficie de fricción.
- Preparar un tubo Falcon de 50 ml provisto de un filtro de Falcon.
- Rompe los huesoscon la ayuda de una mano de mortero hasta obtener una suspensión celular homogénea.
- Transferir la suspensión en el tubo.
- Añadir al mortero 5 ml de medio RPMI completo fresco para lavar y recoger las células restantes.
- Repita los dos últimos puntos hasta que los huesos homogeneizados parece clara.
- Transferir y filtrar en un tubo nuevo la suspensión de células a fin de eliminar los restos de tejido restante.
- Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 5 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento celular.
2. El análisis fenotípico
- Resuspender y lavar las células de ratones individuales en 15 ml de PBS y FBS al 2%.
- Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 5 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento.
- Suspender el precipitado en 5 ml de PBS y 2% de FBS y cuentan las células.
- Transferencia de 1 × 10 6 células / pocillo en un fondo de 96 pozos de todo elplato.
- Centrifugar la placa a 1.500 rpm durante 5 min.
- Preparar una mezcla de mAbs dirigidos contra los siguientes marcadores de superficie. Diluir como se indica en PBS y 2% de FBS para teñir las células.
- CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 conjugados con PE-Cy5 1:200
- c-Kit conjugado a APC 1:100
- Conjugado con biotina 1:50 Sca1
- Conjugado con FITC 1:50 CD34
- FcγR conjugado a PE 1:100
- La IL-7R conjugado con PE-Cy7 1:100
- Se desecha el sobrenadante y se añaden 50 l de mezcla mAbs a cada pocillo. Se disocian en células individuales con la pipeta.
- Se incuban las células durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C.
- Lavar las células dos veces con 150 l de PBS y 2% de FBS.
- Centrifugar la placa a 1.500 rpm durante 5 min y descartar el sobrenadante invirtiendo la placa.
- Diluir estreptavidina en PBS y 2% de FBS, como se indica para teñir las células.
- Estreptavidina conjugadacerrada a APC-Cy7 1:300
- Añadir 50 l de la solución a cada pocillo. Se disocian en suspensión de células individuales con la pipeta.
- Se incuban las células durante 10 minutos en la oscuridad a 4 ° C.
- Lavar las células dos veces con 150 l de PBS y 2% de FBS.
- Centrifugar la placa a 1.500 rpm durante 5 min y descartar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 100 l de PBS y FBS al 2%.
- Adquirir muestras en FACS.
3. Enriquecimiento magnética de c-Kit + en las células
- Preparar una solución tampón que contenía PBS, pH 7,2, 0,5% albúmina de suero bovino (BSA), y 2 mM de EDTA.
- Resuspender el sedimento celular del hueso médulas derivado de al menos 10 ratones en 1 ml de solución tampón que contiene c-Kit conjugado a APC AcMo diluido 1:50.
- Se incuban las células durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C.
- Lavar dos veces las células con 40 ml de solución tampón.
- Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 5 minutos y retirar con cuidado tque sobrenadante por aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento.
- Resuspender pellet de células y se añaden 50 l de anti-APC MicroBeads para cada ratón sacrificados directamente a la pastilla.
- Mezclar bien e incubar durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C.
- Lavar las células mediante la adición de 40 ml de solución tampón y se centrifuga a 1.500 rpm durante 5 min. Aspirar el sobrenadante por completo.
- Resuspender el sedimento celular en múltiplo de 4 ml de solución tampón cada tres ratones sacrificados.
- MACS Place columnas LS en el campo magnético de un separador MACS adecuado. Utilice una columna de cada tres ratones sacrificados.
- Preparar las columnas de un enjuague con 4 ml de solución tampón.
- Aplicar suspensión celular en las columnas.
- Recoger las células no marcadas que pasan a través y lavar la columna con 4 ml de solución tampón. Realizar pasos de lavado mediante la adición de 4 ml de solución tampón de tres veces. Añadir nuevo buffer cuando el depósito se vacía en la columna.
- Quitar columnas del separador y place cada uno en la parte superior de 15 mL tubos Falcon.
- Pipetear 4 ml de solución tampón en cada columna. Inmediatamente enjuagar las células marcadas magnéticamente, empujando el émbolo en la columna.
- Centrifugar los tubos a 1.500 rpm durante 5 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración.
- Resuspender cada pellet con 1 ml de solución tampón y pellets de grupo en un solo tubo de 15 ml de halcón.
4. Clasificación de las células madre hematopoyéticas y Lineage Progenitores comprometidos
- Preparar una mezcla de mAbs dirigidos contra los siguientes marcadores de superficie. Diluir como se indica en 500 l de PBS y FBS al 2% para teñir las células.
- CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 conjugados con PE-Cy5 1:200
- c-Kit conjugado a APC 1:100
- Sca-1 conjugado con biotina 1:50
- Conjugado con FITC 1:50 CD34
- FcγR conjugado a PE 1:100
- Centrifugar el tubo de la previous la sección a 1.500 rpm durante 5 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración.
- Añadir la mezcla de mAb a la pastilla. Se disocian en suspensión de células individuales con la pipeta.
- Se incuban las células durante 20 minutos en la oscuridad a 4 ° C.
- Lavar dos veces las células con 14 ml de PBS y FBS al 2%.
- Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 5 min y descartar el sobrenadante.
- Diluir estreptavidina como se indica en 500 l de PBS y 2% de FBS para teñir las células.
- Estreptavidina conjugada con APC-Cy7 1:300
- Añadir la solución al tubo. Se disocian en suspensión de células individuales con la pipeta.
- Se incuban las células durante 10 minutos en la oscuridad a 4 ° C.
- Lavar dos veces las células con 14 ml de PBS y 2% de FBS.
- Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 5 min y descartar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 500 l de PBS y FBS al 2%.
- Transferir y filtrar la suspensión de células en un tubo nuevo ml 5 con el fin de Eliminate agregados celulares que pueden interferir con el proceso de selección.
- Añadir 5 l de 7-AAD (utilizarlo diluido 1:100) a la suspensión celular con el fin de excluir 7-AAD + las células muertas de las poblaciones ordenados.
- Clasificar las células con un FACSAria BD de acuerdo con los siguientes fenotipos:
- LKS células: LIN - c-Kit + Sca-1 +
- LT-HSC: LKS CD34 -
- ST-HSC: LKS CD34 +
- BPM: Lin - c-Kit + Sca-1 baja FcγR alta CD34 +
- Diputados al Parlamento Europeo: Lin - c-Kit + Sca-1 baja FcγR baja CD34 -
- CMP: Lin - c-Kit + Sca-1 baja FcγR baja CD34 +
5. Los resultados representativos
La figura 1 muestra y el ejemplo del procedimiento de puerta electrónica apuntuación progenitores linfoides comunes (CLPS) como Lin - / c-Kit altas / interleuquina (IL)-7R + en las células; Lin - / c-kit + / Sca-1 + (LKS) y Lin - / c-Kit + / Sca -1 LO (c-Kit +) las células, desde el c-Kit + puerta, comunes progenitores mieloides (CMPS) se identifican como FcγR lociones células CD34 +, progenitores de granulocitos / monocitos (BPF), FcγR hi células CD34 + y megacariocitos / progenitores de eritrocitos (los diputados) como FcγR he CD34-células, desde la puerta de LKS, LT y ST-HSC HSC-se identifican como CD34 - y CD34 + en las células, respectivamente. Esta suspensión celular de médula ósea puede ser enriquecido para c-Kit + en las células con perlas magnéticas (Fig. 2); LT-HSC y ST-HSC puede ser clasificado de acuerdo a la expresión CD34, así como otros progenitores de acuerdo con el fenotipo descrito anteriormente.
HSC puede ser ana lyzed en microscopía confocal de imágenes en vivo como se muestra en la Figura 4, donde CD34 - células se tiñeron con el compuesto de unión a nucleótidos quinacrina 11, así como nuclear rojo (DRAQ5). En CMH, pero no BPF, quinacrina-positivas vesículas son visibles en el citoplasma 12. Además, las CMH ordenados puede ser utilizado en los experimentos funcionales como se demuestra en la figura 5, que muestra el aumento de Ca 2 + citosólico en LT-HSC por la activación de los receptores purinérgicos P2 a la exposición a la adenosina-trifosfato (ATP) y ionomicina 12.
Figura 1. Representante de análisis gráfico de puntos de Lin-BM células. Procedimiento de puerta electrónica en citómetro de flujo para identificar y anotar progenitores hematopoyéticos y HSCs de suspensión de células de médula ósea tiñeron como se describe en el texto del protocolo.
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Figura 2. Un esquema de enriquecimiento selectivo de c-Kit + en las células de la médula ósea.
Figura 3 Análisis del ciclo celular de la electrónica LKS cerradas CD34 -. CMH en los controles sanos y ratones con EII teñidas con anticuerpos Ki-67 y DAPI. Las células fueron fijadas y permeabilized con Lyse / Fijar y Perm tampones seguido de tinción con FITC conjugado con Ki-67 y DAPI a 1 mg / ml. Ciclo de las células apenas si es perceptible en el LKS CD34 - compartimiento de CMH de los controles sanos 12.
. Figura 4 en vivo de imágenes de microscopía confocal de la FACS ordenados CD34 - CMH y las BPF manchados con la quinacrina compuesto de nucleótidos vinculante y nucleares rojo (DRAQ5). Los cuadrantes pequeños muestran pos quinacrinavesículas itive detectado en el citoplasma de las CMH, pero BPM no.
Figura 5. Citosólica de Ca 2 + elevaciones de la CMH ordenados cargados con Fura-2 y estimuladas con ATP y ionomicina. Trazas de células individuales se muestran. Todas las células fueron sensibles a ATP extracelular que muestran un aumento importante en Ca 2 + citosólico tras la adición de ATP.
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Discussion
El método aquí descrito permite el análisis rápido y preciso de la hematopoyesis en ratones individuales (Figura 1). Este análisis en diversos parámetros experimentales, incluidos los modelos murinos de inflamación, autoinmunidad, inmunodeficiencia, enfermedades degenerativas, trastornos metabólicos y el cáncer, permite abordar el impacto de las condiciones patológicas en la hematopoyesis. La Figura 3 muestra el análisis de la actividad de las células en el ciclo de LKS electrónicamente cerradas CD34 - las células de los ratones sanos y ratones con enfermedad inflamatoria intestinal (EII) 13 por tinción con Ki-67 del MAB y DAPI. Esta última muestra un aumento significativo de las células en S / T 2 / M fases del ciclo celular. Este análisis de citometría de flujo demuestra el impacto de la inflamación mediada por células T en la actividad de ciclismo HSC 12.
La combinación de etiquetado magnético y enriquecimiento de células de médula ósea que expresan c-kit, con células de la clasificación en el flujo de cytometry permite el aislamiento de alta pureza progenitores hematopoyéticos de linaje y HSCs. Las poblaciones de células obtenidas se pueden utilizar en una serie de ensayos para estudiar la biología celular (Figura 4), la transducción de señal (Figura 5), la expresión génica regulada por el desarrollo e in vitro, así como en el potencial in vivo funcional de subconjuntos de células distintas. De hecho, magnéticamente enriquecidos c-Kit + en las células se utilizaron con éxito injertar no irradiados anfitriones para estudiar la variación dinámica de la actividad de ciclismo HSCs en estado estacionario y la inflamación 14. En nuestras manos el procedimiento descrito aquí permite una recuperación más eficaz y más rápida de las células de la médula ósea del hueso de lavado con un rendimiento promedio de 200.000 células por ratón LKS. El número muy pequeño de las CMH quiescentes que pueden ser aisladas a partir de médulas óseas agrupados de varios ratones constituye un límite para las aproximaciones experimentales que requieren más células. Para obviar a esta limitación, en muchos casos preliminaresLos estudios se pueden realizar en las células más abundantes LKS prever los análisis más precisos y puntuales que se realizan en CD34 - HSCs reposo.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa y Manz Markus de preciosos consejos. Este trabajo fue financiado por la Swiss National Science Foundation, la Liga Suiza contra el Cáncer y la Fundación per la Ricerca Ticinese sul Cancro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 | |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| PenStrep | Gibco | 15070 | |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 | |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 | |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 | |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 | |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 | |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 | |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 | |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 | |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 | |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 | |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 | |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 | |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 | |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 | |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
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