Metoder for Intravenøs Selv Administration i en mus modell

Summary

Intravenøs selvadministrering (IVSA) paradigmet anses å være gullstandarden i å undersøke de forsterkende egenskaper narkotika misbruk hos gnagere. Dette manuskriptet skisserer de eksperimentelle prosedyrer og kirurgiske teknikker er nødvendig for å oppnå pålitelige IVSA data. Spesielt er grundig kateter implantasjon og vedlikehold merket.

Abstract

Dyremodeller har blitt utviklet for å studere de forsterkende effekter av legemidler, inkludert intravenøs selvadministrering (IVSA) paradigme. Fordelene med å bruke en IVSA paradigme studere de forsterkende egenskaper narkotika misbruk som kokain inkluderer det faktum at medikamentet er selv-administrert istedenfor eksperimentator-administreres, kan tidsplanen for armeringen bli endret, og nøyaktig måling av de mengder av medikament forbrukes samt tidspunktet og mønster av IV injeksjoner kan oppnås. Dessuten unngår den intravenøse administrasjonen potensielle forundrer knyttet til første pass metabolisme eller smak, og produserer rask økning i blod og hjerne narkotika nivåer. Som beskrevet i denne videoen, kan intravenøs selvadministrering oppnås uten forutgående mat begrensning eller før stoffet trening etter nøye plassering av kateter under operasjonen og grundig daglig kateter rødme og vedlikehold. Eksperimentelle prosedyrer beskrevet i dennepapir inneholde en beskrivelse av dyret bolig og akklimatisering metoder, operant trening med sukret melk løsninger, og kateter implantasjon kirurgi.

Protocol

1. Animal Boliger og Akklimatisering Prosedyrer

1. Mannlige og kvinnelige CD-en mus er plassert med samme kjønn kullsøsken, opp til 5 dyr per bur, i standard plastmerder inneholder beta chip sengetøy og nestlet pads, med wire grid lokk for å imøtekomme vannflasker og mat. Standard mus chow og vann er tilgjengelig ad libitum i hjemmet merdene hele eksperimentet.
2. Mus er opprettholdt på en omvendt lys-mørke tidsplan (lysene på 22:00-10:00).
3. Mus har lov til å akklimatisere til IVSA testing rom for en uke før starten av eksperimentelle prosedyrer.

2. Operant trening

1. Alle atferdsmessige prosedyrer inkludert søtet melk trening og sprøytemisbrukere Selvadministrering økter utføres ved hjelp av operant kammer som måler 15,9 x 14 x 12,7 cm, utstyrt med to ultra-sensitive mus spaker, dipper kopper, stimulans lys og mikroliter sprøyte pumper (Med forbundAtes Inc., St. Albans, VT, USA). Kamre er interfaced til en datamaskin ved hjelp Med Associates Smart CR-grensesnitt og Med-PC-programvare for å programmere timeplan av armering og samle inn data.
2. Naive mus habituated til operant kammer og trent for å jekke trykk ved hjelp av en søtet melk belønning (0,1 ml) presentert i en dipper cup. Operant melk gjennomføres på en-timers økter i 5-7 dager. Gjennomføring av en fast forhold (FR) tidsplan på den aktive spaken resulterte i presentasjonen av fossekallen koppen og belysningen av en stimulans lys. Den søtet melk løsning bestod av sukrose (10 mg / ml, ACS Reagent, Sigma-Aldrich Inc. St. Louis MO, USA) tilsatt til helmelk (3,25% fettinnhold). Operant trening med en søtet melk løsning eller en flytende mat forsterker er en vanlig teknikk som brukes for å lette operant svare på mus ^1,2.

3. Utarbeidelse av utstyr som skal brukes under operasjonen

RequIRED utstyr - 20, 23 og 26 gauge nåler, jeksel, en cc sprøyter, Tygon tubing, lodding jern, heparin, antibiotika og smertestillende.

1. Forbered en nål til å veilede innsetting av kateteret inn i halsvenen ved barbering ned en 20 gauge nål. Skaftet på nålen er barbert ned ved hjelp av en slipemaskin for å danne en kanal innenfor nålen å lede kateteret slangen inn i venen. Nålen kanalen bør være nøye kontrollert for metall rusk som kan ha blitt deponert. Eventuelle hindringer til kanalen skal skrapes ut ved hjelp av fine tippet tang.
2. Tilpasse to 1-cc sprøyter som skal brukes til å skylle og sjekke kateteret. Forbered to sprøyter ved å ta 12 cm biter av Tygon slange og feste dem i den ene enden til 26 gauge nåler festet til en cc sprøyter, og strekker den andre enden av slangen over 23 måle nåler. En sprøyte skal fylles med 0,9% sterilt saltvann, og den andre med en heparinisert Ticarcillin løsning (33 mg av Ticarcillinog 0,3 mg heparin pr 10 ml sterilt saltvann).
3. Forbered kateter kanyle caps. Tygon tubing er strukket over en 23 gauge nål, og kuttet 1 cm fra fas. Smelt den åpne enden av slangen for å lage en tykk tetning. Slangen bør være smeltet slik at hele kanylen hetten er lang nok til å passe over kateteret kanylen, med forseglet endefestet snugly over enden av kanylen. Oppmerksom på at hvis lokket er for lang, er det en risiko for at det vil bli bøyd og deretter gjennomboret under prosessen av å feste påskrubar kateteret dekker. Således nøye forberedelse av kateter caps anbefales, for å tilveiebringe en god tilpasning til kanylen.
4. Utarbeide nødvendig løsninger. Alle reagenser er kjøpt fra Sigma-Aldrich Inc. (St-Louis MO, USA).
   1. Heparinisert Ticarcillin løsning for kateter spyling - Oppløs 0,33 g Ticarcillin (dinatriumsalt) og 0,003 g av heparin i 10 ml sterilt saltvann. 0,03 ml oppløsning spyles through kateteret daglig. Antibiotika Oppløsningen gis for å forhindre blodpropp og infeksjoner fra utviklingsland.
   2. Amikicin (antibiotikum) for subkutan injeksjon - En enkelt subkutan injeksjon gis etter kirurgi ved en dose på 10 mg / kg for å forhindre post-operative infeksjoner.
   3. Ketoprofen (smertestillende) til subkutan injeksjon - En enkelt subkutan injeksjon er gitt etter operasjonen med en dose på 5 mg / kg til å administrere alle postoperative smerter.

4. Kateter Implantasjon kirurgi

Nødvendig utstyr og reagenser: isofluran, sterilt saltvann, alkohol (70%), 1 og 3 cc sprøyter fylt med sterilt saltvann, 1-cc tilpasset sprøyter, antibiotika og smertestillende løsninger utarbeidet i § 3 ovenfor, mus katetre (CamCaths, Cambridgeshire, UK ), kateter deksler (krystall caps fra HRS Scientific, Montreal, Quebec), øye smøremiddel, 4 cm plast bar å heve vene (dettekan konstrueres fra en plast Q-tip), Polysporin, sterile kompresser og gasbind, buede og rette tang, arterie klemmer, fine saks.

1. Ved bruk av standard aseptiske teknikker kirurgisk benken, den kirurgiske instrumenter, og kateter er sterilisert før operasjonen. Riktig sterilisering teknikker inkluderer damp autoklavering for kirurgiske instrumenter og katetre kjøpt fra CamCaths. Glass perle sterilisering kan også brukes på tuppen av kirurgiske instrumenter. Etylenoksid sterilisering kan være ansatt på mer delikat katetre eller materiale som risiko smelting. En mer detaljert beskrivelse av gnagere kirurgiske aseptiske teknikker kan bli funnet i den vedlagte referansene ^1,2. Satt opp av benken, er instrumenter og nese kjegle for vedlikehold anestesi illustrert i bildet.
2. Mus er bedøvet med isofluran gass, og vedlikeholdes under anestesi ved hjelp av en pusteslange under et skyllemedium system. Eye smøremiddel (Tears Naturale PM) brukes i begge øynene for å hindre dem fra å tørke ut under prosedyren. En passende kirurgisk margin er barbert på dyrets rygg og rundt halsen. Før noen snitt er gjort, er det kirurgiske felt begrenset ved hjelp av sterile forheng.
3. For å forberede i kateteret for innsetting inn i høyre atrium av hjertet, er det overskytende kateter slangen avskåret 1,2 cm fra pære av kateteret. Dette er den optimale lengden etablert for voksne CD-en mus, ca 8 ukers alder, 20-25 gram kroppsvekt. Lengden av kateter tubing må kanskje justeres litt (ved prøving og feiling), basert på belastningen, størrelsen og alderen på musene. Før innsetting, er sprøyten inneholdende sterilt saltvann (avsnitt 3.2) festet til kateteret kanylen, og kateteret er spylt og kontrolleres for lekkasje. Holddenne sprøyten er festet til kateteret gjennom den kirurgiske prosedyren. Det vil bli brukt til å skylle kateteret, og trekke tilbake blod i trinn 4,7.
4. Etter sterilisering med 70% alkohol, er en 2 cm lang midscapular innsnitt gjort starter midtveis på baksiden og slutter like under halsen for å imøtekomme basen av kateteret. Bindevev skal tvinges fra hverandre med pinsett for å gjøre plass for kateteret basen under huden.
5. Plassere dyret på ryggen, en annen grunt 1 - 2 cm diagonalt innsnitt er gjort fra høyre krageben går oppover til dyr kjeve, etter at området har blitt penslet med 70% alkohol. Halsvenen vil bli funnet overfladisk under huden i nakken. Som forberedelse for innsetting av kateter, blir slangen fra bunnen av kateteret trukket gjennom snitt på baksiden og brakt nær halsvenen ved å føre slangen under huden like over høyre skulder. Slutten av kateteret slangen erderetter festet til en arterie klemmen og plassert på dyrets side for å holde den på plass.
6. Den høyre vena jugularis ligger ved forsiktig beveger seg bort overfladisk bindevev og fettvev fra snitt rundt dyrets hals. Bindevev rundt venen er brutt i stykker med buede pinsett og venen er så opphøyet ved hjelp av en steril plast bar. Loose åpne suture knop er gjort rundt hver ende av venen og kateteret slangen er tredd gjennom den øverste knute og løkker over sutur tråden å hvile unclamped over høyre skulder.
7. Før innsetting, våt både 20 gauge innsetting nål og vene med sterilt saltvann for å redusere friksjonen. Nålen holdes parallelt til venen, og satt forsiktig nær bunnen av forhøyede venen (Merk: ca 0,5 cm av nålespissen må legge inn vene). Ved hjelp av tang, skyv kateteret slangen ned i sjakten av nålen inn i venen. Motstand ville indikere at slangen is innenfor bindevev og ikke innenfor venen. Trykk 0,03 cc av saltvann gjennom venen for å sikre at det ikke er noen lekkasjer. Lekkasjer ville indikere at venen kan gjennomboret eller at kateteret slangen plassering må justeres.
   Merk: For å sjekke om slangen er innenfor venen, forsøke å trekke opp litt blod ved hjelp av vedlagte saltvann sprøyten. Hvis blodet ikke kan umiddelbart trukket opp, kan blodåre eller hjertet veggen skal tilstoppes kateterspissen, eller venen har ikke blitt stukket, justere slangen og prøv igjen. Needle gjeninnsetting kan være nødvendig hvis blod fortsatt ikke kan trekkes opp.
   
8. For å sikre kateteret på plass, skyves kateter pære til innsettingspunktet og ta ut nålen. Knyt bunnen knute og trekk kateteret flush mot baren før knytte den andre knuten rett over pæren. Test på nytt for å se om blodet kan trekkes opp og løsne opp knutene litt hvis nødvendig. Brette kateteret slangen under huden og suturventrale snitt rundt dyrets hals. Påfør Polysporin Heal Rask med steril bomull applikator eller annen antibiotisk salve fortrinnsvis inneholdende noe smertestillende til lukket innsnitt.
9. Med dyret på magen sin, plassere kateteret basen under huden på ryggen i den preparerte innsnitt. Pass på at overskytende slange er minimalt looped og godt gjemt under kateteret base for å minimere sjansene for dyret å tygge og piercing det. Suturere innsnitt på begge sider av kateteret base, og anvende Polysporin Heal Rask hjelp av en steril bomull applikator.
10. Skyll kateteret med 0,03 cc av heparinisert Ticarcillin løsning ved hjelp av sprøyten med slangen festet til den (pkt. 3.2). Cap kanylen med plast kanyle cap og skru på den hvite kateteret dekselet. I noen mus som er friske fra kirurgi, kan blodet lekke ut av kateteret før kanylen er avkortet. Det er viktig å re-skylle dyret og rapidly erstatte kanylen cap før blodet har sjansen til å strømme ut. Dyr må spyles på en daglig basis for å opprettholde kateter patency.
11. Etter tørke ned injeksjonsområde mellom dyrene bakre ben med 70% etanol, subkutant injisere den analgetiske ketoprofen i en dose på 5 mg / kg på den ene siden, og den antibiotika amikicin ved en dose på 10 mg / kg på den andre siden.
12. Etter anestesi er avviklet, er dyr tillatt å komme i en ren bur med lett tilgang til mat og vann i 5 til 7 dager. Mus bør plasseres i en oppvarmet kabinett over natten for å hindre postoperativ hypotermi.

5. Atferdsforskning testing - Intravenøs selvadministrering

1. Før atferdsmessige testing katetre skal skylles med 0,9% sterilt saltvann. Mus og deretter plassereD i operant kamre og koblet til infusjonen linjer og infusjonspumper. Active spak presser resultere i en 3,2 sek 18 pl legemiddelinfusjon kombinert med belysning av en stimulans lys. Hver spak trykk etterfølges av en 8 sek tid ut perioden som stimulans å lyse.
2. Etter operant økten, er mus katetre spyles med heparinisert Ticarcillin løsning før de blir returnert til sine hjem buret.
3. Mus har lov til å selv administrere for 3 påfølgende 2-timers økter på hver dose. Doser ble presentert i en tilfeldig rekkefølge for hver mus, som vist i den følgende del.
4. Kateter patency vurderes daglig ved å påse at både saltvann og antibiotikaløsning kan spyles gjennom kateteret. I tillegg kan en ketamin / midazolam testen utføres som beskrevet i den vedlagte referanse ^5. I korte trekk, tegn på anestesi som ubevegelighet innen 5 sekunder av en infusjon av 0.02 til 0,03 ml ketamin (15 mg / ml),eller midazolam (0,75 mg / ml) midazolam er bevis for en patent kateter ^5.

Representative Results

Figur 1. Mønsteret for å svare for sprøytemisbruk selvadministrering vil variere etter stoff, dosering og mus belastning ansatt. Figuren presentert viser kokain selvadministrering data etter vellykket catherization surgeries hjelp av fremgangsmåten beskrevet i videoen. Figuren viser gjennomsnitt (± SEM) kokain infusjoner opptjent og mener (± SEM) kokainbruk (mg / kg kroppsvekt) i en rekke 4 kokain doser presentert i tilfeldig rekkefølge på en FR1 tidsplan for forsterkning. Abscisse: dose selvadministrert medikament pr infusjon. Venstre ordinaten: totalt antall infusjoner opptjent i løpet av to-timers operant økt. Høyre ordinaten: total kokain inntak i mg / kg i løpet av 2-timers testøkt. Alle 13 katetre forble patent for varigheten av studien (4 uker). En enveis ANOVA gjennomført på dose viste at mice var administrere kokain i en doseavhengig [F (1,12) = 42,8, p <0,05]. Det er en økning i kokainbruk over dose-respons kurve [F (3,36) = 29,6, p <0,05] til tross for en nedgang i spaken trykke på høyere doser. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet av 3 testing økter på hver kokain dose (± SEM) samlet i CD-en mus (n = 13 / dose, menn og kvinner samlet). Sammenligninger av aktiv (legemiddel-forsterket) vs inaktiv spaken svare over doseresponskurve ble laget ved hjelp av to-veis ANOVA å sikre at mus var diskriminerende mellom de to spaker. For de CD1 mus, avslørte analysen en preferanse for den aktive arm [F (1,12) = 10.255, p <0,05] over hele dose-respons kurve (data ikke vist her).

Discussion

Dyremodeller av narkotikamisbruk er spesielt nyttig for å forstå det genetiske grunnlaget for narkotikarelatert atferd. For eksempel mus med ulike genetiske profiler viser arvelige forskjeller i deres følsomhet for kokain ^6-8 og bidra til å identifisere potensielle genet kandidater formidling av fenotypiske variasjonen ^9. Den intravenøse kateterisering som er beskrevet i denne artikkelen har blitt brukt med stor suksess å undersøke stoffet IVSA i ulike stammer av mus samt mus av ulike genetiske bakgrunn ^10.

Fremgangsmåtene vist i denne videoen markere viktige faktorer for å fokusere på under og etter catherization kirurgi for å oppnå pålitelige intravenøs selvadministrering data. Først, er plasseringen av kateteret slangen innenfor høyre atrium avgjørende, for å hindre at kateteret svikt fra blot blodpropp. Under operasjonen er det viktig å sørge for at kateteretenden er uhindret, og ikke blokkeres av enten hjertet eller vene vev. Sekund, er daglig kateter spyling kreves både før og etter operant økter for å unngå blokkeringer. Endelig må kateteret kanyle dekkes konstant med både kanylen caps og krystall dekker når dyrene er i deres hjem bur, for å hindre adgang av rusk. Minor blokkering av kateteret kanylen kan forskyves ved hjelp av en fin 26 gauge nål, men daglig spyling med den hepariniserte antibiotikaløsning kreves, spesielt på dager når dyrene ikke er testet for IVSA.

Å utføre dyr overlevelse kirurgi, god kjennskap til aseptiske teknikker, er analgesi og anestesi er nødvendig. Mens videoen ikke erstatte riktig kirurgisk trening, kan den brukes som en guide for forskere som ønsker å tilegne seg teknikker som kreves for dette paradigmet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ticarcillin Disodium Salt	Sigma-Aldrich	T5639-1G	1 gram bottle
Tears Naturale P.M (Eye lubricant)	Alcon	N/A	3.5 gram tube This eye lubricant can be found in most pharmacies. Any ophthalmic eye lubricant can be used.
Cocaine	Medisca Pharmaceutique	0723-06	1 gram bottle
Ketamine	Medisca Pharmaceutique	1754-04	25 gram bottle
Midazolam	Medisca Pharmaceutique	2519-06	1 gram bottle
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	250 gram bottle
Ketoprofen	Sigma-Aldrich	K1751-1G	1 gram bottle
Amikicin Sulphate salt	Sigma-Aldrich	A2324-5G	5 gram bottle
Sucrose ACS Reagent	Sigma-Aldrich	S5016-500G	500 gram bottle
Standard mouse catheters with soft mesh	CamCaths	MIVSA/20/26/BC-1S	Tubing specifications: 26SWG;0.451;0.254
Crystal cap applicator	HRS Scientific	313CAC	This is the white catheter cap.
Tygon Micro Bore Tubing	Thomas Scientific	9561S41	Tubing specifications (bore x o.d. x wall thickness in inches): .01 x .03 x .01