Métodos de auto-administração intravenosa em um modelo de camundongo

Summary

A auto-administração intravenosa paradigma (IVSA) é considerado como sendo o padrão de ouro para examinar as propriedades de reforço de drogas de abuso em roedores. Este manuscrito descreve os procedimentos experimentais e técnicas cirúrgicas necessárias para a obtenção de dados confiáveis ​​IVSA. Em particular, a implantação do cateter meticulosa e manutenção são realçados.

Abstract

Os modelos animais têm sido desenvolvidos para estudar os efeitos de reforço de drogas, incluindo a auto-administração intravenosa paradigma (IVSA). As vantagens da utilização de um paradigma IVSA para estudar as propriedades de reforço de drogas de abuso, tais como cocaína incluem o facto de que a droga é auto-administrada, em vez de experimentador-administrado, o esquema de reforço pode ser alterada, e a medição precisa da quantidade de droga consumida, bem como o tempo e no padrão de injecções IV pode ser obtido. Além disso, a via de administração intravenosa evita confunde potenciais relacionados com o metabolismo de primeira passagem, ou o gosto, e produz um rápido aumento no sangue e os níveis da droga no cérebro. Conforme descrito neste vídeo, auto-administração intravenosa pode ser obtido sem restrição alimentar antes ou treinamento anterior de droga após a colocação do cateter cuidado durante a cirurgia e cateter diária meticulosa lavagem e manutenção. Procedimentos experimentais descritas nestepapel incluem uma descrição do alojamento dos animais e métodos de aclimatação, treinamento operacional utilizando as soluções de leite adoçado, e cirurgia de implante de cateter.

Protocol

1. Animais Procedimentos Habitação e aclimatação

1. Macho e fêmea CD-1 ratos são alojados com pessoas do mesmo sexo ninhada, até 5 animais por gaiola, em gaiolas padrão de plástico contendo cama de chip beta e almofadas nestlet, com tampas de grade de arame para acomodar garrafas de água e alimentos. Padrão para murinos e água estão disponíveis ad libitum nas gaiolas casa durante todo o experimento.
2. Ratos são mantidos em um cronograma claro-escuro reverso (luzes acesas 22:00-10:00).
3. Ratos são permitidos aclimatizar às salas de teste IVSA durante uma semana antes do início dos procedimentos experimentais.

2. Formação operante

1. Todos os procedimentos de comportamento, incluindo a formação de leite adoçado e drogas intravenosas de auto-administração sessões são realizadas com câmaras operantes de medição 15,9 x 14 x 12,7 cm, equipados com duas alavancas de ultra-sensíveis do rato, copos dipper, luzes de estímulo e bombas de seringa (microlitro Med Assocates Inc., St. Albans, VT, EUA). Câmaras são interligados a um computador usando Med Associates inteligente CR interface e Med-PC software para programar o esquema de reforço e coletar dados.
2. Ratinhos naive estão habituados às câmaras operantes e treinados para pressionar a alavanca usando uma recompensa de leite adoçado (0,1 ml) apresentada num copo dipper. Formação leite operante é conduzido em 1-hr sessões durante 5-7 dias. A conclusão de um rácio fixo cronograma (FR) sobre a alavanca activa resulta na apresentação do copo dipper e a iluminação de uma luz de estímulo. A solução de leite adoçado consistiu de sacarose (10 mg / ml, o reagente ACS, Sigma-Aldrich Inc. St. Louis, MO, EUA), adicionado ao leite gordo (3,25% de teor de gordura). Formação operante com uma solução de leite adoçado ou um reforçador alimento líquido é uma técnica comum utilizada para facilitar a responder operante em ^1,2 ratinhos.

3. Preparação do equipamento a ser utilizado durante a cirurgia

Requequipamentos IRED - 20, 23 e 26 agulhas de calibre, moedor, um cc seringas, tubos de tygon, ferro de solda, heparina, antibióticos e analgésicos.

1. Prepara-se uma agulha para guiar a inserção do cateter na veia jugular raspando para baixo uma agulha de calibre 20. O corpo da agulha é raspada para baixo, usando um moinho de modo a formar um canal no interior da agulha para guiar o tubo do cateter dentro da veia. O canal de agulha deve ser cuidadosamente controlado para todos os restos de metal que pode ter sido depositado. Quaisquer obstruções para o canal deve ser raspado com uma pinça ponta fina.
2. Adaptar dois 1-cc seringas para serem utilizados para a lavagem e a verificação do cateter. Prepare duas seringas, tendo 12 peças centímetros de tubo Tygon e anexá-las em uma extremidade a 26 agulhas de calibre afixados seringas de 1 cc, e esticar as outras extremidades do tubo de mais de 23 agulhas de calibre. Uma seringa deve ser preenchido com 0,9% de solução salina estéril e a outra com uma solução de ticarcilina heparinizado (33 mg de ticarcilinae 0,3 mg de heparina por 10 ml de solução salina estéril).
3. Preparar tampões de cateter cânula. Tubagem Tygon é esticada sobre uma agulha de calibre 23, e de reduzir a 1 cm do bisel. Derreter a extremidade aberta do tubo para criar uma vedação de espessura. A tubagem deve ser fundida de modo que a tampa da cânula inteiro é suficientemente longo para se ajustar sobre a cânula do cateter, com o encaixe final selado firmemente sobre a extremidade da cânula. Observe que, se a tampa estiver demasiado tempo, há um risco de que ela vai ser dobrada e subsequentemente perfurado durante o processo de fixação do parafuso no cateter cobre. Assim, uma preparação cuidadosa das tampas do cateter é recomendado, a fim de proporcionar um bom ajuste para a cânula.
4. Preparar soluções necessárias. Todos os reagentes são adquiridos de Sigma-Aldrich Inc. (St-Louis MO, EUA).
   1. Ticarcilina solução heparinizada para a lavagem do cateter - Dissolver 0,33 g de ticarcilina (sal dissódico) e 0,003 g de heparina em 10 ml de solução salina estéril. 0,03 ml de solução é lavada through cateter diária. A solução antibiótico é administrado para prevenir coágulos sanguíneos e infecções de desenvolvimento.
   2. Amikicin (antibiótico) para injecção subcutânea - Uma única injecção subcutânea é dada após a cirurgia, numa dose de 10 mg / kg para prevenir infecções pós-operatórias.
   3. O cetoprofeno (analgésico) para injecção subcutânea - Uma única injecção subcutânea é dada após a cirurgia, numa dose de 5 mg / kg para administrar qualquer dor no pós-operatório.

4. Cirurgia de implante de cateter

Equipamento necessário e reagentes: solução salina, estéril, isoflurano, o álcool (70%), 1 e 3 seringas cc cheio com solução salina estéril, 1 cc-seringas adaptadas, soluções de antibióticos e analgésicos preparados na secção 3 acima, os cateteres de rato (CamCaths, Cambridgeshire, UK ), capas de cateter (tampas de cristal do HRS científicos, Montreal, Quebec), lubrificante ocular, 4 cm de barras de plástico para elevar veia (estapode ser construído a partir de um plástico Q-tip), Polysporin, compressas estéreis e gaze, pinça de curvas e retas, braçadeiras da artéria, tesoura fina.

1. Utilizando técnicas assépticas padrão a bancada cirúrgica, os instrumentos cirúrgicos e os cateteres são esterilizados antes da cirurgia. Técnicas de esterilização apropriadas incluem o vapor em autoclave, para os instrumentos cirúrgicos e cateteres comprados CamCaths. Contas de vidro a esterilização também pode ser usado na ponta dos instrumentos cirúrgicos. De esterilização por óxido de etileno pode ser utilizado nos cateteres mais delicados ou materiais que derretimento risco. Uma descrição mais detalhada das técnicas de assepsia roedor cirúrgicos podem ser encontrados em referências a ^1,2 em anexo. Definir-se do banco, instrumentos e cone do nariz para a manutenção da anestesia é ilustrado na foto.
2. Os ratos são anestesiados com isoflurano a gás, e mantidos sob anestesia, utilizando um tubo de respiração sob um sistema de eliminação. Lubrificante ocular (Lágrimas Naturale PM) é aplicada a ambos os olhos, para evitar que sequem durante o procedimento. Uma margem adequada cirúrgico é raspado na parte de trás do animal e em volta do pescoço. Antes de qualquer incisões são feitas, os campos cirúrgicos são restritas usando campos estéreis.
3. A fim de preparar o cateter para inserção no interior do átrio direito do coração, o tubo do cateter é cortado excesso 1,2 centímetros a partir do bolbo do cateter. Este é o comprimento óptimo estabelecido para adultos ratinhos CD-1, de cerca de 8 semanas de idade, 20-25 gramas de peso do corpo. O comprimento do tubo do cateter pode ser necessário ajustar ligeiramente (por tentativa e erro), a partir da estirpe, tamanho e idade dos ratos. Antes da inserção, a seringa contendo solução salina estéril (secção 3.2) está ligado à cânula do cateter, e o cateter é lavada e verificada a existência de fugas. Manteresta seringa ligada ao cateter durante todo o procedimento cirúrgico. Será usado para lavar o cateter, e tirar o sangue de volta no passo 4.7.
4. Após a esterilização com álcool a 70%, de 2cm de longa incisão é feita midscapular partida a meio caminho na parte de trás e terminando abaixo do gargalo, a fim de acomodar a base do cateter. Tecido conjuntivo devem ser forçados a se separar com uma pinça para dar espaço para a base de cateter abaixo da pele.
5. Colocar o animal em suas costas, um raso segunda 1-2 cm na diagonal incisão é feita a partir da clavícula direita indo para cima no queixo animais, depois que a área foi limpo com álcool a 70%. A veia jugular vai ser encontrado superficialmente sob a pele do pescoço. Na preparação para a inserção do catéter, tubagem a partir da base do cateter é puxado através da incisão no dorso e trazido para perto da veia jugular, passando o tubo sob a pele apenas sobre o ombro direito. A extremidade do tubo do cateter éem seguida, ligado a um grampo de artéria e colocado no lado do animal, para o manter no lugar.
6. A veia jugular direita é localizado por gentilmente afastando conjuntivo superficial e tecido adiposo a partir da incisão em volta do pescoço do animal. Tecido conjuntivo em torno da veia é quebrada usando fórceps curvos e a veia é então elevado com uma barra de plástico estéril. Nós de sutura frouxas abertos são feitos em torno de cada extremidade do veio e o tubo do cateter é enfiado através do nó superior e enrolado sobre o fio de sutura para descansar desapertada sobre o ombro direito.
7. Antes da inserção, molhada tanto a agulha de 20 gauge e a inserção da veia com solução salina estéril para reduzir a fricção. A agulha é conduzido paralelamente à veia, e inserido suavemente perto da parte inferior da veia elevado (Nota: aproximadamente 0,5 cm da ponta da agulha tem de entrar na veia). Usando fórceps, deslizar o tubo do cateter para baixo do eixo da agulha na veia. Resistência poderia indicar que o tubo is no interior do tecido conjuntivo, e não no interior da veia. Empurre 0,03 cc de soro na veia para ter certeza de que não há vazamentos. Vazamentos indicaria que a veia pode ser perfurado ou que a colocação de tubo do cateter precisa de ajuste.
   Nota: Para verificar se o tubo está dentro da veia, tentar tirar um pouco de sangue usando a seringa anexa salina. Se o sangue não pode ser imediatamente puxado para cima, a nervura ou parede do coração pode ser a oclusão da ponta do cateter, ou a veia não foi perfurada; ajustar o tubo e tentar de novo. Agulha reinserção pode ser necessária se o sangue ainda não pode ser elaborado.
   
8. A fim de proteger o cateter no lugar, empurrar a lâmpada cateter para o ponto de inserção e remoção da agulha. Amarrar o nó inferior e puxe a descarga cateter contra o bar antes de amarrar o nó direito segundo acima do bulbo. Teste novamente para ver se o sangue pode ser elaborado e afrouxar os nós um pouco, se necessário. Dobrar o tubo do cateter sob a pele e suturaa incisão ventral em volta do pescoço do animal. Aplicar Polysporin Cura rápida usando um aplicador com ponta de algodão estéril, ou qualquer outra pomada de antibiótico, de preferência contendo um pouco de analgésico para a incisão fechada.
9. Com o animal no seu abdómen, coloque a base do cateter sob a pele das costas dentro da incisão preparada. Certifique-se de que o tubo em excesso é minimamente em loop e bem escondida sob a base de cateter para minimizar as chances de o animal mastigar e perfurando-o. Sutura da incisão em ambos os lados da base do cateter, e aplicar rápida Cura Polysporin utilizando um aplicador de ponta de algodão esterilizado.
10. Lave o cateter com 0,03 cc da solução de ticarcilina heparinizado utilizando a seringa com o tubo fixado na mesma (secção 3.2). Tapar a cânula com a tampa da cânula de plástico e parafuso da tampa cateter branco. Em alguns ratos que são frescos de uma cirurgia, o sangue pode sair do cateter antes da cânula é limitado. É importante voltar a lavar o animal e rapidly recoloque a tampa da cânula antes que o sangue tem a chance de fluir para fora. Os animais devem ser lavadas numa base diária para manter a desobstrução do cateter.
11. Depois limpando a área de injecção entre os animais de volta pernas com etanol a 70%, por via subcutânea, injectar o cetoprofeno analgésico numa dose de 5 mg / kg de um lado, e a amikicin antibiótico numa dose de 10 mg / kg, do outro lado.
12. Após a anestesia é interrompida, os animais são deixados recuperar em uma gaiola limpa com fácil acesso a comida e água durante 5 a 7 dias. Mice deve ser colocado num armário de aquecimento durante a noite para evitar a hipotermia pós-operatória.

5. Teste comportamental - intravenosa auto-administração

1. Antes do teste comportamental cateteres são lavados com 0,9% de solução salina estéril. Os ratos são então colocard nas câmaras operantes e conectados às linhas de perfusão e de bombas de infusão. Pressiona a alavanca activas resultar em um 3,2 seg infusão da droga 18 ul juntamente com a iluminação de uma luz de estímulo. Cada pressão da alavanca é seguida por um período de tempo sec 8 período durante o qual a luz de estímulo permanece ligado.
2. Após a sessão de operante, cateteres ratos são lavadas com a solução de ticarcilina heparinizado, antes de ser devolvido à sua gaiola de origem.
3. Ratos são permitidos para auto-administrar durante 3 hr consecutivos 2-sessões em cada dose. As doses foram apresentados numa ordem aleatória para cada rato, tal como mostrado na secção que se segue.
4. Permeabilidade do cateter é avaliada diariamente, assegurando que tanto a solução salina e antibióticos pode ser lavado por meio do cateter. Além disso, um teste de cetamina / midazolam pode ser conduzido tal como descrito na referência em anexo ^5. Em resumo, os sinais de anestesia, tais como dentro de 5 segundos a imobilidade de uma infusão de 0,02-0,03 ml de cetamina (15 mg / ml),ou midazolam (0,75 mg / ml) midazolam é evidência de um cateter de patente ^5.

Representative Results

Figura 1. O padrão de responder por drogas por via intravenosa auto-administração variam de acordo com faixa de dose da droga, e tensão do mouse empregado. A figura apresentada mostra auto-administração de cocaína seguintes dados cirurgias catherization sucesso utilizando o procedimento descrito no vídeo. A figura mostra a média (± SEM) infusões de cocaína ganhou e média (± SEM) o consumo de cocaína (mg / kg de peso corporal) em um intervalo de quatro doses de cocaína apresentados em uma ordem aleatória em uma programação FR1 de reforço. Abscissa: dose de auto-administrado por infusão de drogas. Ordenada esquerda: número total de infusões ganhou durante a sessão de duas horas de operante. Ordenada direita: a ingestão de cocaína total em mg / kg, durante a sessão de teste de 2 h. Todos os 13 cateteres permaneceram patente para o período de duração do estudo (quatro semanas). Uma ANOVA one-way conduzida em doses revelou que mice foram administração de cocaína de uma forma dose-dependente [F (1,12) = 42,8, p <0,05]. Há um aumento do consumo de cocaína sobre a curva de dose-resposta [F (3,36) = 29,6, p <0,05], apesar de uma diminuição na alavanca de prensagem com as doses mais elevadas. Cada ponto de dados representa a média de três sessões de testes a cada dose de cocaína (± SEM) recolhidos em ratinhos CD-1 (n = 13 doses /, machos e fêmeas combinados). Comparações de alavanca activo vs (droga reforçado) inativo responder através da curva de resposta à dose foram realizadas usando ANOVA de duas vias para assegurar que os ratos estavam a discriminação entre as duas alavancas. Para os ratinhos CD1, a análise revelou uma preferência para a alavanca activa [F (1,12) = 10,255, p <0,05] sobre a curva de resposta à dose total (dados não apresentados aqui).

Discussion

Os modelos animais de abuso de drogas, são particularmente úteis no entendimento da base genética da droga comportamentos relacionados. Por exemplo, ratos com diferentes perfis genéticos mostram diferenças hereditárias em sua sensibilidade à cocaína ^6-8 e ajudar a identificar genes candidatos potenciais mediadores da variabilidade fenotípica observada ^9. Os procedimentos de cateterização intravenosa descritos neste documento têm sido utilizados com sucesso considerável para examinar IVSA droga em várias estirpes de ratinhos, assim como ratinhos de diferentes origens genéticas ^10.

Os procedimentos apresentados neste vídeo realçar factores importantes para se concentrar durante e após a cirurgia catherization a fim de obter fiáveis ​​intravenosas de auto-administração de dados. Em primeiro lugar, a colocação do tubo do cateter dentro do átrio direito é vital, de modo a impedir a falha de cateter de coágulos blot. Durante a cirurgia, é importante ter a certeza de que o cateterextremidade está desimpedida, e não ocluído por um ou outro o coração ou o tecido da veia. Em segundo lugar, a lavagem do cateter diária é necessária, antes e depois das sessões operantes para evitar entupimentos. Finalmente, a cânula do cateter deve ser coberto constantemente com ambos os tampões cânula e cristal cobre, quando os animais estão em gaiolas de origem, para evitar a entrada de detritos. Bloqueio menor da cânula do cateter podem ser desalojadas utilizando uma agulha de calibre fino 26, no entanto diária de lavagem com a solução heparinizada antibiótico é necessária, particularmente nos dias em que os animais não são testados para IVSA.

Para realizar a cirurgia de animais de sobrevivência, um bom conhecimento de técnicas assépticas, analgesia e anestesia é necessária. Enquanto este vídeo não substitui formação cirúrgica adequada, pode ser usada como um guia para os investigadores que desejem adquirir as técnicas necessárias para este paradigma.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ticarcillin Disodium Salt	Sigma-Aldrich	T5639-1G	1 gram bottle
Tears Naturale P.M (Eye lubricant)	Alcon	N/A	3.5 gram tube This eye lubricant can be found in most pharmacies. Any ophthalmic eye lubricant can be used.
Cocaine	Medisca Pharmaceutique	0723-06	1 gram bottle
Ketamine	Medisca Pharmaceutique	1754-04	25 gram bottle
Midazolam	Medisca Pharmaceutique	2519-06	1 gram bottle
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	250 gram bottle
Ketoprofen	Sigma-Aldrich	K1751-1G	1 gram bottle
Amikicin Sulphate salt	Sigma-Aldrich	A2324-5G	5 gram bottle
Sucrose ACS Reagent	Sigma-Aldrich	S5016-500G	500 gram bottle
Standard mouse catheters with soft mesh	CamCaths	MIVSA/20/26/BC-1S	Tubing specifications: 26SWG;0.451;0.254
Crystal cap applicator	HRS Scientific	313CAC	This is the white catheter cap.
Tygon Micro Bore Tubing	Thomas Scientific	9561S41	Tubing specifications (bore x o.d. x wall thickness in inches): .01 x .03 x .01