Summary
Visualisering av hjertets fartøyene er kritisk til å fremme vår forståelse av hjerte-og karsykdommer. Her beskriver vi en metode for perfusing murine koronar blodkar med et røntgentett silikongummi (Microfil), i forberedelse for mikro-computertomografi (μCT) bildebehandling.
Abstract
Visualisering av blodkar blir stadig viktigere for å forstå mange ulike sykdomstilstander. Mens flere teknikker finnes for bildebehandling blodkar, få er i stand til å visualisere vaskulære nettverket som helhet, mens strekker seg til en oppløsning som inneholder mindre fartøyer 1,2. I tillegg er mange vaskulære kasteteknikker ødelegge det omkringliggende vevet, og hindrer videre analyse av prøven 3-5. En metode som omgår disse problemene er mikro-computertomografi (μCT). μCT bildebehandling kan skanne med en oppløsning <10 mikron, er i stand til å produsere 3D rekonstruksjoner av vaskulær nettverket, og forlater vev inntakt for påfølgende analyse (f.eks histologi og morfometri) 6-11. Krever imidlertid tenkelig fartøy av ex vivo μCT metoder som fartøyene bli fylt med et røntgentett sammensatt. Som sådan er det nøyaktig representasjon av blodkar produsert av μCT tenkelig betingetpålitelig og fullstendig fylling av fartøyene. I denne protokollen, beskriver vi en teknikk for å fylle mus koronar fartøy i forberedelse til μCT bildebehandling.
To dominerer teknikker finnes for å fylle koronar blodkar: in vivo via kanylering og retrograd perfusjon av aorta (eller en filial av aortabuen) 12-14, eller ex vivo via en Langendorff perfusjon system 15-17. Her beskriver vi en in vivo aorta kanylering metode som er spesielt utformet for å sikre fylling av alle fartøy. Vi bruker en lav viskositet røntgentett stoff kalt Microfil som kan perfuse gjennom de minste fartøyene til å fylle alle kapillærene, samt både arterielle og venøse sider av vaskulær nettverket. Fartøyene er perfused med buffer ved hjelp av en trykksatt perfusjon system, og deretter fylt med Microfil. For å sikre at Microfil fyller de små høyere motstand fartøy, ligate vi de store grenene emanating fra aorta, som viderekoble Microfil inn i coronaries. Når fylling er ferdig, for å hindre elastisk natur hjertevev fra klemme Microfil ut av noen skip, ligate vi tilgjengelige store vaskulære utganger umiddelbart etter fylling. Derfor er vår teknikk optimalisert for fullstendig utfylling og maksimal oppbevaring av fylling agent, slik visualisering av hele koronar vaskulær nettverk - arterier, kapillærer og vener like.
Protocol
1. Forberedelser før start
- Fyll hver side av trykket perfusjons apparat med vasodilator buffer (4mg / L papaverin + 1g / L Adenosin i PBS) eller 4% Paraformaldehyde (PFA) i PBS, henholdsvis.
- Forbered en 1/2cc Insulin sprøyte (med en fast tilkoblet 29G ½ "p) ved å fylle den med 0,1 ml 1:100 Heparin (5000U/ml lager) og bøye nålen til ~ 120 graders vinkel med skråkant opp. Gjør samme med en 1 ml sprøyte (med en 26G ½ "nålen) fylt med 0,3 ml mettet KCl løsning.
2. Utsette hjertet og cannulating aorta
- Anesthetize musen bruker bedøvelse av valget. (Vi bruker en overdose av et Ketamin / xylazin blanding:. IP injeksjon av 130 mg / kg ketamin og 8,8 mg / kg xylazin i saltvann)
- Pin bedøvet musen på dissekere skuffen, ventral siden opp. Åpne bukhulen med en midtlinjen snitt og trekke hudenå eksponere de organer. Flytt tarmen til en side for å avdekke en region av Posterior Vena Cava (PVC).
- Injiser Heparin løsning i PVC. Som du trekke nålen, dekker nålen hullet med en bomull-tipped applikator for å forhindre lekkasje og hold den i noen sekunder til PVC veggen blodpropp og sel. Vent 2-3 minutter for Heparin å spre hele musen sirkulasjon.
- Dissekere mellomgulvet og brystkassen slik at du kan observere det bankende hjertet. Sakte injiserer KCl løsning i PVC til hjertet arrestasjonene.
- Fjern alle organer under mellomgulvet og avgiftsdirektoratet bakre delen av musen, slik at regionen fremre av mellomgulvet intakt. Fjern mellomgulvet, er forsiktig med å kutte PVC nær membranen så den delen proksimalt for hjertet er lett å finne i etterfølgende trinn.
- Finn den avskårne enden av aorta. Plasser en lang lengde på 6-0 flettet silke sutur under aorta noen få millimeter anteriore from den avskårne enden slik at suturen er doblet tilbake på seg selv. Skjær dette lenger sutur i to så det er 2 stykker av sutur under aorta. Sett angiocatheter inn den avskårne enden av aorta (fig 1A, B) og slips hver sutur med en dobbel-knute for å holde angiocatheter på plass og forhindre rygg-trykket i aorta lekker ut.
3. Perfusjon og Microfil injeksjon
- Koble angiocatheter til trykket perfusjon apparatet (fig 2) og begynne perfusing fartøyene med vasodilator buffer (fig 1C) ved å pumpe den perfusjon apparat til en drivende trykk på 100-110 mmHg. Dobbeltsjekk at bufferen er perfusing gjennom coronaries ved å sikre væske er spennende fra PVC. Fortsett å perfuse i minst 3 minutter eller til væsken ut av PVC er klar. (Fortsett med de neste trinnene mens perfusing.)
- Skjær ribben og pin rygg (eller fjerne) brystkasse å avsløre hjertet. Når eksponert, være careful ikke å la hjertet tørke ut ved å klemme dråper buffer på hjertet fra en buffer solfylte stykke gasbind. Fjerne thymus å avsløre aortabuen. Ligate de tre store aorta grener med 6-0 flettet silke sutur for å sikre væske blir omdirigert gjennom coronaries snarere enn gjennom disse større, lav motstand fartøy (fig 1D).
- Perfuse hjertet med fiksativ i 15 minutter, og skyll med Vasodilatasjon buffer i minst 2 minutter. I mellomtiden ligate både Anterior Vena Cavae å hindre Microfil lekker ut av hjertet etter injeksjon (Fig 1E). Plasser suturene rundt PVC og aorta men ikke stram dem før etter fylling.
- Klargjør Microfil (som spesifisert i tabell av reagenser) og legger det inn i en 1 ml sprøyte. Fyll disseksjon skuffen med nok vann til å dekke kateter (for å hindre innføring av luftbobler når du bytter fra perfusjon slangen til Microfil sprøyten). Koble perfusjon apparatus fra kateteret og koble forberedt Microfil sprøyten.
- Injisere Microfil inn i aorta til god fylling av koronararteriene er tydelig (Fiken 1F, 3A): arteriene vil fylle først, og deretter Microfil vil "renne" inn i kapillærene som vevet spyler med fargen på Microfil. Når på den venøse siden, fører til at hydrofobe natur Microfil det å i utgangspunktet se ut som uavhengige sfærer som det framgår av de mindre fartøyene. Fortsett å injisere Microfil til en kontinuerlig kolonne fyller venene. Komplett fylling vil bli tydelig når Microfil er kontinuerlig innenfor skipene, og det er spennende gjennom PVC.
- Etter påfylling er fullført, raskt stramme sting som tidligere var plassert rundt PVC og aorta for å hindre den elastiske natur hjertevev fra klemme Microfil ut av skipene.
- Dekk hjerte med våt gasbind (dynket med vann fra dissekere skuffen) For å hindre uttørking, og la det sitte i ca 1 time ved romtemperatur før Microfil har polymerisert. Unngå eventuelle eksterne presset på hjertet under polymerisasjon prosessen, for eksempel løfte eller snu hjertet i et forsøk på å få en tidlig oversikt over de fylte fartøyene i baksiden av hjertet. Dette kan presse Microfil fra enkelte fartøy til en mer elastisk område av hjertet, forårsaker brudd i Microfil.
- Ta hjertet og post-fikse det i 4% PFA natten ved 4 ° C. Deretter lagrer i 70% etanol ved 4 ° C. Hjertet blodkar er nå klar for μCT bildebehandling.
4. Representative Resultater
Fartøy som er effektivt perfused av Microfil vil ha kontinuerlig, ubrutt Microfil gjennom blodårene (Fig. 3A). Omfanget av fylling av hjertets fartøyene kan bli dømt av øyet; vener epicardially lokalisert 18, og kan lett observeres (fig 3A, pilhode), arterier,som er mer intramyocardial 18, er også synlig gjennom overflaten av hjertet (fig 3A, pil). Kapillær fylling er også tydelig, som hjertevev har en svært høy tetthet av kapillærene, og derfor, når kapillarene fyll, vil hjertevev flukt med fargen på Microfil (Fig. 3A, stjerne). Dermed vil eventuelle vaskulære nettverk som ikke klarte å fylle bli merkbar på grunn av mangel på Microfil (Fig. 3B, C).
Uregelmessigheter i Microfil (stjernene i Fig 3B) forekommer ofte fordi hydrofobe natur Microfil vil føre til at det å trekke inn i seg selv og forårsake "bryter" innen fylt fartøy. Disse "bryter" kan reduseres dersom trykket i løpet av de fartøyene opprettholdes gjennom riktig tie-offs av de vaskulære utganger fra hjertet. Andre diskontinuiteter kan være forårsaket av luftbobler innenfor microfil. For å hindre innføring av luft, sørg for at angiocatheter er helt nedsenket i vann når du bytter fra perfusjon ap paratus til Microfil sprøyten. Dersom en luftboble er innført, kan det ofte bli fjernet ganske enkelt ved å fortsette Microfil perfusjon før boblen har blitt presset gjennom og ut av hjertets fartøyene.
Vaskulære nettverk ikke fylle helt dersom en del av den vaskulære sengen er blokkert (Fig. 3B, pil). Mens Heparin hemmer dannelsen av blodpropper, kan enkelte blokkeringer likevel oppstå på grunn av ufullstendig Heparin perfusjon før start av prosedyren, eller skyldes andre ukjente faktorer. Hvis en blokkering oppstår, er det til vår kunnskap, ingen metode for omplassering blokkeringen for å fullføre vaskulær mett. Ufullstendig fylling kan også oppstå hvis for lite trykk brukes under fylling, da Microfil ikke vil bli tvunget inn i alle de vaskulære senger og kapillære nettverk (Fig. 3C). Omvendt, kan for mye press føre til at kapillærene til å sprekke og extravasate Microfil i det omkringliggende vevet (Fig. 3D).
files/ftp_upload/3740/3740fig1.jpg "alt =" Figur 1 "/>
Figur 1. Oversikt over Microfil perfusjon ordningen. (A) aorta og PVC er kuttet om lag på nivå av mellomgulvet. (B) aorta ascendens er cannulated med en angiocatheter. (C) Vasodilatasjon buffer er perfused gjennom fartøyene, drevet av trykket perfusjon apparater (ikke avbildet), mens (D) de tre hovedgrener utenfor aortabuen er ligated. (E) 4% PFA er perfused gjennom coronaries mens begge ANTERO Vena Cavas er ligated. (F) Ved hjelp av en sprøyte, er Microfil perfused gjennom coronaries inntil det er observert spennende fra PVC.
Figur 2. Perfusjon apparater. To Erlenmeyer kolber, hver fylt med enten Vasodilatasjon buffer eller 4% PFA, er sluttet og trykksatt gjennom rør tilknyttet deres sidearms. Systemet er trykksatt gjennom manuell pumping avpære, og en trykkmåler er koblet til en av flaskene for å tillate overvåking og vedlikehold av trykk. Små rør utvide gjennom gummipropp og ned i væsken i hver kolbe. Press inn fra sidearms pumper væske fra hver kolbe ut disse mindre rør. Rørene deretter flette på en stoppekran som bare tillater væske å strømme fra en flaske av gangen.
Figur 3. Smak Microfilled hjerter. (A) Fartøy som er fylt godt vil ha få (om noen) brudd i Microfil, og hjertet vev vil være farget fargen på Microfil grunn av fylte kapillærene (stjerne, og sammenligne med C). Begge arterier (pil - venstre fremre nedstigende arterie) og vener (pilspiss - Venstre Coronary Vein) er synlig gjennom hjertet overflaten. (B) En hjerte med brudd i microfil (stjernene) samt blokkeringer i noen fartøy som hindret fullstendig Microfil penetrasjon. De blokkerte Fartøyene forblir rød (pil), som blodet ikke ble skylt ut i løpet av perfusjon prosessen. (C) En hjerte med fartøy som ble ufullstendig utfylt. Legg merke til vevet har ikke tatt på den gule fargen på Microfil, indikerer Microfil ikke trenge inn i kapillærene. (D) En hjerte hvor kapillærene brast under fylling, forårsaker Microfil å lekke inn i omkringliggende vev (pil).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cardiac vev har en svært høy metabolsk etterspørsel, og derfor krever en konstant tilførsel av næringsstoffer og oksygen fra blodet levert av koronar blodkar. Sykdommer i hjertets fartøy, som reduserer koronar funksjon på grunn av fartøy stenose og blokkering, kan føre til vevshypoksi og iskemi, og sette berørte pasienter med risiko for hjerteinfarkt og uopprettelig skade på hjertemuskelen. En bedre forståelse av sykelig tilstand av disse fartøyene er nødvendig, og kritisk til vår evne til å studere koronar skip er visualisering av blodkar. Her presenterer vi en metode for å forberede murine koronar blodkar for ex vivo avbildning ved å fylle blodkar med et røntgentett materiale. Denne protokollen ble spesielt utviklet for å sikre fullstendig fylling, og deretter visualisering, av alle koronare skip inkludert kapillærer.
For å sikre fullstendig fylling av alle kapillærene, den fyller agent, Microfil, må injiseres inn i en delvis lukket system som vil tvinge Microfil inn de mindre, høyere motstand skip innenfor vaskulære nettverket. For å lage dette delvis stenging i vårt in vivo fylle systemet, ligate vi de tre store, lav motstand arterier forgrening fra aortabuen. Selv om dette ikke utelukker alle andre mulige "lekkasje" poeng, de resterende fartøyer (hovedsakelig interkostalrom arteriene) er tilstrekkelig liten at noe press tapt gjennom dem påvirker ikke fullstendig fylling av koronar karsystemet. Når Microfil har perfused alle fartøyene i hjertet, vil det medfødte elastisk natur hjertemuskulatur og vaskulær vev presse Microfil ut av noen skip. For å forhindre dette tapet av Microfil, ligate vi alle store og tilgjengelig exit poeng, nemlig, både superior vena cavae, bakre vena cava, og aorta, etter at koronar blodkar er helt perfused. På denne måten er press maintained i hjertet til Microfil polymerizes, slik at Microfil å samsvare med skipet struktur under normal fysiologisk blodtrykk.
Alternativt, hvis visualisering av kapillærene ikke er nødvendig, er det også mulig å bare fylle arterielle eller bare den venøse vaskulære senger. Mer viskøse versjoner av Microfil kan blandes med en høy viskositet fortynningsmiddel (tilgjengelig fra FlowTech). Jo mer tyktflytende perfusate er i stand til å trenge inn i kapillærene, og derfor tillater visualisering av bare arteriene, eller bare årer hvis perfused fra den venøse siden. I tillegg presenterte protokollen her kan enkelt tilpasses andre arter eller ikke-voksne mus. Skalering av prosedyren til riktig matche størrelsen på dyret krever bare at kateteret og perfusjon slangen er riktig størrelse til dyrets aorta slik minimere lekker og hindre strekke eller bryte. De mengder væske injisert (dvs. heparin,mettet KCl, og Microfil) må også være riktig skalert.
Vår protokollen ble utviklet spesielt for injeksjon av Microfil og bildebehandling ved μCT, men det kan lett tilpasses for andre fylling agenter, enten for μCT analyse, eller andre ex vivo imaging teknikker. Når vi leter etter μCT kompatible fyllstoff, er det flere alternativer for røntgentett fargestoffer, som mange stoffer som brukes for å fylle og studere blodkar via andre bildebehandlingsprogrammer metoder (f.eks akryl) kan infunderes med radio ugjennomsiktig materiale, for eksempel en bly pigment 9 eller en osmium løsning 3. Uavhengig av fylling agenten utnyttet, og tilbyr μCT bildebehandling den fordelen at resultatene kan bli rekonstruert i en 3D-modell for å gi vaskulære målinger samt strukturell informasjon om forgrening mønster av det utfylte koronar fartøyene 6,7,14,19. I tillegg bevarer bildebehandling ved μCT omkringliggende vev, og dermed gir for ytterligere enalyses etter skanningen. Dermed kan fylles og skannet hjerter bli behandlet for histologisk analyse, og deler farget for ulike markører kan bli justert med μCT data å korrelere arteriell / venøs identitet, tilstedeværelse av glatte muskelceller strøk, eller flere histologiske indekser.
Andre vanlige vaskulære imaging teknikker krever også vaskulær fylling og vår protokoll kan lett tilpasses for perfusing de coronaries med noen av disse andre fylling agenter. Scanning elektronmikroskopi (SEM) krever fylling fartøyene og deretter løse opp bløtvevet bort fra den etablerte vaskulære støpt i en prosess kalt korrosjon casting. For å opprettholde formen på skipene uten støtten fra omkringliggende bløtvev, må fylle agenten være sterk og ikke sprø: ofte en akryl harpiks (f.eks Mercox, Batson s) 3,20,21. Mens SEM gir skanneoppløsningene vesentlig bedre enn i μCT bildebehandling 22, korrosjon støpteing prosedyre ødelegger vev, hindre noen ekstra vev analyse. En annen metode for ex vivo avbildning av koronar blodkar, Optisk Projection tomografi (OPT), kan oppdage synlig eller nær-synlig lys, og dermed åpner for påvisning av fluorescerende signaler i tillegg til kromogent utfellinger som lilla bunnfallet produsert av alkalisk fosfatase konvertering av BCIP / NBT (5-Bromo-4-klor-3-indolyl phosphate/4-nitro blå tetrazolium) 23-25. Visualisering av skip, derfor kan gjøres enten ved å fylle med et fluorescerende stoff (f.eks PU4ii: en polyuretan harpiks 3, eller fluorescein tilført dekstran 26), eller gjennom ikke-fylling metoder, slik som hel-mount immunodetection via enten fluorescens eller en histochemical kromogent bunnfallet (f.eks BCIP / NBT) 23. OPT bildebehandling kan oppnå oppløsninger litt bedre enn μCT (til rundt 1 mikron), men for både fylling og immunodetection metoder omkringliggende bløtvev må være kjemisk fjernet, noe som kan forstyrre enkelte antigener for histologisk analyse post-skanning.
Det er også flere metoder for avbildning av koronar blodkar som ikke krever vaskulær fylling eller immunodetection, og som sådan kan utføres in vivo. En teknikk, kontrast High Resolution ultralyd (CEHRUS), benytter gass fylte mikrobobler som kontrastmiddel. Injeksjon av disse mikrobobler i blodet åpner for visualisering av flyten av blod med real-time flow målinger ned til kapillær nivå, men det gir ikke en 3D-visning av de sistnevnte tok bilder fartøyene 2,27-31. En annen metode, har magnetisk resonans angiografi (MRA) også blitt brukt til image koronar fartøy 32-34, og nylige fremskritt i MRA har utvidet sine imaging evner å skaffe sanntid blodstrøm målinger 35,36. Mens MRA kan produsere 3D rekonstruksjoner av vessels bildebehandlet, oppløsningen av MRA er foreløpig begrenset til rundt 100 mikrometer, og derfor unnlater å identifisere mindre fartøy (kapillærer, arterioler og venules).
Siden både CEHRUS og MRA kan utføres på levende dyr, har de fordelen av gjentatte ganger og ikke-invasiv monitorering blodstrøm og vaskulær utvikling. Men den relativt lave oppløsningen MRA og mangelen på 3D-funksjonalitet fra CEHRUS utelukker avbildning av koronar nettverket som en helhet. Dermed ex vivo imaging teknikker som krever vaskulær fyllestasjoner agenter eller immunodetection er viktig for å oppnå høy oppløsning 3D-informasjon av koronar karsystemet, mens in vivo teknikker gir verdifull informasjon om funksjonaliteten til vaskulære nettverk (dvs. flow data) over tid . Kombinere in vivo tidsforløpet analyse med endepunkt ex vivo avbildning gir et kraftig system for studier av koronar blodkar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Musene ble behandlet med metoder godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Washington og i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr publisert av US National Institutes of Health (NIH Publikasjon nr. 85-23, revidert 1996).
Acknowledgments
Vi takker Dr. Kelly Stevens for første utprøving av protokollen, Dr. Michael Simons, Dr. Kip Hauch, og medlemmer av begge sine laboratorier for generell diskusjon.
Dette arbeidet er støtte ved NIH tilskudd HL087513 og P01 HL094374.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes |  BD Biosciences |
BD-309602 | |
| 1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles | BD Biosciences |
BD-309306 | |
| 2" x 2" Gauze pads | Med101store.com | SKU 2208 | |
| 24G ¾" Angiocath IV catheter | BD Biosciences |
BD-381112 | |
| 26G ½"gauge needles | BD Biosciences |
BD-305111 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich |
A9251 | 1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine) |
| Angled Graefe Forceps | Fine Science Tools |
11052-10 | |
| Cotton-tipped applicators: 6" non-sterile | Cardinal Health |
C15055-006 | |
| Curved Surgical Scissors | Fine Science Tools |
14085-09 | |
| Dissecting stereoscope and light source | Nikon Instruments |
NA | NA |
| Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches | Cole-Parmer |
YO-10915-12 | Filled with tar for pinning down the mouse |
| Fine Curved Forceps | Aesculap |
FD281R | Need two |
| Heparin, 5000 U/ml stock | APP Pharmaceuticals |
NDC 63323-047-10 | 1:100 dilution in water |
| KCl | Fisher Scientific |
P217 | Saturated solution in H2O |
| Ketamin (Ketaset), 100 mg/ml stock | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline |
| Microfil | FlowTech |
MV-122 (yellow). Other color options are also available. | Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed |
| Non-sterile Suture: 6-0, braided silk | Harvard Apparatus |
723287 | |
| Papaverine | American Regent Inc. |
NDC 0517-4010-01 | 4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich |
P6148 | Prepared as 4% solution |
| Perfusion Apparatus | See figure 2 | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools |
15018-10 | |
| Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock | Lloyd, Inc. |
NADA #139-236 | Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline |
References
- Couffinhal, T., Dufourcq, P., Barandon, L., Leroux, L., Duplaa, C. Mouse models to study angiogenesis in the context of cardiovascular diseases. Front. Biosci. 14, 3310-3325 (2009).
- Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease. Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).
- Krucker, T., Lang, A., Meyer, E. P. New polyurethane-based material for vascular corrosion casting with improved physical and imaging characteristics. Microsc. Res. Tech. 69, 138-147 (2006).
- Murakami, T. Blood flow patterns in the rat pancreas: a simulative demonstration by injection replication and scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 37, 497-508 (1997).
- Icardo, J. M., Colvee, E. Origin and course of the coronary arteries in normal mice and in iv/iv mice. J. Anat. 199, 473-482 (2001).
- Beighley, P. E., Thomas, P. J., Jorgensen, S. M., Ritman, E. L. 3D architecture of myocardial microcirculation in intact rat heart: a study with micro-CT. Adv. Exp. Med. Biol. 430, 165-175 (1997).
- Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1267-R1279 (2002).
- Jorgensen, S. M., Demirkaya, O., Ritman, E. L. Three-dimensional imaging of vasculature and parenchyma in intact rodent organs with X-ray micro-CT. Am. J. Physiol. 275, H1103-H1114 (1998).
- Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
- Zagorchev, L. Micro computed tomography for vascular exploration. J. Angiogenes. Res. 2, 7-7 (2010).
- Heinzer, S. Hierarchical microimaging for multiscale analysis of large vascular networks. Neuroimage. 32, 626-636 (2006).
- Dedkov, E. I. Synectin/syndecan-4 regulate coronary arteriolar growth during development. Dev. Dyn. 236, 2004-2010 (2007).
- Gossl, M. Functional anatomy and hemodynamic characteristics of vasa vasorum in the walls of porcine coronary arteries. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 272, 526-537 (2003).
- Rodriguez-Porcel, M. Altered myocardial microvascular 3D architecture in experimental hypercholesterolemia. Circulation. 102, 2028-2030 (2000).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
- Toyota, E. Vascular endothelial growth factor is required for coronary collateral growth in the rat. Circulation. 112, 2108-2113 (2005).
- Lavine, K. J., Long, F., Choi, K., Smith, C., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling to distinct cell types differentially regulates coronary artery and vein development. Development. 135, 3161-3171 (2008).
- Cheema, A. N. Adventitial microvessel formation after coronary stenting and the effects of SU11218, a tyrosine kinase inhibitor. J. Am. Coll. Cardiol. 47, 1067-1075 (2006).
- Lametschwandtner, A., Lametschwandtner, U., Weiger, T. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts--technique and applications: updated review. Scanning Microsc. 4, 889-941 (1990).
- Schneider, P. Simultaneous 3D visualization and quantification of murine bone and bone vasculature using micro-computed tomography and vascular replica. Microsc. Res. Tech. 72, 690-701 (2009).
- Manelli, A., Sangiorgi, S., Binaghi, E., Raspanti, M. 3D analysis of SEM images of corrosion casting using adaptive stereo matching. Microscopy Research and Technique. 70, 350-354 (2007).
- Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Meth. 4, 31-33 (2007).
- Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. , Cold Spring Protoc. 586-594 (2011).
- Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-Dimensional Analysis of Vascular Development in the Mouse Embryo. PLoS ONE. 3, e2853-e2853 (2008).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiol. Genomics. 30, 179-191 (2007).
- Behm, C. Z. Molecular Imaging of Endothelial Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Expression and Inflammatory Cell Recruitment During Vasculogenesis and Ischemia-Mediated Arteriogenesis. Circulation. 117, 2902-2911 (2008).
- Carr, C. L., Lindner, J. R. Myocardial perfusion imaging with contrast echocardiography. Curr. Cardiol. Rep. 10, 233-239 (2008).
- Leong-Poi, H. Assessment of Endogenous and Therapeutic Arteriogenesis by Contrast Ultrasound Molecular Imaging of Integrin Expression. Circulation. 111, 3248-3254 (2005).
- Villanueva, F. S. Microbubbles Targeted to Intercellular Adhesion Molecule-1 Bind to Activated Coronary Artery Endothelial Cells. Circulation. 98, 1-5 (1998).
- Wei, K. Quantification of Myocardial Blood Flow With Ultrasound-Induced Destruction of Microbubbles Administered as a Constant Venous Infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
- Beckmann, N., Stirnimann, R., Bochelen, D. High-Resolution Magnetic Resonance Angiography of the Mouse Brain: Application to Murine Focal Cerebral Ischemia Models. Journal of Magnetic Resonance. 140, 442-450 (1999).
- Kobayashi, H. 3D MR angiography of intratumoral vasculature using a novel macromolecular MR contrast agent. Magnetic Resonance in Medicine. 46, 579-585 (2001).
- Nezafat, R. B1-insensitive T2 preparation for improved coronary magnetic resonance angiography at 3 T. Magn. Reson. Med. 55, 858-864 (2006).
- Wagner, S., Helisch, A., Ziegelhoeffer, T., Bachmann, G., Schaper, W. Magnetic resonance angiography of collateral vessels in a murine femoral artery ligation model. NMR in Biomedicine. 17, 21-27 (2004).
- Cochet, H. In vivo MR angiography and velocity measurement in mice coronary arteries at 9.4 T: assessment of coronary flow velocity reserve. Radiology. , 254-441 (2010).
