Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Retrograde Perfusie en vullen van Muis coronaire bloedvaten als voorbereiding op Micro Computed Tomography Imaging

doi: 10.3791/3740 Published: February 10, 2012

Summary

Visualisatie van de coronaire bloedvaten is van cruciaal belang voor het bevorderen van onze kennis van hart-en vaatziekten. Hier beschrijven we een methode voor perfuseren muizen coronaire bloedvaten met een contrastmiddel siliconen rubber (Microfil), ter voorbereiding van micro-Computed Tomography (μCT) beeldvorming.

Abstract

Visualisatie van het vaatstelsel wordt steeds belangrijker voor het begrijpen van een groot aantal verschillende ziektebeelden. Hoewel diverse technieken bestaan ​​voor beeldvorming vaatstelsel weinig kunnen het vasculaire netwerk als geheel zichtbaar, terwijl de uitbreiding van een resolutie die de kleinere vaartuigen 1,2 bevat. Daarnaast hebben veel vasculaire giettechnieken vernietigen het omliggende weefsel, het voorkomen van verdere analyse van het monster 3-5. Een methode waarin deze aspecten worden omzeilt is micro-Computed Tomography (μCT). μCT beeldvorming kan scannen met een resolutie <10 micron, is geschikt voor het produceren 3D-reconstructies van de vasculaire netwerk, en laat het weefsel intact voor verdere analyse (bijvoorbeeld, histologie en morfometrie) 6-11. Echter, imaging schepen door ex vivo μCT methoden vereist dat de vaten worden gevuld met een contrastmiddel verbinding. Als zodanig is de juiste weergave van de bloedvaten die door μCT beeldvorming is afhankelijk vanbetrouwbare en volledige vulling van de schepen. In dit protocol beschrijven we een techniek voor het vullen van de muis coronaire vaten ter voorbereiding van μCT beeldvorming.

Twee overheersen technieken bestaan ​​voor het vullen van de coronaire bloedvaten: in vivo via infusen en retrograde perfusie van de aorta (of een tak van de aortaboog) 12-14, of ex vivo via een Langendorff perfusiesysteem 15-17. Hier beschrijven we een in-vivo aorta cannulatie methode die speciaal is ontworpen om ervoor te zorgen het vullen van alle schepen. We gebruiken lage viscositeit radiopake verbinding genoemd Microfil die wordt doorstroomd door de kleinste schepen de capillairen, evenals zowel de arteriële en veneuze zijden van het vasculaire op te vullen. Schepen worden geperfuseerd met buffer onder druk wordt perfusie-systeem, en vervolgens gevuld met Microfil. Om ervoor te zorgen dat Microfil vult de kleine hogere weerstand schepen, we afbinden van de grote takken emanating van de aorta, die het Microfil afleidt in de kransslagaders. Na het vullen is voltooid, de elastische aard van hartweefsel voorkomen knijpen Microfil uit van enkele schepen, we ligeren toegankelijk belangrijke vasculaire exit-punten onmiddellijk na het vullen. Daarom wordt onze techniek geoptimaliseerd voor volledige vulling en een maximaal behoud van het vulmiddel, zodat visualisatie van de volledige coronaire vasculaire netwerk - slagaders, haarvaten en aders gelijk.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Voorbereidingen voor het starten

  1. Vul elke zijde van de druk perfusie inrichting met vaatverwijdende buffer (4 mg / L Papaverine + 1 g / L Adenosine in PBS) of 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS, respectievelijk.
  2. Maak een 1/2cc insulinespuit (met een gegoten, 29g ½ "naald) door deze te vullen met 0,1 ml van 1:100 Heparine (5000U/ml voorraad) en het buigen van de naald tot ~ 120 graden hoek met de schuine kant op. Doe de Hetzelfde met een 1 ml spuit (met een 26G ½ "naald) gevuld met 0,3 ml verzadigde KCl-oplossing.

2. Het ontmaskeren van het hart en de aorta cannulating

  1. Verdoof de muis met behulp van uw verdoving van uw keuze. (We maken gebruik van een overdosis van een ketamine / xylazine mengsel:. IP-injectie van 130 mg / kg ketamine en 8,8 mg / kg Xylazine in zoutoplossing)
  2. Speld de verdoofde muis op het ontleden van lade, ventrale zijde naar boven. Open de buikholte met een middellijn incisie en trekken de huidde organen bloot. Verplaats de darmen aan een kant aan een regio van de Posterior Vena Cava (PVC) bloot te leggen.
  3. Injecteer Heparine-oplossing in de PVC. Als je de naald, over de naald gat met een wattenstaafje om lekken te voorkomen en houd het voor een paar seconden ingedrukt totdat de PVC wand stolsels en zeehonden. Wacht 2-3 minuten voor Heparine om zich te verspreiden in de hele muis circulatie.
  4. Ontleden het middenrif en borstkas, zodat u kunt het kloppend hart te observeren. Langzaam injecteren KCl oplossing in de PVC tot het hart arrestaties.
  5. Verwijder alle organen onder het middenrif en accijnzen het achterste gedeelte van de muis, het verlaten van het gebied anterior van het membraan intact. Verwijder het membraan, let daarbij goed op de PVC-snijden in de buurt van het membraan, zodat het deel proximaal van het hart is gemakkelijk te vinden in de volgende stappen.
  6. Zoek het afgesneden uiteinde van de aorta. Plaats een lange lengte van 6-0 gevlochten zijden hechtdraad onder de aorta een paar millimeter anterior weerm het afgesneden uiteinde zodanig dat het hechtmateriaal is op zichzelf terug verdubbeld. Snijd deze langere hechting in de helft dus er zijn 2 stukken van hechtdraad in de aorta. Plaats de angiocatheter in het afgesneden uiteinde van de aorta (afb. 1A, B) en bind elk hechtdraad met een dubbele knoop aan de angiocatheter zijn plaats te houden en eventuele tegendruk te voorkomen dat binnen de aorta naar buiten lekken.

3. Perfusie en Microfil injectie

  1. Sluit de angiocatheter de druk perfusie inrichting (fig. 2) en beginnen perfuseren de vaten met vaatverwijdende buffer (figuur 1C) door pompen van de perfusie inrichting een stuwdruk van 100-110 mm Hg. Controleer dat de buffer wordt perfuseren via de kransslagaders door ervoor te zorgen vloeistof wordt het verlaten van de PVC. Blijf perfuseren minstens 3 minuten of tot de vloeistof het verlaten van de PVC is duidelijk. (Ga verder met de volgende stappen tijdens het perfuseren.)
  2. Ontleden de ribben en de pin terug (of verwijderen) van de borstkas naar het hart bloot te leggen. Eenmaal blootgesteld, CAreful niet te laten het hart uit te drogen via druppeltjes van de buffer naar het hart van een buffer-doordrenkte stukje gaas. Ruim de thymus naar de aortaboog bloot te leggen. Ligeren de drie grote aorta takken met 6-0 gevlochten zijden hechtdraad om de vloeistof te garanderen wordt omgeleid via de kransslagaders in plaats van door deze grotere, lage weerstand schepen (fig. 1D).
  3. Perfuseren het hart met een fixatief gedurende 15 minuten en spoel na met Vasodilatatie buffer gedurende minstens 2 minuten. Ondertussen ligeren zowel Anterior Vena Cavae om Microfil te voorkomen dat lekken uit het hart na de injectie (fig. 1E). Plaats hechtingen rond de PVC en de aorta, maar ze niet vast tot na het vullen.
  4. Bereid de Microfil (zoals gespecificeerd in tabel van reagentia) en plaats hem in een 1 ml spuit. Vul de dissectie bak met voldoende water om de katheter (om de introductie van luchtbellen te voorkomen dat bij het overschakelen van perfusie slang aan op de Microfil spuit) te dekken. Koppel de perfusie apParatus van de katheter en sluit de voorbereide Microfil spuit.
  5. Spuit de Microfil in de aorta tot goede vulling van de kransslagaders is duidelijk (figuur 1F, 3A): de slagaders eerst te vullen, en dan de Microfil zal "morsen" in de haarvaten als het weefsel spoelt met de kleur van de Microfil. Eenmaal op de veneuze zijde de hydrofobe aard van de Microfil veroorzaakt het eerste gezicht zelfstandige gebieden als blijkt uit de kleinere vaartuigen. Blijf de Microfil injecteren totdat er een continue kolom vult de aderen. Volledige vulling zal duidelijk wanneer de Microfil continu in de vaten, en wordt verlaten via de PVC.
  6. Na het vullen is voltooid, snel vast de hechtingen die eerder rondom de PVC aorta om het elastische karakter van het hartweefsel voorkomen kneep Microfil uit de vaten.
  7. Bedek het hart met natte gaasje (gedrenkt met water uit de lade ontleden) Zijn uitdrogen en laat gedurende ongeveer 1 uur zitten kamertemperatuur tot Microfil gepolymeriseerd. Voorkom externe druk op de kern tijdens het polymerisatieproces, zoals optillen of draaien van de kern in een poging om een ​​vroege weergave van de gevulde vaten in de achterkant van het hart krijgen. Dit kan knijpen Microfil van een aantal schepen in een meer elastische gebied van het hart, waardoor breuken in de Microfil.
  8. Verwijder het hart en het 's nachts post-vast te stellen in 4% PFA bij 4 ° C. Vervolgens opslaan in 70% ethanol bij 4 ° C. Het hart vaatstelsel is nu klaar voor μCT beeldvorming.

4. Representatieve resultaten

Vaartuigen die effectief perfusie van Microfil zal continue ononderbroken Microfil in de vaten (Fig. 3A). De mate van vulling van de kransslagaders kan worden beoordeeld op het oog; aders worden epicardially ligt op 18, en kan gemakkelijk worden waargenomen (Figuur 3A, pijlpunt), slagaders,die meer intramyocardiale 18 ook zichtbaar in het oppervlak van het hart (fig. 3A, pijl). Capillaire vulling blijkt ook als hartweefsel een zeer hoge dichtheid van capillairen en derhalve bij de capillairen vulling het hartweefsel spoelt met de kleur van de Microfil (Fig. 3A, ster). Derhalve zal eventueel vasculaire netwerken niet vullen merkbaar door het ontbreken van Microfil (Fig. 3B, C).

Discontinuïteiten in de Microfil (sterretjes in figuur 3B) vaak verschijnen omdat het hydrofobe karakter van de Microfil wordt, zal deze overeenkomst in zichzelf en "breekt" in vol schepen veroorzaken. Deze "breekt" kan worden verlaagd indien de druk in de vaten wordt behouden door een goede tie-offs van de vasculaire exit-punten uit het hart. Andere discontinuïteiten kunnen worden veroorzaakt door luchtbellen in de microfil. Om de introductie van lucht te voorkomen, zorg ervoor dat de angiocatheter is volledig ondergedompeld in het water bij het overschakelen van de perfusie ap Paratus de Microfil spuit. Als een luchtbel ingevoerd, kan vaak eenvoudig worden verwijderd door de verdere Microfil perfusie tot de luchtbel is geschoven door en uit de kransslagaders.

Vasculaire netwerken niet volledig vullen als een deel van het vasculaire bed wordt geblokkeerd (Fig. 3B, pijl). Terwijl Heparine remt de vorming van bloedklonters, kan af en toe nog steeds blokkades optreden als gevolg van onvolledige Heparine perfusie voor het begin van de procedure, of door andere onbekende factoren. Als er een verstopping optreedt, is er, zover wij weten, geen methode voor het loskomen van de blokkade van de vasculaire vulling te voltooien. Onvolledige vulling kan ook ontstaan ​​als te weinig druk wordt tijdens het vullen als het Microfil niet gedwongen worden de vasculaire en capillaire netwerken (fig. 3C). Omgekeerd kan te veel druk waardoor de haarvaten te barsten en Microfil extravasaat in het omliggende weefsel (fig. 3D).

files/ftp_upload/3740/3740fig1.jpg "alt =" Figuur 1 "/>
Figuur 1. Overzicht van de Microfil perfusie regeling. (A) De aorta en PVC gesneden op ongeveer het niveau van het membraan. (B) de stijgende aorta wordt gecannuleerd een angiocatheter. (C) Vasodilatatie buffer wordt doorbloed door de vaten, gedreven door de druk perfusie apparaat (niet afgebeeld), terwijl (D) de drie belangrijkste takken uit de aortaboog worden geligeerd. (E) 4% PFA wordt doorbloed door de kransslagaders terwijl beide Anterior Vena Cava's worden geligeerd. (F) Met behulp van een spuit, wordt Microfil doorbloed door de kransslagaders totdat het wordt waargenomen het verlaten van de PVC.

Figuur 2
Figuur 2. Perfusie Apparatuur. Twee erlenmeyers, elk gevuld met Vasodilatatie buffer of 4% PFA, worden samengevoegd en onder druk door buizen verbonden met hun handwapens. Het systeem wordt onder druk door pompen van het handmatiggloeilamp en een manometer is verbonden met een van de kolven om controle en onderhoud van druk aan. Kleine tubes uit te breiden door middel van rubberen stop en naar beneden in de vloeistof in elke kolf. Druk het invoeren van de handwapens pompt de vloeistof uit elke kolf van deze kleinere buizen. De buizen vervolgens samenvoegen van een afsluitkraan die alleen kan vloeistof uit een kolf stromen tegelijk.

Figuur 3
Figuur 3. Proef Microfilled harten. (A) vaartuigen die goed gevuld wordt weinig (indien aanwezig) onderbrekingen in de Microfil en het hart weefsel gekleurd de kleur van de Microfil door de gevulde capillairen (ster en vergelijken met C). Zowel de slagaders (pijl - left anterior descending slagader) en aders (pijlpunt - Left Coronary ader) zichtbaar zijn door het hart oppervlak. (B) een hart onderbrekingen in de microfil (asterisk) en verstopping aantal vaten die volledig Mic voorkomenrofil penetratie. De geblokkeerde schepen blijven rood (pijl), als het bloed niet is weggespoeld tijdens de perfusie proces. (C) Een hart met schepen die onvolledig waren ingevuld. Let op de weefsels is niet ingegaan op de gele kleur van de Microfil, waarin de Microfil niet doordringen in de capillairen. (D) een hart waar de haarvaten burst tijdens het vullen, waardoor de Microfil te lekken in het omliggende weefsel (pijl).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hartweefsel heeft een zeer hoog metabolisme, en vereist dan ook een constante toevoer van voedingsstoffen en zuurstof uit het bloed geleverd door de coronaire vaten. Ziekten van de kransslagaders, die coronaire functie als gevolg van de schepen stenose en verstopping te verminderen, kan leiden tot weefsel hypoxie en ischemie, en zet de getroffen patiënten met risico op myocardinfarct en onherstelbare schade aan de hartspier. Een beter begrip van de zieke toestand van deze schepen is noodzakelijk en van cruciaal belang voor ons vermogen om coronaire vaten te bestuderen is visualisatie van de bloedvaten. Hier we een werkwijze voor het bereiden muizen coronaire vasculatuur voor ex vivo imaging vult het vaatstelsel een radiopaak materiaal. Dit protocol is speciaal ontworpen om volledig vullen, en vervolgens visualisatie, van alle coronaire vaten inclusief haarvaten te garanderen.

Om volledige vulling van alle haarvaten, het vullen agen zorgent Microfil moet worden geïnjecteerd in een gedeeltelijk gesloten systeem dat Microfil dwingt de kleinere vaartuigen hogere weerstand in het vasculaire netwerk. Om deze gedeeltelijke afsluiting te creëren binnen onze in-vivo-vulsysteem, we afbinden van de drie grotere, lage weerstand slagaders vertakken vanuit de aortaboog. Hoewel dit niet uit andere mogelijke "lekkage" punten, de resterende vaten (voornamelijk intercostale slagaders) voldoende klein geen druk verloren gaan ze niet interfereert met volledige vulling van de coronaire vasculaire systeem. Zodra de Microfil heeft doorbloed al de vaten in het hart, zal de aangeboren elastische karakter van de cardiale en vasculaire weefsel knijp de Microfil uit van enkele schepen. Om dit verlies van Microfil te voorkomen, ligeren alle grote en toegankelijk exit-punten, te weten, zowel superieure vena cavae, de achterste vena cava en de aorta, na de coronaire bloedvaten volledig is doorbloed. Zo druk maintained in het hart tot de Microfil polymeriseert, waardoor de Microfil naar het schip structuur voldoet onder normale fysiologische bloeddruk.

Alternatief, indien visualisatie van de capillairen niet nodig is, is het ook mogelijk om alleen het vullen arteriële of alleen de veneuze vasculaire. Dikkere versies Microfil kan gemengd worden met een hoge viscositeit oplosmiddel (verkrijgbaar bij FlowTech). De dikkere perfusievloeistof niet de capillairen dringen, en derhalve kunnen alleen de visualisatie van bloedvaten, of alleen de aders als perfusie van de veneuze zijde. Bovendien is de hier gepresenteerde protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere soorten of niet-volwassen muizen. Schalen de procedure De maat van het dier alleen vereist dat de katheter en de perfusieslang correct zijn bemeten aorta het dier zo weinig mogelijk weglekkende en voorkomen strekken of breken. De volumes van vloeistoffen ingespoten (dat wil zeggen heparine,verzadigde KCl, en de Microfil) moeten ook op passende wijze worden geschaald.

Ons protocol is speciaal ontworpen voor de injectie van Microfil en beeldvorming door μCT, echter, kan het gemakkelijk worden aangepast voor andere vulstoffen, hetzij voor μCT analyse, of andere ex vivo beeldvormende technieken. Bij het ​​zoeken naar μCT compatibel vulstoffen, zijn er verschillende opties van radiopake kleurstoffen, zoals veel stoffen die worden gebruikt voor het vullen en het bestuderen van vaatstelsel via andere beeldvormende technieken (bijv. acryl) kan worden toegediend met radio ondoorzichtig materiaal, zoals een lead pigment 9 of een osmium oplossing 3. Ongeacht de gebruikte vulmiddel, μCT imaging biedt het voordeel dat de resultaten kan worden gereconstrueerd naar een 3D-model van vasculaire metingen en structurele over de vertakking patroon van de gevulde coronairvaten 6,7,14,19. Daarnaast beeldvorming door μCT behoudt zich het omliggende weefsel, waardoor voor extra eenalyses na de scan. Zo kunnen gevuld en gescand hart worden verwerkt voor histologisch onderzoek en secties gekleurd voor verschillende markers kunnen worden gebracht met μCT gegevens arteriële / veneuze identiteit aanwezigheid van gladde spieren lagen of extra histologische indices correleren.

Andere veel voorkomende vasculaire beeldvormende technieken vereisen ook vasculaire vulling en ons protocol kan eenvoudig worden aangepast voor perfuseren de kransslagaders met een van deze andere vulstoffen. Scanning Electronen Microscopie (SEM) vereist vullen vaten en oplossen van de weke afstand van de vaste vasculaire gegoten in een proces dat corrosie gieten. Om de vorm van de vaten zonder ondersteuning van het omringende zachte weefsel te behouden moet het vulmiddel sterk en niet bros: vaak een acrylaat hars (bijv. Mercox, Batson's) 3,20,21. Terwijl SEM biedt scanresoluties superieur aan die van μCT beeldvorming 22, de corrosie castING procedure vernietigt het weefsel, waardoor geen extra weefsel analyse. Een andere methode ex vivo imaging van de coronaire vaatstelsel Optical Projection Tomography (OPT) detecteren zichtbare of bijna zichtbaar licht, waardoor aldus voor de detectie van fluorescerende signalen naast chromogene neerslaat zoals de paarse neerslag door alkalische fosfatase omzetting van BCIP / NBT (5-broom-4-chloor-3-indolyl phosphate/4-nitro blauw tetrazolium) 23-25. Visualisatie van schepen, dus ofwel kan worden bereikt door het vullen met een fluorescerende stof (bijvoorbeeld PU4ii: een polyurethaanhars 3 of fluoresceïne toegediend dextran 26) of door niet-vullende methoden, zoals geheel gemonteerde immunodetectie via een fluorescentie of histochemische chromogene neerslag (bijv. BCIP / NBT) 23. OPT beeldvorming kan bereiken resolutie iets beter dan μCT (tot ongeveer 1 micron), maar voor de vulling en het immunodetectie methoden het omliggende zachte weefsel moeten chemisch worden verwijderd, wat kunnen sommige antigenen voor histologische analyse na het scannen te verstoren.

Er zijn diverse methoden voor het afbeelden van de coronaire vaatstelsel die geen vasculaire vulling of immunodetectie en als zodanig kan worden uitgevoerd in vivo. Een techniek, Contrast Enhanced High Resolution Ultrasound (CEHRUS), maakt gebruik van gas gevulde microbolletjes als contrastmiddel. Injectie van deze microbellen in het bloed zorgt voor een visualisatie van de doorstroming van het bloed met real-time metingen van de tot op het capillaire niveau, maar het voorziet niet in een 3D-weergave van de afgebeelde schepen 2,27-31. Een andere methode, magnetische resonantie angiografie (MRA) is ook gebruikt om beeld coronaire vaten 32-34, en de recente ontwikkelingen in de MRA hebben uitgebreid de imaging-mogelijkheden voor het verkrijgen real-time bloedstroom metingen 35,36. Terwijl de MRA kan produceren 3D-reconstructies van de vessel afgebeeld, de resolutie van MRA is momenteel beperkt tot ongeveer 100 micron, en dus niet te identificeren kleinere schepen (capillairen, arteriolen en venulen).

Aangezien zowel CEHRUS en MRA kan worden uitgevoerd op levende dieren, ze bieden het voordeel van herhaaldelijk en niet-invasieve bewaking bloedstroom en vasculaire ontwikkeling. De relatief lage resolutie van MRA en het ontbreken van 3D mogelijkheden van CEHRUS weg beeldvorming van de coronaire netwerk als geheel. Zo is de ex vivo imaging technieken, die vasculaire vulstoffen of immunodetectie nodig zijn belangrijk voor het verkrijgen van hoge resolutie 3D-informatie van de coronaire vasculaire systeem, terwijl de in-vivo-technieken leveren waardevolle informatie met betrekking tot de functionaliteit van het vasculaire netwerk (dat wil zeggen, flow data) in de tijd . De combinatie van in vivo tijdsverloop analyse met eindpunt ex vivo beeldvorming zorgt voor een krachtig systeem voor de studie van de coronaire vaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Muizen werden behandeld met methoden die door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Washington en in overeenstemming met de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren gepubliceerd door de US National Institutes of Health (NIH publicatie nr. 85-23, herzien in 1996).

Acknowledgments

Wij danken Dr Kelly Stevens voor de eerste proeven van het protocol, Dr Michael Simons, Dr Kip Hauch, en leden van beide van hun labs voor algemene discussie.

Dit werk is ondersteuning door NIH subsidies HL087513 en P01 HL094374.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringes BD Biosciences BD-309602
1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles BD Biosciences BD-309306
2" x 2" Gauze pads Med101store.com SKU 2208
24G ¾" Angiocath IV catheter BD Biosciences BD-381112
26G ½"gauge needles BD Biosciences BD-305111
Adenosine Sigma-Aldrich A9251 1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine)
Angled Graefe Forceps Fine Science Tools 11052-10
Cotton-tipped applicators: 6" non-sterile Cardinal Health C15055-006
Curved Surgical Scissors Fine Science Tools 14085-09
Dissecting stereoscope and light source Nikon Instruments NA NA
Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches Cole-Parmer YO-10915-12 Filled with tar for pinning down the mouse
Fine Curved Forceps Aesculap FD281R Need two
Heparin, 5000 U/ml stock APP Pharmaceuticals NDC 63323-047-10 1:100 dilution in water
KCl Fisher Scientific P217 Saturated solution in H2O
Ketamin (Ketaset), 100 mg/ml stock Fort Dodge Animal Health NDC 0856-2013-01 Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline
Microfil FlowTech MV-122 (yellow). Other color options are also available. Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed
Non-sterile Suture: 6-0, braided silk Harvard Apparatus 723287
Papaverine American Regent Inc. NDC 0517-4010-01 4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine)
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Prepared as 4% solution
Perfusion Apparatus See figure 2
Spring Scissors Fine Science Tools 15018-10
Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock Lloyd, Inc. NADA #139-236 Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Couffinhal, T., Dufourcq, P., Barandon, L., Leroux, L., Duplaa, C. Mouse models to study angiogenesis in the context of cardiovascular diseases. Front. Biosci. 14, 3310-3325 (2009).
  2. Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease. Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).
  3. Krucker, T., Lang, A., Meyer, E. P. New polyurethane-based material for vascular corrosion casting with improved physical and imaging characteristics. Microsc. Res. Tech. 69, 138-147 (2006).
  4. Murakami, T. Blood flow patterns in the rat pancreas: a simulative demonstration by injection replication and scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 37, 497-508 (1997).
  5. Icardo, J. M., Colvee, E. Origin and course of the coronary arteries in normal mice and in iv/iv mice. J. Anat. 199, 473-482 (2001).
  6. Beighley, P. E., Thomas, P. J., Jorgensen, S. M., Ritman, E. L. 3D architecture of myocardial microcirculation in intact rat heart: a study with micro-CT. Adv. Exp. Med. Biol. 430, 165-175 (1997).
  7. Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1267-R1279 (2002).
  8. Jorgensen, S. M., Demirkaya, O., Ritman, E. L. Three-dimensional imaging of vasculature and parenchyma in intact rodent organs with X-ray micro-CT. Am. J. Physiol. 275, H1103-H1114 (1998).
  9. Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
  10. Zagorchev, L. Micro computed tomography for vascular exploration. J. Angiogenes. Res. 2, 7-7 (2010).
  11. Heinzer, S. Hierarchical microimaging for multiscale analysis of large vascular networks. Neuroimage. 32, 626-636 (2006).
  12. Dedkov, E. I. Synectin/syndecan-4 regulate coronary arteriolar growth during development. Dev. Dyn. 236, 2004-2010 (2007).
  13. Gossl, M. Functional anatomy and hemodynamic characteristics of vasa vasorum in the walls of porcine coronary arteries. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 272, 526-537 (2003).
  14. Rodriguez-Porcel, M. Altered myocardial microvascular 3D architecture in experimental hypercholesterolemia. Circulation. 102, 2028-2030 (2000).
  15. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
  16. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
  17. Toyota, E. Vascular endothelial growth factor is required for coronary collateral growth in the rat. Circulation. 112, 2108-2113 (2005).
  18. Lavine, K. J., Long, F., Choi, K., Smith, C., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling to distinct cell types differentially regulates coronary artery and vein development. Development. 135, 3161-3171 (2008).
  19. Cheema, A. N. Adventitial microvessel formation after coronary stenting and the effects of SU11218, a tyrosine kinase inhibitor. J. Am. Coll. Cardiol. 47, 1067-1075 (2006).
  20. Lametschwandtner, A., Lametschwandtner, U., Weiger, T. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts--technique and applications: updated review. Scanning Microsc. 4, 889-941 (1990).
  21. Schneider, P. Simultaneous 3D visualization and quantification of murine bone and bone vasculature using micro-computed tomography and vascular replica. Microsc. Res. Tech. 72, 690-701 (2009).
  22. Manelli, A., Sangiorgi, S., Binaghi, E., Raspanti, M. 3D analysis of SEM images of corrosion casting using adaptive stereo matching. Microscopy Research and Technique. 70, 350-354 (2007).
  23. Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Meth. 4, 31-33 (2007).
  24. Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Protoc. 586-594 (2011).
  25. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-Dimensional Analysis of Vascular Development in the Mouse Embryo. PLoS ONE. 3, e2853-e2853 (2008).
  26. Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiol. Genomics. 30, 179-191 (2007).
  27. Behm, C. Z. Molecular Imaging of Endothelial Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Expression and Inflammatory Cell Recruitment During Vasculogenesis and Ischemia-Mediated Arteriogenesis. Circulation. 117, 2902-2911 (2008).
  28. Carr, C. L., Lindner, J. R. Myocardial perfusion imaging with contrast echocardiography. Curr. Cardiol. Rep. 10, 233-239 (2008).
  29. Leong-Poi, H. Assessment of Endogenous and Therapeutic Arteriogenesis by Contrast Ultrasound Molecular Imaging of Integrin Expression. Circulation. 111, 3248-3254 (2005).
  30. Villanueva, F. S. Microbubbles Targeted to Intercellular Adhesion Molecule-1 Bind to Activated Coronary Artery Endothelial Cells. Circulation. 98, 1-5 (1998).
  31. Wei, K. Quantification of Myocardial Blood Flow With Ultrasound-Induced Destruction of Microbubbles Administered as a Constant Venous Infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
  32. Beckmann, N., Stirnimann, R., Bochelen, D. High-Resolution Magnetic Resonance Angiography of the Mouse Brain: Application to Murine Focal Cerebral Ischemia Models. Journal of Magnetic Resonance. 140, 442-450 (1999).
  33. Kobayashi, H. 3D MR angiography of intratumoral vasculature using a novel macromolecular MR contrast agent. Magnetic Resonance in Medicine. 46, 579-585 (2001).
  34. Nezafat, R. B1-insensitive T2 preparation for improved coronary magnetic resonance angiography at 3 T. Magn. Reson. Med. 55, 858-864 (2006).
  35. Wagner, S., Helisch, A., Ziegelhoeffer, T., Bachmann, G., Schaper, W. Magnetic resonance angiography of collateral vessels in a murine femoral artery ligation model. NMR in Biomedicine. 17, 21-27 (2004).
  36. Cochet, H. In vivo MR angiography and velocity measurement in mice coronary arteries at 9.4 T: assessment of coronary flow velocity reserve. Radiology. 254-441 (2010).
Retrograde Perfusie en vullen van Muis coronaire bloedvaten als voorbereiding op Micro Computed Tomography Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, Jr., W. M. Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging. J. Vis. Exp. (60), e3740, doi:10.3791/3740 (2012).More

Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, Jr., W. M. Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging. J. Vis. Exp. (60), e3740, doi:10.3791/3740 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter