Summary
Visualizzazione dei vasi coronarici è fondamentale per avanzare la nostra comprensione delle malattie cardiovascolari. Qui si descrive un metodo per la perfusione vascolare coronarica murino con una gomma di silicone radiopaco (Microfil), in preparazione per le micro-Tomografia Computerizzata (μCT) imaging.
Abstract
Visualizzazione della vascolarizzazione sta diventando sempre più importante per capire molti stati patologici diversi. Mentre esistono diverse tecniche per l'imaging vascolare, pochi sono in grado di visualizzare la rete vascolare nel suo insieme, mentre si estende a una risoluzione che include il 1,2 imbarcazioni più piccole. Inoltre, molte tecniche di fusione vascolari distruggere il tessuto circostante, impedendo ulteriori analisi del campione 3-5. Un metodo che elude questi temi è micro-Tomografia Computerizzata (μCT). μCT possibile eseguire la scansione di immagini con risoluzione inferiore a 10 micron, è capace di produrre ricostruzioni 3D della rete vascolare, e lascia intatto il tessuto per l'analisi successiva (ad esempio, l'istologia e la morfometria) 6-11. Tuttavia, navi imaging di ex vivo metodi μCT richiede che i vasi da riempire con un composto radiopaco. Come tale, la rappresentazione accurata di vasi prodotta da μCT immagini è subordinatoriempimento affidabile e completa dei vasi. In questo protocollo, si descrive una tecnica per il riempimento di vasi coronarici del mouse in preparazione per l'imaging μCT.
Due tecniche predominano esistono per il riempimento del sistema vascolare coronarico: in vivo via cannulazione e perfusione retrograda dell'aorta (o di un ramo dell'arco aortico) 12-14, o ex vivo mediante un sistema di perfusione Langendorff 15-17. Qui si descrive un metodo in cannulazione aortica vivo che è stato specificamente progettato per garantire il riempimento di tutte le navi. Usiamo un composto a bassa viscosità radiopaco chiamato Microfil che può perfondere attraverso i piccoli vasi per riempire tutti i capillari, nonché entrambi i lati arterioso e venoso della rete vascolare. Le navi sono perfusi con tampone utilizzando un sistema di pressione di perfusione, e poi riempito con Microfil. Per garantire che Microfil riempie i piccoli vasi di resistenza superiori, abbiamo legare i rami di grandi dimensioni emanating dall'aorta, che devia il Microfil nelle coronarie. Una volta che il riempimento è completata, per impedire la natura elastica del tessuto cardiaco da spremere fuori Microfil di alcuni vasi, si legare accessibili i punti importanti uscita vascolari immediatamente dopo il riempimento. Pertanto, la nostra tecnica è ottimizzato per il riempimento completo e la ritenzione massimo dell'agente di riempimento, permettendo la visualizzazione della completa rete vascolare coronarico -, capillari, arterie e vene simili.
Protocol
1. Preparativi prima di iniziare
- Riempire ciascun lato dell'apparecchio perfusione pressione con tampone Vasodilator (4 mg / L papaverina + 1 g / L adenosina in PBS) o 4% paraformaldeide (PFA) in PBS, rispettivamente.
- Preparare una siringa 1/2cc insulina (con una 29G permanentemente attaccato ½ "needle), riempiendolo con 0,1 ml di eparina 1:100 (stock 5000U/ml) e piegando l'ago ~ 120 gradi con il smussata. Do the stesso con una siringa da 1 ml (con 26G ½ "spillo) riempita con 0,3 ml di soluzione satura di KCl.
2. L'esposizione del cuore e dell'aorta cannulating
- Anestetizzare il mouse utilizzando il anestetico di scelta. (Usiamo una dose eccessiva di una miscela di ketamina / Xylazina:. IP iniezione di 130 mg / kg di ketamina e 8,8 mg / kg Xylazina in soluzione salina)
- Appunta il mouse anestetizzato sul vassoio dissezione, il lato ventrale. Aprire la cavità addominale con un'incisione mediana e ritrarre la pelleper esporre gli organi. Spostare l'intestino da un lato per esporre una regione del posteriore Vena Cava (PVC).
- Iniettare la soluzione di eparina in PVC. Come si estrae l'ago, coprire il foro dell'ago con un cotton-applicatore con la punta per evitare perdite e tenerlo premuto per alcuni secondi fino a quando i coaguli di muro in PVC e guarnizioni. Attendere 2-3 minuti per l'eparina per disperdere tutta la circolazione del mouse.
- Sezionare il diaframma e la gabbia toracica in modo da poter osservare il cuore che batte. Iniettare lentamente soluzione KCl in PVC finché gli arresti cardiaci.
- Rimuovere tutti gli organi sotto il diaframma e accise, la porzione posteriore del mouse, lasciando la regione anteriore del diaframma intatto. Rimuovere il diaframma, avendo cura di tagliare il PVC in prossimità del diaframma porzione prossimale al cuore è facile individuare in fasi successive.
- Individuare l'estremità tagliata dell'aorta. Posizionare una lunghezza lunga di 6-0 sutura di seta intrecciata sotto l'aorta di pochi millimetri anteriori from l'estremità tagliata in modo tale che la sutura è raddoppiata su se stesso. Tagliare questa sutura a metà in modo più ci sono 2 pezzi di sutura sotto l'aorta. Inserire il angiocatheter nell'estremità taglio dell'aorta (Fig. 1A, B) e collegare ogni sutura con un doppio nodo per tenere il angiocatheter in posizione e impedire qualsiasi contropressione all'interno della aorta fuoriuscita.
3. Perfusione e iniezione Microfil
- Collegare il angiocatheter all'apparecchio perfusione pressione (Fig. 2) e iniziare la perfusione dei vasi con tampone vasodilatatore (Fig. 1C) pompando l'apparecchio perfusione ad una pressione di guida 100-110 mmHg. Doppio controllare che buffer viene perfusione attraverso le coronarie, garantendo liquido è uscita dal PVC. Continuare a perfusione per almeno 3 minuti o fino a quando il fluido che esce il PVC è chiaro. (Continua con le fasi successive, mentre perfusione.)
- Staccare le costole e schiena pin (o rimuovere) la gabbia toracica per esporre il cuore. Dopo l'esposizione, essere cacon cautela e precisione per non lasciare che il cuore asciugare dalla spremitura gocce di tampone sul cuore da un buffer imbevuta di pezzo di garza. Sgombrare il timo per esporre l'arco aortico. Legare i tre rami principali dell'aorta 6-0 con sutura intrecciata in seta per garantire il fluido viene deviata attraverso le coronarie piuttosto che attraverso questi, i più grandi vasi a bassa resistenza (Fig. 1D).
- Perfusione del cuore con fissativo per 15 minuti, quindi risciacquare con tampone vasodilatazione per almeno 2 minuti. Nel frattempo, legare sia anteriore vena cava per impedire Microfil di fuoriuscire dal cuore dopo l'iniezione (Figura 1E). Suture Luogo in tutto il PVC e l'aorta, ma non li stringono fino a dopo il riempimento.
- Preparare la Microfil (come specificato nella tabella dei reagenti) e caricarlo in una siringa da 1 ml. Riempire la vaschetta dissezione con acqua sufficiente a coprire il catetere (in modo da impedire l'introduzione di bolle d'aria quando si passa dalla tubazione perfusione alla siringa Microfil). Scollegare la perfusione apparatus dal catetere e collegare la siringa Microfil.
- Iniettare il Microfil nell'aorta fino buon riempimento delle arterie coronarie è evidente (figure 1F, 3A): le arterie si riempirà prima, e poi la si Microfil "cadere" nei capillari come le vampate di tessuto con il colore della Microfil. Una volta sul lato venoso, la natura idrofoba del Microfil causa di apparire inizialmente come sfere indipendenti come emerge dai vasi più piccoli. Continuare ad iniettare il Microfil finché una colonna continua riempie le vene. Riempimento completo sarà evidente quando il Microfil è continua all'interno dei vasi, e si esce attraverso il PVC.
- Dopo il riempimento è completata, rapidamente serrare le suture precedentemente disposte intorno al PVC e aorta per impedire la natura elastica del tessuto cardiaco dalla spremitura del Microfil fuori dei vasi.
- Coprire il cuore con una garza umida (inzuppato d'acqua dal vassoio di dissezione) Per evitare che si secchi, e lasciate riposare per circa 1 ora a temperatura ambiente fino a quando il Microfil è polimerizzato. Evitare pressioni esterne sul cuore durante il processo di polimerizzazione, come sollevamento o ruotando il cuore nel tentativo di ottenere una vista precoce dei vasi pieni nella parte posteriore del cuore. Questo può spremere Microfil da alcuni vasi in una zona più elastica del cuore, causando rotture nel Microfil.
- Rimuovere il cuore e post-fix in 4% PFA notte a 4 ° C. Poi memorizzare in etanolo 70% a 4 ° C. La vascolarizzazione cardiaca è ora pronto per l'imaging μCT.
4. Risultati rappresentativi
Le navi che vengono effettivamente irrorate da Microfil avrà continua, ininterrotta per tutta Microfil i vasi (Fig. 3A). Il grado di riempimento dei vasi coronarici può essere giudicato da occhio; vene si trovano epicardially 18, e può essere facilmente osservato (Fig. 3A, freccia); arterie,che sono più intramiocardico 18, sono anche visibili attraverso la superficie del cuore (Fig. 3A, freccia). Riempimento capillare è anche evidente, come tessuto cardiaco ha una elevata densità di capillari, e pertanto, quando il riempimento capillari, il tessuto cardiaco si filo con il colore del Microfil (Fig. 3A, stella). Così, le reti vascolari che non hanno riempire sarà evidente a causa della mancanza di Microfil (Fig. 3B, C).
Discontinuità nella Microfil (asterischi in Fig. 3B) appaiono spesso perché la natura idrofoba del Microfil lo farà a contrarsi in sé e provocare "infrange" all'interno dei vasi riempiti. Questi "pause" può essere ridotta se la pressione all'interno dei vasi è mantenuta attraverso adeguata tie-off dei punti di uscita vascolari dal cuore. Altre discontinuità può essere causato da bolle d'aria all'interno del Microfil. Per evitare l'introduzione di aria, assicurarsi che il angiocatheter è completamente immerso in acqua quando si passa dalla perfusione ap Paratus alla siringa Microfil. Se una bolla d'aria viene introdotta, spesso può essere rimosso semplicemente continuando la perfusione Microfil finché la bolla è stato spinto attraverso e fuori dei vasi coronarici.
Reti vascolari non può riempire completamente se una porzione del letto vascolare è bloccato (Fig. 3B, freccia). Mentre eparina inibisce la formazione di coaguli di sangue, blocchi occasionali possono ancora verificarsi a causa di perfusione eparina incomplete prima di iniziare la procedura, oa causa di altri fattori sconosciuti. Se si verifica un blocco, non vi è, a nostra conoscenza, nessun metodo per staccare il blocco per completare il riempimento vascolare. Riempimento incompleto può anche causare una pressione troppo poco viene utilizzato durante il riempimento, la Microfil non sarà costretto a tutti i letti vascolari e le reti capillari (Fig. 3C). Al contrario, una pressione eccessiva può causare i capillari a scoppiare e estravasare Microfil nel tessuto circostante (Fig. 3D).
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Figura 1. Panoramica del sistema di perfusione Microfil. (A) L'aorta e il PVC vengono tagliati approssimativamente a livello del diaframma. (B) L'aorta ascendente è cannulata con uno angiocatheter. (C) buffer vasodilatazione è perfuso attraverso i vasi, spinti dalla pressione di perfusione l'apparato (non raffigurato), mentre (D) i tre rami principali fuori l'arco aortico vengono legati. (E) 4% PFA è perfuso attraverso le coronarie, mentre entrambe le anteriori Vena Cavas sono legato. (F) usando una siringa, Microfil viene perfuso attraverso le coronarie finché si osserva in uscita dal PVC.
Figura 2. Apparecchiatura di perfusione. Due beute, ciascuna riempita di tampone vasodilatazione o 4% PFA, sono uniti e pressurizzato attraverso tubi collegati alle loro armi bianche. Il sistema viene pressurizzato mediante pompaggio manuale deibulbo, e un manometro è collegato ad uno dei flaconi per consentire il monitoraggio e il mantenimento della pressione. Piccoli tubi si estendono attraverso tappi di gomma e giù nel fluido in ogni contenitore. Pressione in entrata dalla pompe armi bianche del fluido da ciascuna beuta questi tubi più piccoli. I tubi quindi unire ad un rubinetto che consente solo passaggio del fluido da un pallone alla volta.
Figura 3. Assaggiate cuori microriempiti. (A) Le navi che vengono riempite ben avranno pochi (se del caso) Soggiorni in Microfil, e il tessuto cardiaco sarà tinge il colore del Microfil a causa della piena capillari (a stella, e si confrontano con C). Entrambe le arterie (freccia - dell'arteria discendente anteriore sinistra) e le vene (punta di freccia - Sinistra Vein coronarica) sono visibili attraverso la superficie del cuore. (B) Un cuore con interruzioni nel Microfil (asterischi) e blocchi in alcuni vasi che impedito Mic completorofil penetrazione. I vasi rimangono bloccati rosso (freccia), come il sangue non è stata lavata durante il processo di perfusione. (C) Un cuore con le navi che sono stati completamente riempiti. Si noti il tessuto non ha preso il colore giallo del Microfil, indicando il Microfil non penetrano nei capillari. (D) Un cuore in cui il burst capillari durante il riempimento, causando la Microfil di perdite nel tessuto circostante (freccia).
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Discussion
Tessuto cardiaco ha una forte domanda metabolica, e richiede pertanto un costante rifornimento di sostanze nutritive e ossigeno dal sangue erogata dal sistema vascolare coronarico. Malattie dei vasi coronarici, che riducono la funzione a causa di stenosi coronarica nave e blocco, possono portare a ipossia tissutale e di ischemia, e mettere i pazienti affetti a rischio di infarto miocardico e danni irreparabili al muscolo cardiaco. Una migliore comprensione dello stato di malattia di questi vasi è necessario, e critico per la nostra capacità di studiare i vasi coronarici è la visualizzazione del sistema vascolare. Qui, viene presentato un metodo per preparare murino vascolare coronarico per l'imaging ex vivo riempiendo la vascolarizzazione con un materiale radiopaco. Questo protocollo è stato specificamente progettato per garantire un riempimento completo e, successivamente, la visualizzazione, di tutti i vasi coronarici tra capillari.
Per garantire un riempimento completo di tutti i capillari, il riempimento agent, Microfil, deve essere iniettato in un sistema parzialmente chiuso che costringerà il Microfil in parti più piccole, dei vasi di resistenza più elevati all'interno della rete vascolare. Per creare questa chiusura parziale in vivo all'interno del nostro sistema di riempimento, abbiamo legare le tre arterie più grandi, bassa resistenza diramano dall'arco aortico. Anche se questo non esclude tutti gli altri possibili "perdite" punti, le navi restanti (soprattutto le arterie intercostali) è sufficientemente piccolo che la pressione persa con loro non interferisce con riempimento completo del sistema vascolare coronarico. Una volta che il Microfil ha irrorato tutti i vasi del cuore, la natura innata elastica del tessuto cardiaco e vascolare spremere il Microfil di alcuni vasi. Per evitare questa perdita di Microfil, si legare tutti i punti di uscita grandi e accessibili, cioè, sia vena cava superiore, la vena cava posteriore, e l'aorta, dopo il sistema vascolare coronarico è completamente perfusi. In questo modo, la pressione è maintained nel cuore fino Microfil polimerizza, permettendo di Microfil conformi alla struttura recipiente sotto pressione sanguigna normale fisiologico.
In alternativa, se la visualizzazione dei capillari non è richiesto, è anche possibile riempire solo i letti arteriosi o venosi solo vascolari. Le versioni più viscose di Microfil possono essere miscelati usando un diluente alta viscosità (disponibile da Flowtech). Il perfusato più viscoso è in grado di penetrare i capillari, e quindi consente la visualizzazione di solo le arterie e le vene o solo se perfusi dal lato venoso. Inoltre, il protocollo qui presentata può essere facilmente adattato ad altre specie o non-topi adulti. Scaling la procedura per armonizzare correttamente la dimensione dell'animale richiede semplicemente che il catetere e la tubazione perfusione sono dimensionate per aorta dell'animale in modo da ridurre al minimo perdite e prevenire allungamento o rottura. I volumi di fluidi iniettati (cioè eparina,KCl saturo, e la Microfil) devono essere opportunamente scalati.
Il protocollo è stato progettato specificamente per l'iniezione di Microfil e imaging μCT, tuttavia, può essere facilmente adattato per altri agenti di riempimento, sia per l'analisi μCT, o altre tecniche di imaging ex vivo. Quando cerchi μCT cariche compatibili, ci sono diverse opzioni di coloranti radiopachi, come molte altre sostanze utilizzate per il riempimento e lo studio vascolatura attraverso altri metodi di imaging (ad esempio acrilico) può essere infuso con materia radio opaco, come un pigmento di piombo 9 o una soluzione osmio 3. Indipendentemente dell'agente di riempimento utilizzato, μCT immagini offre il vantaggio che i risultati possono essere ricostruiti in un modello 3D per fornire misurazioni vascolari, nonché informazioni strutturali sul modello di ramificazione dei vasi coronarici riempite 6,7,14,19. Inoltre, imaging μCT preserva il tessuto circostante, permettendo così un ulteriorealyses dopo la scansione. Così, cuori pieni e scansionato possono essere preparate per l'analisi istologica, e sezioni colorate per vari marcatori possono essere allineati con i dati per correlare μCT identità arteriosa / venosa, la presenza di strati muscolari lisce, o altri indici istologici.
Altri comuni tecniche di imaging vascolare richiedono riempimento vascolare e il protocollo può essere facilmente adattato per perfusione delle coronarie con qualsiasi di questi altri agenti di riempimento. Microscopia Elettronica a Scansione (SEM) richiede la compilazione dei vasi e quindi sciogliere il tessuto molle lontano dal cast vascolare stabilito in un processo chiamato fusione corrosione. Per mantenere la forma dei vasi senza il supporto del tessuto molle circostante, l'agente di riempimento deve essere forte e non fragile: spesso una resina acrilica (ad esempio Mercox, Batson) 3,20,21. Mentre SEM fornisce risoluzione di scansione di gran lunga superiore a quella del μCT immagini 22, il cast di corrosioneprocedura di ING distrugge il tessuto, per prevenire ogni ulteriore analisi dei tessuti. Un altro metodo di imaging ex vivo del sistema vascolare coronarico, tomografia a proiezione ottica (OPT), in grado di rilevare la luce visibile o vicino-visibile, e quindi consente il rilevamento di segnali fluorescenti in aggiunta a cromogenico precipitati come il precipitato porpora prodotta da fosfatasi alcalina conversione di BCIP / NBT (5-bromo-4-cloro-3-indolile phosphate/4-nitro blu tetrazolio) 23-25. La visualizzazione dei vasi, pertanto, può essere eseguita dal riempimento con una sostanza fluorescente (es PU4ii: un poliuretano resina 3, fluoresceina o infusa destrano 26), o tramite riempimento non metodi, come montaggio intero immunorivelazione sia tramite fluorescenza o istochimica precipitato cromogenico (ad esempio BCIP / NBT) 23. OPT di imaging possono raggiungere risoluzioni leggermente migliore di quello di μCT (a circa 1 micron), ma, sia per il riempimento e la immunodetemetodi ction il tessuto molle circostante deve essere chimicamente cancellata, che possono alterare alcuni antigeni per l'analisi istologica post-scansione.
Vi sono anche diversi metodi per l'imaging del sistema vascolare coronarico che non richiedono riempimento vascolare o immunorivelazione, e come tale può essere eseguita in vivo. Una tecnica, Contrast Enhanced Ultrasound ad alta risoluzione (CEHRUS), utilizza microbolle di gas riempite come agente di contrasto. Iniezione di tali microbolle nel flusso sanguigno permette la visualizzazione del flusso di sangue con misurazioni in tempo reale del flusso fino al livello capillare, ma non fornisce una vista 3D dei vasi 2,27-31 forma di immagini. Un altro metodo, angiografia con risonanza magnetica (MRA) è stato utilizzato anche alle navi di immagini coronarici 32-34, e recenti progressi nella MRA hanno esteso le sue capacità di imaging per ottenere misurazioni in tempo reale del flusso di sangue 35,36. Mentre MRA in grado di produrre ricostruzioni 3D della vessels immaginata, la risoluzione del MRA è attualmente limitata a circa 100 micron, e non riesce quindi ad identificare imbarcazioni più piccole (arteriole e capillari, venule).
Poiché sia CEHRUS e MRA possono essere eseguiti su animali vivi, offrono il vantaggio di flusso monitoraggio ripetutamente e non invasivo sangue e sviluppo vascolare. Tuttavia, la risoluzione relativamente bassa del MRA e la mancanza di capacità 3D da CEHRUS preclude l'imaging della rete coronarica nel suo complesso. Pertanto, le tecniche di imaging ex vivo che richiedono vascolari agenti di riempimento o immunorivelazione sono importanti per ottenere informazioni alta risoluzione 3D del sistema vascolare coronarico, mentre la tecniche in vivo fornire informazioni utili riguardanti la funzionalità della rete vascolare (cioè, dati di flusso) nel tempo . Combinando l'analisi in vivo corso del tempo con end point ex vivo imaging fornisce un potente sistema per lo studio del sistema vascolare coronarico.
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Disclosures
I topi sono stati trattati con metodi approvati dalla Institutional Animal Care e del Comitato uso della University of Washington e in conformità con la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicato dal US National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, riveduta nel 1996).
Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. Kelly Stevens per le prove iniziali del protocollo, il dottor Michael Simons, Hauch Kip Dr., e membri di entrambi i loro laboratori per la discussione generale.
Questo lavoro è l'assistenza di sovvenzioni NIH HL087513 e P01 HL094374.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes |  BD Biosciences |
BD-309602 | |
| 1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles | BD Biosciences |
BD-309306 | |
| 2" x 2" Gauze pads | Med101store.com | SKU 2208 | |
| 24G ¾" Angiocath IV catheter | BD Biosciences |
BD-381112 | |
| 26G ½"gauge needles | BD Biosciences |
BD-305111 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich |
A9251 | 1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine) |
| Angled Graefe Forceps | Fine Science Tools |
11052-10 | |
| Cotton-tipped applicators: 6" non-sterile | Cardinal Health |
C15055-006 | |
| Curved Surgical Scissors | Fine Science Tools |
14085-09 | |
| Dissecting stereoscope and light source | Nikon Instruments |
NA | NA |
| Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches | Cole-Parmer |
YO-10915-12 | Filled with tar for pinning down the mouse |
| Fine Curved Forceps | Aesculap |
FD281R | Need two |
| Heparin, 5000 U/ml stock | APP Pharmaceuticals |
NDC 63323-047-10 | 1:100 dilution in water |
| KCl | Fisher Scientific |
P217 | Saturated solution in H2O |
| Ketamin (Ketaset), 100 mg/ml stock | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline |
| Microfil | FlowTech |
MV-122 (yellow). Other color options are also available. | Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed |
| Non-sterile Suture: 6-0, braided silk | Harvard Apparatus |
723287 | |
| Papaverine | American Regent Inc. |
NDC 0517-4010-01 | 4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich |
P6148 | Prepared as 4% solution |
| Perfusion Apparatus | See figure 2 | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools |
15018-10 | |
| Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock | Lloyd, Inc. |
NADA #139-236 | Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline |
References
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