En poleret og forstærket tyndt befolket kranie Window for langsigtet Imaging af Mouse Brain

Summary

Vi præsenterer en fremgangsmåde til dannelse af en billeddannende vindue i mus kraniet, der strækker sig millimeter og er stabil i måneder uden inflammation i hjernen. Denne fremgangsmåde er velegnet til langsgående studier af blodgennemstrømning, cellulære dynamik, og celle / vaskulær struktur med to-foton-mikroskopi.

Abstract

In vivo billeddannelse af cortical funktion kræves optisk adgang til hjernen, uden afbrydelse af intrakranial miljøet. Vi præsenterer en fremgangsmåde til dannelse af en poleret og forstærket fortyndet kraniet (porte) vinduet i mus kraniet, som spænder over flere millimeter i diameter og er stabil i måneder. Kraniet fortyndes til 10 til 15 um i tykkelse med en håndholdt boremaskine til at opnå optisk klarhed, og derefter overlejret med cyanoacrylat lim og et dækglas til: 1) tilvejebringe stivhed, 2) inhibering af fornyet knoglevækst og 3) reduktion af lysspredning fra uregelmæssigheder på knogleoverfladen. Da kraniet ikke er overtrådt, er enhver betændelse, der kan påvirke processen ved at blive undersøgt stærkt reduceret. Billeddannelse dybder på op til 250 um under den kortikale overflade kan opnås ved anvendelse af to-foton laser scanning-mikroskopi. Dette vindue er velegnet til at studere cerebral blodgennemstrømning og cellulær funktion i både bedøvede og vågen præparater. Det yderligere giver oplighed for at manipulere celleaktivitet under anvendelse optogenetics eller at afbryde blodstrømmen i målrettede fartøjer ved bestråling af cirkulerende fotosensibilisatorer.

Protocol

1. Forberedelse til operation ⁱ

1. Rengøres kirurgiske værktøjer ved sonikering i en blanding af Maxizyme og kirurgisk mælk i en ultralydsrenser. Autoklaven kirurgiske værktøjer, før hvert eksperiment.
2. Sørg for, at alle nødvendige reagenser og engangsartikler er til rådighed. En liste af reagenser og engangsartikler er tilvejebragt i tabel 2. Reagenser og engangsartikler, der kommer i kontakt med udsatte væv, skal være sterile, når det er muligt.
3. Induktion af anæstesi. Typiske anæstetika er egnede til overlevelsesundersøgelser er beskrevet i tabel 1. Sørg for kirurgisk plan anæstesi ved at kontrollere for manglende tå knivspids refleks. Den optimale alder af mus er 3 til 6 uger. De kranier af yngre mus er blødere og mere vanskeligt at tynde. Ældre mus har tykkere kranier, der vil bløde mere i løbet af udtynding procedure.
4. Fastgøre dyr i en stereotaktisk ramme ^1. En liste over kirurgisk udstyr er tilvejebragt i tabel 2.
5. Opretholde kroppens temperaturturen ved 37 ° C under anvendelse af en feedback-reguleret rektal proben og varmepude.
6. Anvend oftalmologiske salve til øjnene for at holde på fugtigheden.
7. Barber hovedbunden med en lille elektrisk barbermaskine.
8. Rengøre hovedbunden med Betadine, efterfulgt af pensling med 70% (v / v) isopropylalkohol.
9. Hvis det ønskes, kontrollere, at hjerte og vejrtrækning satser inden for et normalområdet ved hjælp af et pulsoximeter. En mus, bør disse tal center omkring 10 og 2 Hz, hhv.
10. Opvarme en prøve af sterilfiltreret kunstig cerebral spinalvæske (ACSF) til 37 ° C (125 mM NaCI, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 3,1 mM _CaCl2, 1,3 mM _MgCl2, pH 7,4) (alle kemikalier fra Sigma) ^2.

2. Montering af en chef Frame

1. Fjerne hovedbunden hele dorsale kraniet overflade med en tang og kirurgiske sakse. Trim huden lateralt til kanterne af de temporale musklerne på hver side af kraniet og posterior til musklerne i halsen (fig. 1A).
2. Anvende en skalpel for at fjerne den tynde periosteum fra overfladen af ​​kraniet.
3. Rens kraniet med en fugtig bomuld tippes applikator og tør kraniet overflade med en strøm af luft fra en støv kan. Derefter påføres et tyndt lag af cyanoacrylat lim til hele kraniet overfladen. Lad limen tørre grundigt. Dette lag af lim er nødvendig for korrekt adhæsion af dental cement i efterfølgende trin. Den cyanoacrylat lim behøver ikke at blive steriliseret.
4. Vedhæfte et metal konnektor til kraniet overfladen, væk fra området af det ønskede vinduet. For bedøvede præparater, kan en lille møtrik fastgøres til skallen med en klat cyanoacrylat lim, der senere kan skrues ind i billeddannende indretning ved en bolt (fig. 1B, 1L og 1N). Forsegle bagsiden af ​​møtrikken med tape for at sikre, at limen ikke ind i trådene i tilknytning til kraniet. Møtrikken og tape skal steriliseres ved autoklavering før operationen.
5. For vågen billedbehandling præparater, vedhæfte en mere stiv brugerdefineret stik med to fastgørelsespunkter (fig. 1 M og 1 N). Bor to huller i kraniet over den kontralaterale kortikale halvkugle med en ½ mm bor Burr, og derefter indføre to # 000 selvskærende skruer. Disse skruer vil hjælpe forankre hovedmonteringsindretningen til kraniet. Anvendes kun en fuld omdrejning af skruen, for at undgå at påføre tryk til den underliggende hjernebark. Derefter lægger den brugerdefinerede metal korset bar med en lille klat cyanoacrylat lim i lillehjernen. Lad cyanoacrylat lim til at tørre grundigt. Dette metal stik i høj grad reducerer de frihedsgrader og forenkler udflytning af samme imaging felt i longitudinelle studier. Et bredt tværstang giver god plads til elektrode placering og stimulering af vibrissae. Detaljerede planer for at generere brugerdefinerede hovedmonteringsindretningen og fastgørelsesanordning er tilgængelige online (SICS / links.html "> http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). De skruer og tværstangen skal steriliseres ved autoklavering før operationen.
6. Dækker hele kraniet overfladen, med undtagelse af placeringen af vinduet med et lag af dental cement (fig. 1C og 1D). Sikre, at alle udsatte kanter af huden er dækket af cement. Komponenterne af dentalcement behøver ikke at blive steriliseret.

3. Generation af en poleret og Forstærket tyndt befolket kranie (porte) Window

1. Sørg for, at bore grater er skarpe og undgå at genbruge dem. Ved hjælp af en lav hastighed på tandlægebor, tynd en 2 mm med 2 mm region i somatosensoriske cortex med en ½ mm grat. Veksler mellem befugtning kraniet med ACSF, og derefter tørring af kraniet overflade med en blid strøm af luft fra en gas duster, våd til afkøling og tørres til udtynding. Dette kræver fortynding gennem cancelløse lag af kraniet, som kan bløde, men kan styre sined ved skylning med ACSF (fig. 1E). Kraniet begynder at bøje under let tryk af boret, når det er ~ 50 um, og pial fartøjer bør være synligt gennem våd knogle (Fig. 1F). Ved denne tykkelse, vil små hvide pletter i knoglen bliver synlige i nogle få sekunder umiddelbart efter den tørre skallen overflade fugtes.
2. På dette tidspunkt, tynde knoglen yderligere. Anvendes en langsommere bor hastighed, dvs 1000 rpm, hvilket barberinger kraniet overflade med kun et let tryk. Brug små kontrollerede bevægelser, mens du holder boret som en pen og kun gælde kraft i den tværgående retning. Knoglen skal på ~ 10 til 15 um på den endelige tykkelse (fig. 1G). Når benet er tilstrækkeligt tyndt, vil de små hvide pletter i knoglen ikke længere være synlig, når den tørre skallen overflade fugtes.
3. Polere vinduet region tinoxid pulver. Vedhæft et færdiglavet boret, der er blevet dyppet i silikone akvarium fugemasse og medtrukket, hvilket giver en tilspidset pisk (indsat, fig. 1H). Silicone pisk skal fremstilles mindst en dag før kirurgi, og steriliseret med 70% isopropanol før brug. Placer en lille knivspids pulver på vinduet sammen med en dråbe ACSF (Fig. 1H). Omrøre opslæmningen over vinduet i op til ti minutter ved forsigtigt at trykke enden af ​​den bevægelige pisk til kraniet overfladen. Skyl væk tinoxidet pulveret grundigt fra vinduet med ACSF og tør knoglen grundigt med en blid strøm af luft. Overfladeuregelmæssigheder og adhærente knoglefliserne efterladt ved boring i de foregående trin skal fjernes efter polering (fig. 1 H og 1I). Tinoxidet pulver ikke behøver at blive steriliseret.
4. Skåret firkantede stykker no. 0 dækglas lidt mindre end størrelsen af ​​vinduet. Brug en skribent til forsigtigt at score adskilt vandrette og lodrette linier i dækglasset med en lige kant. Derefter placeres dækglasset i en petriskål og knOck skålen med en tabel kant for at adskille glasstykker. Hele petriskål kan derefter autoklaveres for at sikre sterilitet.
5. Placer en passende størrelse dækglas i nærheden af ​​den tørrede vinduet. Påfør en lille klat cyanoacrylat lim over vinduet med spidsen af ​​en brækket træ vatpind, og hurtigt skubbe forudskårede stykke dækglas toppen af ​​lim. Undgå at skabe bobler nedenunder dækslet glasset. Skub forsigtigt dækglasset mod kraniet overfladen, og holde nogle få sekunder (fig. 1J og 1O). Lad limen tørre grundigt over 15 minutter. Overskydende cyanoacrylat lim kan fjernes fra den øvre overflade af dækglasset med et skalpelblad efter at det er tørret. Forsegler kanterne af dækglasset med dentalcement og danne en let forhøjet godt til at holde vand til dypning linsen (fig. 1K og 1O).

4. Recovery

1. Placere dyret på en varm bur efter kirurgi. Overvågdyr jævne mellemrum, indtil den er kommet sig fuldstændigt fra anæstesi.
2. Hvis præparatet er beregnet til at overleve i mere end en dag, tilvejebringe buprenorphin (0,03 ug pr g gnaver) for analgesi. Vi typisk billede af dyret mindst én dag efter den første implantation.

5. Imaging Forberedelse

1. Stabilisere dyret på en optisk breadboard til billeddannelse ved hjælp af rammen som et hoved støtte (fig. 1 liter og 1 M). En begrænsning apparat kan fremstilles ud fra kommercielt tilgængelige optomekaniske komponenter fra Qioptiq eller Thorlabs. Vores separat plade kan transporteres mellem kirurgiske og to-foton imaging suiter med dyret, og alle fysiologiske overvågningsudstyr samlet som én enhed ^3.
2. Hvis blodtilførslen billeddannelse ønskes, injiceres 0,05 ml 5% (w / v) fluorescens-dextran farvestof opløst i sterilt saltvand, enten gennem halevenen eller infraorbitale vene at mærke blodserum (fig. 2A og 2C til 2H 4-7. Dette skal ske under fuld narkose. Infraorbitale vene administration kan være lettere for begyndere, da dextranopløsninger er mere tyktflydende. Halevenen kan være vanskelige at lokalisere i mørke mus og venen tendens til at kollapse efter en mislykket injektion. Til billeddannelse vaskulaturen med grøn emission, skal du bruge en fluoresceinisothiocyanat dextran. For rød emission, bruge en Texas Red dextran. Med højmolekylære dextraner, vil farvestoffet forbliver i cirkulation i adskillige timer. Alternativt kan dyr med endogene fluorescerende mærker blive afbildet direkte på et passende to-foton excitation bølgelængde. Dextranopløsningen kan fryses i portioner til fremtidig brug.
3. Rengør forsigtigt vinduet overfladen med en fugtig bomuld tippet applikator.
4. For forlænget billeddannelse af anæstetiserede præparater, injiceres steril Ringer-lactatopløsning intraperitonealt i et volumen på 3 uL per gram hver 2 timer for at opretholde legemsvæsker og energibehov. </ Li>
5. Når billedbehandling dyr i vågen tilstand, begrænse nakkestøtten til kun et par timer ad gangen for at reducere stressniveauet. Retur dyret til hjemmet bur mellem billeddiagnostiske sessioner for mad og vand.

6. Repræsentative resultater

En vellykket vindue vil tillade billeddannelse dybder op til 250 um under pial overfladen i flere måneder. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at undersøge in vivo kapillær blodstrømning ^{4, 8,} mikrogliale aktivering ^{8, 9} og dendritiske struktur i corticale parenkym ^8. I et eksempel, anvender vi to-foton billeddannelse at vise corticale vaskulaturen af en bedøvet Thy1 gult fluorescerende protein (YFP) mus, når blodserum mærkes ved intravenøs injektion af Texas Red dextran (fig. 2A). Dural fartøjer er ofte ses lidt over den kortikale overflade i dura mater (figur 2C, pil). Store pial arterioler og venuler lie på den kortikale overflade (fig. 2D). Penetrerende fartøjer gren fra denne overflade netværk og dykke ned i cortex, hvor de forgrene i et tæt kapillærbane der fodrer cortexvæv (fig. 2E til 2H). Dendritiske dorne af dyb YFP udtrykke corticale neuroner, et signal er endogen for denne mus linie, kan afbildes samtidigt i en anden kanal ¹⁰ (fig. 2B til 2H). Den anden harmoniske signal knoglen blev opsamlet i en tredje kanal, og kan anvendes til at måle tykkelsen af den fortyndede kraniet efter opsamling af billeddata stabler (fig. 2A til 2C).

Kortikale vaskulære dynamik er dybt påvirket af bedøvelsesmidler ^11. I et andet eksempel viser vi en video af spontan vasoactivity opsamlet ved to-foton mikroskopi fra en tilvænnede vågen mus. Fremtrædende vasomotoriske svingninger i lumendiameter ses med en pial arteriole, men ikke med en tilstødende venulen. Dettebasal række vasoactivity formindskes med urethan anæstesi ^4. For at kvantificere spontane og fremkaldt ændringer i blodgennemstrømning, bruger vi tilpasset linieskanning teknikker til at fange både den vaskulære diameter og røde blodlegemer hastighed individuelle fartøjer. Detaljeret midler til kvantitativ blodstrømning billeddannelse ved hjælp af to-foton-mikroskopi findes ^{3, 12.}

Figur 1. Proceduren for en HAVNE vindue. (A til K) Billeder af sekventielle trin i proceduren for at generere en HAVNE vindue. Se teksten for detaljerede anvisninger. β = bregma og λ = lambda. (L) bolt og møtrik-system til fastgørelse af hovedet ved billeddannelse af bedøvede præparater. (M) Brugerdefineret bearbejdet tværstang hovedmonteringsindretningen for vågen præparater. I dette eksempel blev en konnektor også implanteret i gentagne electrocorticogram optagelser. (N)Skematisk diagram, der viser dorsale afbildning af hovedmonteringsindretningen, og placeringen af ​​forskellige komponenter. Møtrikken anvendes panel L er ment som et alternativ til tværbjælken anvendelse i panel M. To # 000 selvskærende skruer tilsættes med tværstangen beslag til øget stabilitet til vågen billeddannende præparater. (O) Skematisk diagram, der viser tværsnittet af en HAVNE vindue.

Figur 2. To-foton billeddannelse af vaskulatur og neuronal struktur i mus cortex. Alle billeder blev indsamlet ved hjælp af en HAVNE vindue i en Thy1-YFP mus efter 2 dage efter vinduet implantation ^10. Maksimal projektion over 150 um i væv i den koronale orientering viser fortyndet kraniet i forhold til vaskulaturen (A) og dendritter (B). Knoglen (blå) blev detekteret ved at opsamle den anden harmoniske fluorescens ved 450 nm emission med 900 nm excitation 6. De dendritiske områderne neuroner (grøn) er endogene for Thy1-YFP transgen mus linie. (CH) maksimal fremspring over 50 um i væv i den horisontale retning i forskellige dybder under pia. Data er fra den samme billedstak vist i panel A og B. Dural fartøjer kan være synlig lige over den kortikale overflade (pil i c).

Forkortelser

ACSF = kunstig cerebral spinalvæske
HAVNE = poleret og forstærket fortyndet kraniet vindue
YFP = gult fluorescerende protein

^{sikrer jeg,} at de beskrevne procedurer er godkendt af din lokale Institutional Animal Care og bruge Udvalg.

Discussion

To-foton billeddannelse gennem et HAVNE vindue kræver transmission gennem den indsnævrede ben og dura, som dæmper laserlyset og tilføjer optiske aberrationer på større dybder ^8. Til trods for denne ulempe kan billeddannelse dybder op til 250 um under pial overflade opnås med 900 nm excitation. Større billeddannelse dybder kan i princippet være muligt med længere excitationsbølgelængder ^13. En væsentlig fordel ved denne fremgangsmåde er fraværet af kortikale inflammation, der kan eksistere kortvarigt i fremgangsmåder involverer alle kraniotomi ^{14, 15.} En velforberedt HAVNE vindue bør ikke vise nogen åbenlyse tegn på angiogenese eller betændelse efter implantation ^8. Dette kan vurderes in vivo i løbet af eksperimentet ved billeddannelse vaskulatur struktur, eller ved detektion af morfologiske ændringer af mikroglia i CX (3) CR1-GFP mus linie ^{8, 16, 17.} Endvidere bør post-hoc immunohistologi være prudformet til at bekræfte fraværet af astrogliose i den overfladiske cortex, for eksempel anvendelse af et antistof til glial fibrillært surt protein ^8.

Den mest krævende trin i generering af en HAVNE vindue fortynding knoglen til 10 til 15 um i tykkelse. Periodisk undersøgelse af vinduet under et bredt område fluorescens dissektion mikroskop er også anvendelig til at måle kraniet tykkelse under udtynding procedure. Fluorescerende mærker nær kortikale overflade bør være klart synligt gennem den våde kraniet. For en mere nøjagtig måling af skallen tykkelse, kan den anden harmoniske signal fra knoglen måles i en tredimensionel stak under to-foton-mikroskopi (fig. 2A til 2C). Hvis dette gøres før påføring af lim og dækglas, knoglen og kan yderligere fortyndes om nødvendigt. Utilstrækkelig udtynding resulterer i dårlig billedbehandling dybde. Polering vil fortsætte med at fortynde skallen, når boringen ikke længere er muligt, og vil hjælpereducere overfladeuregelmæssigheder og omliggende knogle chips. I indledende undersøgelser har vi fundet, at polering forbedrer billeddannende dybde uger efter den første implantation. Imidlertid har en grundig analyse af fordelene ved poleringen ikke blevet udført.

Anvendelsen af ​​cyanoacrylat lim og dækglas oven på knogle er et kritisk trin for at reducere lysspredning og tillader dybere billeddannelse. På grund af boreprocessen vil overfladen af ​​knoglen være uregelmæssig, selv efter polering, og derfor lysspredning. Anvendelsen af ​​cyanoacrylat lim fylder i disse uregelmæssigheder, og den overliggende dækglas efterlader en ikke-spredning glat overflade. Vigtigere er det refraktive indeks for lim og dækglas, der er 1,45 og 1,52 i overensstemmelse med producentens specifikationer, der er tæt indekseret tilpasset til den i knoglen ved 1,55 ^18. Dette er en forbedring i forhold til med luft eller vand over den indsnævrede kraniet, som har brydningsindekser 1,00 end 1,33. Kritisk, at cyanoacrylat lim hjælper yderligere til at hindre knogle genvæksten. Dette gør det muligt længderetningen billedbehandling i op til tre måneder, uden behov for yderligere vedligeholdelse, efter den første operation.

En anden årsag til dårlig billeddannelse dybde beskadigelse pial fartøjer, der fører til blødning eller ødem. Vibrationer fra boret bør minimeres. I en lille del af sagerne vil blødning i dura være uundgåelig. Dette skyldes vaskulaturen af ​​dura mater er kontinuert med vaskulære plexus af kraniet, som er forstyrret under udtynding procedure. Præparater med alle tegn på sub-dural blødning bør kasseres som dural fortykkelse og angiogenese vil opstå. Succesraten af ​​de havne, vinduet kan være så højt som 80% med praksis.

Til nogle forsøg kan det være nødvendigt at injicere farvestoffer / vira eller indsætte elektroder i vævet under Porte vinduet. Det er muligt at frembringe en lillehul ved siden af vinduet, hvorigennem pipetter eller elektroder kan indføres ved hjælp af en stereotaktisk arm eller Sutter manipulator ^19. Dette hul kan lukkes igen med ben voks, hvis dyret er, der skal scannes igen i fremtidige sessioner. Imidlertid indførelse af elektroder kan naturligvis føre til inflammation i cortex og akut patologi, såsom spreading depression.

Porte vindue bør være velegnet til enhver afbildningsmodalitet kræver optisk adgang til hjernen. Dette omfatter overflade billeddiagnostiske teknikker såsom iboende optisk billeddannelse ²⁰ og laser speckle billedbehandling ^21, eller optiske sektionering teknikker såsom konfokal ²² eller to-foton mikroskopi ^23. Desuden bør en HAVNE præparat kan forbedre opløsning i bredt felt transkraniel billeddiagnostiske teknikker såsom optiske kohærenstomografi ²⁴ og Photoacoustic mikroskopi ^25.

Endelig Porte vinduetegnet til billeddannelse af vågne dyr som dækglasset tilføjer stivhed til vinduet ^4. Hovedmonteringsindretningen er yderligere stabiliseret ved at indføre to selvskærende # 000 skruer til den kontralaterale hemisfære forud for påføring af dentalcement (fig. 1 I). Tilvænning til hoved-fiksering er vigtigt, at færre dyr bevægelse under billedbehandling. En ny dyr kan gradvist vant til nakkestøtternes over en periode på 3 til 7 dage før billeddannelse, startende med 15 min sessioner og arbejder op til flere timer.