Summary
最近のハイスループットシーケンシング技術が大幅にクロマチン免疫沈降（ChIP）実験の感度を増加させ、精製した細胞や組織解剖を使用して、そのアプリケーションを求めている。ここでは、チップ技術を使用する方法を描く
Abstract
エピジェネティクスは、研究クロマチンの状態は、異なる発達段階で異なる種類の細胞で異なる遺伝子発現に寄与してどのように急速に発展してフィールドのままです。エピジェネティックな調節は、成人期の胚発生と恒常性の間に細胞分化を含む生物学的プロセスの広いスペクトルに貢献しています。エピジェネティクス研究における重要な戦略は、様々なヒストン修飾とクロマチン因子が遺伝子発現を調節する方法を検討することである。この問題に対処するために、クロマチン免疫沈降（ChIP）は、目的の細胞のDNAを持つ特定の要因の関連のスナップショットを取得するために広く使用されています。
ChIPのテクニックは、一般的に再現性のあるデータを生成するために豊かさと均一性を得ることができる出発材料として、培養細胞を使用しています。しかし、いくつかの制約があります：まず、ペトリ皿に細胞を成長させる環境は、このように、in vivoでのものとは異なる場合があります生体内の細胞の内因性のクロマチンの状態を反映していない。第二に、細胞のすべてではないタイプは、ex vivoで培養することができます。人々は、ChIPアッセイのための十分な材料を得ることができ、そこから細胞株の限られた数があります。
ここでは、 ショウジョウバエの組織を用いたChIP実験を行うための方法について説明します。出発原料は、このように正確に内因性のクロマチンの状態を反映することができ、生きている動物から組織を解剖しています。組織の多くの異なったタイプのこのメソッドの適応性は、研究者がより多くの生物学的に多くの生体 1、2 のエピジェネティック制御についての関連問題に対処することができます。ハイスループットシーケンシング（CHIP-SEQ）でこのメソッドを組み合わせることにより、さらに研究者らはエピ風景を取得することができます。
Protocol
（チップ全体の手順は約2日かかります。ハイスループットシーケンシング用チップライブラリーの調製別の2〜3日かかります。）
1。解剖するとChIP実験（〜1万個の細胞）の組織を準備する
- 冷PBS + 1×プロテアーゼ阻害剤（7倍のストック溶液を得るために1.5 mlの1X PBS中のプロテアーゼインヒビターカクテル1ペレットを溶解）で（ ショウジョウバエ精巣の例えば、200ペア）を、目的の組織を解剖+ PMSF（最終濃度は100μg/ mL）を。回組織をすすぎ、阻害剤と同じPBS溶液200μLに組織を再懸濁します。
- サンプルを修正するには、5.5μLの37％ホルムアルデヒド（37使用する前に1分間℃の水浴中で暖かいホルムアルデヒド）を追加します。 15分、渦の間に5分ごとに37℃でインキュベートします。
- 2分間解決するために組織のサンプルを氷上に置きます。 450μLのPBS（プロテアーゼ阻害剤とPMSFを含む）で2倍すすいでください。サンプルは、現在店舗になります-20℃でのD ChIPのための十分な材料を得るために解剖を数回繰り返します。
2。 ChIPアッセイのためにタンパク質-DNAコンジュゲート上清の準備
- 1.75 mLのエッペンドルフチューブにステップ1.3から十分なサンプルを兼ね備えています。
- 組織サンプルからPBSを削除します。溶解緩衝液200μL（50mMのトリス-HCl、pHは7.6、1mMの塩化カルシウム、0.2％トリトンX-100またはNP-40、5 mMの酪酸、および1xプロテアーゼ阻害剤カクテル）を追加します。溶解バッファー（0.5mMのPMSFの最終濃度）に新鮮なPMSFストック溶液を追加します。組織が任意の凝集することなく完全に解離するまで10分間RT（室温）でインキュベートし、青ホモジナイザー（フィッシャー猫＃749521から1590）でホモジナイズする。
- 超音波：パワー20で使用するマイクロチップの超音波（Misonix HS-XL200）。 50秒を氷上で10秒と残りのための超音波洗浄します。 （長い超音波処理は、小さな断片が得られるように最適な超音波処理時間は、経験的に決定されるべきである。ヒストンに対する抗体を用いたChIPのために4-5回を繰り返します。eの修正は、我々は通常、約200から300 bpまでのクロマチン超音波処理し、転写因子やクロマチンレギュレータ（例えば、ポリコーム蛋白質）のために、我々は通常、200から1000塩基対にクロマチン超音波洗浄します。しかし、最適なフラグメントサイズは経験的にテストする必要があります。注：必ず加熱からサンプルを防ぐために超音波処理中であっても、チューブを氷上にキープ！
- 1.8mlのRIPAバッファー（10mMトリス-HCl、pHが7.6で説明したのと同じ濃度のプロテアーゼ阻害剤とPMSFと1mMのEDTA、0.1％SDS、0.1％のNa-デオキシコール酸、1％トリトンX-100、追加することにより、試料を希釈する以前に）。架橋を逆にする（O / N）℃で一晩65℃2μL、5M NaClおよびインキュベーションを追加することにより、入力コントロールとして40μLを保存します。
- ビーズに抗体を結合するために、1.5mlのエッペンドルフチューブに40μLのプロテインAビーズを追加し、その後、2分間、4℃で600μLのPBSと岩を追加磁石にビーズを適用し、上清を除去します。 100のPBSμLと目的の抗体を追加します（抗体の量は、empir決定されるべきであるically）。 4時間1時間または4℃室温でインキュベートします。
- 磁石でビーズから上清を除去し、ステップ2.4からビーズに1mLのクロマチン抽出液を追加します。 4℃で回転させてCO / N.
- 磁石にチップのサンプルを適用し、上清を除去します。 10分ごとに4℃以下のバッファ°Cでビーズを洗浄します：
RIPA緩衝液1 mLで2倍[1.89 mLの 'RIPAバッファー' + 315μL7Xのプロテアーゼ阻害剤+ 20μLPMSF];
RIPA緩衝液1 mLで2倍+ 0.3 M NaClを[1.89 mLをRIPAバッファー+ 220μlの3 MのNaCl];
LiClを緩衝液1 mL（0.25 M LiClを、0.5％NP40、0.5％NaDOC）で2倍。
1X 1X TE 1mlの+ 0.2％トリトンX-100;
1X TEを1 mLの1X。 - 架橋を逆にするには、100μlのTEバッファーでビーズを再懸濁し+ 3μL、10％SDS +プロテイナーゼK（20 mg / mL）を5μL。 65℃でインキュベートCO / N.
- 磁石にビーズを適用し、新しいチューブに上清を移す。上清は、あなたのDNAサンプルが含まれています。 100μLのTE + 0.5 Mでビーズを洗浄NaClおよび2上清を兼ね備えています。
- フェノール - クロロホルムDNAサンプルを抽出します。 Chlorofrom：IAA（25:24:1）を混合し、ボルテックスフェノール200μLを追加します。室温で5分間、14Kでスピン。また、DNAはキアゲンPCR精製キットを使用して抽出することができます。
- 新しいチューブに上清/水層を移し、上清の各1mLのために20 mg / mLで20μg/ mLの（あるいはグリコーゲンの1μLの最終濃度にリニアアクリルアミドを追加しても使用することができます。グリコーゲンが使用されますリニアアクリルアミドはアッセイをシークエンシングのために使用されている間に、後続の定量PCRまたはPCR分析は。）3M NaOAcの20μLと500μLの100％EtOHを追加します。よく混ぜ、80℃でインキュベート℃で10分間。 4℃で20分間最大速度で回転℃、
- 上清を除去し、300μLの70％エタノールで洗浄する。 50μLのTE緩衝液で空気乾燥して再懸濁したサンプル。サンプルは現在-20℃で保存することができますサンプルは、定量PCR（qPCR）アッセイ（ 図1）に使用することができます。
3A。定量PCRを用いたChIP-EDのDNAを分析する
- 原液、1/10、1/100、1/1000、1/5000：標準曲線を作成するには、以下の濃度でゲノムDNAを希釈する。
- 各プライマーペアに対して、ステップ3a.1、入力制御とChIP-ED DNAからゲノムDNAを96ウェルプレートで重複して定量PCRを設定します。
10μLの2倍のSYBR PCRミックス（Fermentas、K0222）
1μL10μMフォワードプライマー;
1μL10μMリバースプライマー;
XμLのChIP-ED DNA（インプットコントロール、またはゲノムDNA）;
YμLのヌクレアーゼフリーH 2 Oは、20μLの反応液量を調整することができます。 - ミニプレートスピナー（Labnet）を96ウェルプレートをスピンダウンします。
- 以下の条件を使用して、ABI 7300リアルタイムPCRシステム（または他のリアルタイムPCRシステム）で定量PCRを行います。
ステージ1：50℃2分、1サイクルのC;
ステージ2：95℃で10分間、1サイクル;
ステージ3：95℃15秒、60℃で1分間、40℃ycles。
ステージ4（解離段階）：95℃15秒、60°C、1分間、95℃15秒間CのC。 - 解離曲線を確認してください。熱解離のプロット1つのピークは、PCR反応から単一のアンプリコンを示唆している。複数のピークは、プライマーペアと非特定の製品を示し、定量PCRのデータは、使用すべきではありません。
- 3aの希薄化後のゲノムDNAのシリーズを使用して標準曲線に基づいているCT（サイクル閾値）の値に従って、DNA量を解決する数式を計算することにより、各プライマーセットのPCR反応の指数関数的増幅の線形位相を決定します。 1。
- CHIP-ED DNAと入力コントロールのCt値は、CT値の直線範囲内にある場合は、2.4でのChIP-ED DNAと入力コントロールの希釈率に従って、CHIP-ED DNA対入力の濃縮を計算します。
図3b。ハイスループットシークエンシング用のCHIP-ED DNAを増幅する。
- CHIP-ED DNAミックスのエンド修復（使用EPICENTRE DNA END-リペアキット）、氷の上で設定します。
ステップ2.12 1から34μlのゲノムDNA（0.1〜5μg）を
5μlの10倍エンド修理バッファ
5μlを2.5 mMのdNTPミックス
5μlの10mMのATP
XμlのH 2 O 49μlに反応量を調整する
1μlのエンド修復酵素ミックス（T4 DNAポリメラーゼ+ T4ポリヌクレオチドキナーゼ）
室温で45分間インキュベートします。キアゲンのMinElute反応を用いて反応を浄化する
クリーンアップキットです。 30μlの溶出バッファー（EB）で溶出します。 - 3 '末端にオーバーハングを追加します。
ステップ3b.1から溶出したDNA産物30μlの
5μlの10×NEBバッファ＃2
10μlの1 mMのdATPを
2μlのdH 2 Oで
3μlの5 U /μlのKlenow断片（3 '→5'エキソ）
37℃で30分間インキュベート℃、 MinElute ReactionCleanupキットを使用して反応を浄化する。 10μlのEBに溶出します。 - Solexaリンカーライゲーション：
ステップ3b.2から溶出したDNA 10μlの
10μlのDDH 2 O
2.5＆μ、L倍のT4 DNAリガーゼ緩衝液
イルミナから1μlのアダプターオリゴミックス（在庫から1/10-diluted）
2.5μlのT4 DNAリガーゼ（400単位/μl）を
室温で1時間インキュベートする。 MinElute ReactionCleanupキットを使用して反応を浄化する。 20μlのEBに溶出します。サンプルは現在-20℃で保存することができます - E-ゲル装置を用いてステップ3b.3から溶出したDNAサンプルを実行します。ゲル中300から500 bpのバンドを分離し、キアゲンのゲル抽出キット（このステップは、アダプターオリゴライゲーションから〜125 bpのセルフライゲーションリンカーを排除する）を用いて精製する。 12μlのEBに溶出します。
- イルミナからペアエンド（PE）のプライマーを用いてライブラリーを増幅する。
ステップ3b.4から溶出したDNAの10.5μL
マスターミックスの12.5μL（2X备考HF、Finnzymes）
PE1のPCRプライマー11μlの
PE2のPCRプライマー21μlの
PCR条件：
98℃30秒
（98°C 10秒、65℃30秒、72℃30秒）、繰り返し20サイクル
5分間72℃。 - ステップ3b.5からのサンプルは、標準的な2％アガロースゲルを使用して、適切なサイズのDNA（300〜500 bp）を選択した後のChIP-seqを使用することができます。サンプルは現在-20℃で保存することができます汚染を防ぐために、単一のゲル上の各チップのサンプルを分離することをお勧めします。サンプルは、ハイスループットシーケンシングのために提出することができます。
3C。 Solexaのパイプライン分析
- 25-bpのシークエンスは、読み取りイルミナGenome Analyzerの（GA）パイプラインから得られた。
- すべての読み取りが参照配列を持つ2つのミスマッチまでできるように、エランド（塩基データの効率的なローカルアライメント）ソフトウェアを使用して、 ショウジョウバエのゲノム（DM3）に整列させた。
- 一意にマッピングされた読み取りが下流解析のために保持された。複数の同一の読み取りの場合、最大3つのコピーは、PCR増幅からバイアスの可能性を減らすために保持された。
- GAパイプラインの出力は、ブラウザの拡張可能なデータ（BED）ファイルに変換されました。
- 生成するには可視化のためにUCSCブラウザにアップロードするためのかつらファイルは、我々は、ウィンドウサイズとして4塩基対のDNA断片のサイズは160 bpで、以前の出版物3に記載されているPythonのかばんを使用していました。
- 静かで発現する遺伝子に、ショウジョウバエの遺伝子を分類するために、我々はRPKMと呼ばれるデジタル数（キロベースあたりの/は/百万円、マップされたリードあたりのエクソン領 域をマージ読み込み）を使用しました。 RPKMを持つ遺伝子= 0をRPKM≥1を使用してサイレント·グループと遺伝子として分類された、低中程度および高い発現レベルの遺伝子として3つのサブグループに分類することができる表されるグループに分類し、各グループには同じ数について持っている遺伝子。
- ヒストン修飾レベルおよび遺伝子発現を比較するために、我々は以前の出版物3に記載されているPythonスクリプトを使用していました。
4。代表的な結果
BAMを使用したChIP-qPCRに結果の例（大理石の袋）変異体精巣は、 図1〜4に示されています。 BAM精巣では、増殖性精原細胞から精母細胞5、6の差別化への移行に障害があります。我々は、この組織の種類に富む未分化な生殖細胞のソースとしてBAM精巣を使用しています。このような雄特異的転写因子87（mst87F）、ドン·ファン（DJ）、ファジィタマネギ（fzo）などの精子の分化に必要な分化遺伝子は、BAM精巣で表現されていません。これらの遺伝子は非常に抑圧的なH3K27me3ヒストン修飾7（ 図1A）に富むが、アクティブH3K4me3とヒストン修飾8（ 図1B）、我々は7 '一価"と呼ばれるクロマチンの署名を欠いているされています。 H3K27me3またはH3K4me3とのいずれかの濃縮は、恒常的に発現サイクリン（CycA）遺伝子4正規化によって決定されます。
BAM変異体の精巣（ 図2）図1に示すように、定量PCRの結果を検証しました。3テストされた分化遺伝子のmst87F、DJとfzoを有する抗体の同じセットを（すなわち、抑圧的なH3K27me3とアクティブH3K4me3）は使用したコンテンツ"> CHIP-seqの分析、それらのゲノム領域は非常にH3K27me3はなく、H3K4me3と（ 図2A-2C）で濃縮されています。これとは対照的に、恒常的に発現CycA遺伝子が重要なH3K4me3と、その転写開始部位（TSS）（ 図2D）の近くの小さなH3K27me3バインディングを持っています。さらに、示差的に発現する遺伝子の4つのクラスの転写開始近くH3K27me3とH3K4me3とのChIPのプロファイルは、各ヒストン修飾の機能と一致している。 図3Aに示すように、転写開始のH3K27me3下流の濃縮は、逆に遺伝子発現レベルと相関している。サイレント遺伝子は、一方で最高H3K27me3を持っている高発現遺伝子はH3K27me3バインディングはありません。これらのデータは、遺伝子発現におけるH3K27me3の抑圧的な役割と一致しています。対照的に、転写開始の周りH3K4me3との濃縮は、遺伝子発現に及ぼすH3K4me3との積極的な役割と一致し、遺伝子発現レベル（ 図3B）と逆相関を示した。
どちらの抑圧的なH3K27me3ヒストン修飾（A）または（B）BAM細胞に富む未分化変異体精巣のアクティブH3K4me3とヒストン修飾に対する抗体を用いたChIP-ED DNAの図1。qPCR解析。 （）BAM精巣では、分化遺伝子（Mst87F、DJ、fzo）が H3K27me3抑圧的なヒストン修飾飾られています。 （B）分化遺伝子はH3K4me3とアクティブなマークが枯渇している。標的遺伝子のチップDNA（ChIPのDNA /入力）のレベル（Mst87F、DJやfzo）が最初レフに正規化されました制御CycA遺伝子のチップDNAのエル。エラーバーは独立した生物学的複製するから標準偏差を示しています。
図2。 （A）Mst87Fの全ゲノム領域にわたるH3K27me3とH3K4me3と濃縮のUCSCゲノムブラウザスナップショット（B）DJと（C）fzoは 、（D）CycA遺伝子（D）のクロマチンの状態を反映しているではH3K27me3に富む領域を丸で囲んだ卑しいです。重複遺伝子CG7264、精巣（RPKM = 1）BAMで表されるが、非常に野生型精巣（RPKM = 130）8（7からのChIP-seqのデータ）で表されます。図1のChIPの結果の定量的PCR解析で使用されるプローブは、各プロットの下部にラベルが付けられています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図3。精巣 7 BAMでH3K27me3とH3K4me3とを用いたChIP-seqのプロファイル 。 4遺伝子群（7509遺伝子）は、RNA-seqの結果を8に基づいてそれらの遺伝子発現レベルに応じて分類された。遺伝子の代表的なクラスは、上流の3キロバイトからの転写開始部位の下流3キロバイト（転写開始）に配列を使用して、特定のヒストン修飾の濃縮のためにプロットされます。これは（）H3K27me3（K27）の濃縮のプロファイルを生成し、（B）H3K4me3と（K4）は、各グループでのChIP-seqの分析は。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
このプロトコルで説明したChIP解析の汎用性は、生物学的に関連したシステムではクロマチンの状態を勉強する機会を提供する別の組織で使用することができます。培養されたシステムからの細胞を用いたChIP実験は、細胞の大量を容易に得ることができるので、実行するために便利です。しかし、培養細胞は、必ずしも多細胞環境内のセルを反映するものではありません。生きた動物から切除した組織を使用して、この技術を開発することによって、我々は培養細胞ができない多くの問題に対処することができます。
このプロトコルの有用性にもかかわらず、いくつかの注意点があります。たとえば、解剖組織は、まだいくつかの異なる種類の細胞で不均質である。比較的均一な細胞は、成虫、根性のような他の組織、精巣、およびすべての制限された成体幹細胞は不均一であるが含まれて卵巣としてショウジョウバエの組織では得ることができる。この合併症は、部分的にすることができます強力なショウジョウバエ遺伝学を使用して対処。成体幹細胞は、上述の組織の小集団内に存在するとChIP解析のために十分な数で単離することが非常に困難であるが、例えば、幹細胞集団は遺伝的に変異した背景を使用して濃縮することができる。 BAM遺伝子は、 ショウジョウバエの生殖細胞系列5,6の幹細胞の分化に必要である。したがって、BAM変異体生殖腺では、豊富な未分化の生殖細胞のためのよい源である。 BAM変異体を用いてChIPを行うことによって、我々は未分化生殖細胞におけるエピ風景を得ることができます。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、シーケンシングの結果を提供することで彼らの助けのために博士Keji趙の研究室（NIH / NHLBI）に感謝したいと思います。また、読み込み、マップされたシーケンスを視覚化するためにゲノムブラウザを使用するためのUCSCゲノムプロジェクトに感謝します。
この作業は、起動時にXCに資金NICHD、ルシールParkard財団、ジョンズ·ホプキンス大学からの独立賞、R01HD065816にR00HD055052 NIH経路によってサポートされてい
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco, Sigma-Aldrich | 47083-U | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet International | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystems | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5’ exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corp. | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 | |
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
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