Summary
Recientemente alto rendimiento de la tecnología de secuenciación ha aumentado considerablemente la sensibilidad de la cromatina immunoprecipitation (CHIP) y el experimento se le solicite su aplicación con células purificadas o tejidos disecados. Aquí delinear un método para usar la técnica con el chip
Abstract
Epigenética sigue siendo un campo de rápido desarrollo que estudia cómo el estado de la cromatina contribuye a la expresión diferencial de genes en distintos tipos de células en diferentes etapas de desarrollo. La regulación epigenética contribuye a un amplio espectro de procesos biológicos, incluyendo la diferenciación celular durante el desarrollo embrionario y la homeostasis en la edad adulta. Una estrategia de crítica en los estudios epigenéticos es examinar cómo diferentes modificaciones de las histonas y los factores de la cromatina regula la expresión génica. Para abordar esta, inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) se utiliza ampliamente para obtener una instantánea de la asociación de factores particulares con el ADN en las células de interés.
Técnica chip comúnmente utiliza células cultivadas como material de partida, que puede obtenerse en abundancia y homogeneidad para generar datos reproducibles. Sin embargo, hay varias advertencias: En primer lugar, el medio para hacer crecer células en placas de Petri es diferente de la que in vivo, por lo tanto puedeno reflejan el estado de la cromatina endógena de las células en un organismo vivo. En segundo lugar, no todos los tipos de células pueden ser cultivadas ex vivo. Hay sólo un número limitado de líneas celulares, de los cuales la gente puede obtener suficiente material para chip de ensayo.
Aquí se describe un método para hacer experimentos chip usando tejidos de Drosophila. El material de partida se disecciona tejido de un animal vivo, con lo que puede reflejar con precisión el estado de la cromatina endógeno. La capacidad de adaptación de este método con muchos tipos diferentes de tejidos permitirá a los investigadores para hacer frente a una gran cantidad biológicamente más preguntas relevantes con respecto a la regulación epigenética en vivo 1 y 2. La combinación de este método con secuenciación de alto rendimiento (chip-ss) también permitirá a los investigadores para obtener un panorama epigenómico.
Protocol
(El procedimiento completo dura chip aproximadamente dos días. Preparación de las bibliotecas de chip para la secuenciación de alto rendimiento requiere unos 2-3 días).
1. Disecar y preparar el tejido para el Experimento chip (aproximadamente 1 millón de células)
- Disecar el tejido de interés (por ejemplo, 200 pares de Drosophila testículos) en PBS frío inhibidor de la proteasa + 1x (disolver una pastilla de cóctel de inhibidores de la proteasa en 1,5 ml de PBS 1x para obtener la solución stock de 7x) + PMSF (concentración final de 100 mg / mL). Lavar dos veces tejido y resuspender el tejido en 200 l de la misma solución de PBS con inhibidores.
- Para fijar la muestra, añadir 5,5 l de formaldehído al 37% (formaldehído caliente en 37 ° C baño de agua durante 1 minuto antes de usar). Se incuba a 37 ° C durante 15 minutos, vórtice cada 5 minutos entre ellos.
- Colocar la muestra en hielo durante el tejido para asentarse durante 2 minutos. Lavar 2 veces con 450 l de PBS (con inhibidores de la proteasa y PMSF). Ejemplo de ahora puede ser la tiendad a -20 ° C. Repetir varias disección para obtener suficiente material para CHIP.
2. Preparar sobrenadante con conjugación de la proteína-ADN para chip de ensayo
- Combina la muestra suficiente de paso en un tubo de 1,3 ml 1,75 eppendorf.
- Retire PBS de muestra de tejido. Añadir 200 l de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM de CaCl2, 0,2% de Triton X-100 o NP-40, 5 butirato mM, y 1x cóctel inhibidor de la proteinasa). Añadir una solución fresca de stock PMSF a tampón de lisis (PMSF concentración final de 0,5 mM). Homogeneizar con azul homogeneizador (Cat # Fisher 749.521 a 1590) hasta que los tejidos se disocian por completo sin ningún tipo de agregación, se incuban a temperatura ambiente (temperatura ambiente) durante 10 minutos.
- Sonicación: sonicador uso micropunta (Misonix HS-XL200) a la potencia 20. Soníquelos durante 10 segundos y el resto en hielo durante 50 seg. Repetir 4-5 veces (tiempo de sonicación óptima se debe determinar empíricamente, como ya sonicación producirá fragmentos más pequeños. Para chip utilizando anticuerpos contra Histonmodificaciones e, normalmente sonicar la cromatina a aproximadamente 200-300 pares de bases, porque el factor de transcripción o de un regulador de la cromatina (por ejemplo, las proteínas Polycomb), que normalmente sonicar cromatina 200-1000 pb. Sin embargo, el tamaño de los fragmentos óptima debe ser probada empíricamente. NOTA: Mantenga siempre el tubo en hielo incluso durante sonicando PARA PREVENIR LA MUESTRA DE CALENTANDO!
- Diluir la muestra mediante la adición de 1,8 ml tampón RIPA (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, EDTA 1 mM, SDS al 0,1%, 0,1% de Na-desoxicolato, 1% de Triton X-100, con inhibidores de proteasa y PMSF a la misma concentración como se describe anteriormente). Ahorra un 40 l como el control de entrada mediante la adición de 2 l de NaCl 5M y se incuba a 65 ° C durante la noche (O / N) para neutralizar la reticulación.
- Para conjugar anticuerpos a perlas, añadir 40 l Proteína A perlas a un tubo eppendorf de 1,5 ml, a continuación, añadir 600 l de PBS y roca a 4 ° C durante 2 minutos, se aplican a perlas de imán y eliminar el sobrenadante. Añadir 100 l de PBS y el anticuerpo de interés (la cantidad de anticuerpo debe ser determinado Empircamente). Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora o 4 ° C durante 4 horas.
- Eliminar sobrenadante de perlas de imán y añadir 1 ml de extracto de cromatina desde el paso de 2,4 a las perlas. Gire a 4 º CO / N.
- Aplique la muestra chip para eliminar el imán y el sobrenadante. Lavar las perlas con el tampón siguiente a 4 ° C durante 10 minutos cada uno:
2 veces con 1 ml de tampón RIPA [1.89 'RIPA buffer' + 315 ml de inhibidores de la proteasa l 7x + 20 l PMSF];
2x con 1 ml de tampón RIPA + 0,3 M de NaCl [1,89 ml tampón RIPA + 220 l NaCl 3 M];
2x con 1 ml de tampón de LiCl (0,25 M LiCl, 0,5% de NP40, 0,5% NaDOC);
1x con 1 ml de 1x TE + 0,2% de Triton X-100;
1x con 1 ml de 1x TE. - Para invertir reticulación, resuspender las perlas en 100 l de tampón TE + 3 l SDS al 10% + 5 l de proteinasa K (20 mg / ml). Se incuba a 65 ° CO / N.
- Aplicar perlas de imán y transferir sobrenadante a un tubo nuevo. El sobrenadante contiene la muestra de ADN. Lavar perlas con 100 l de TE + 0,5 MNaCl y combinar el sobrenadante dos.
- El fenol-cloroformo extraer la muestra de ADN. Añadir 200 l de fenol: Chlorofrom: IAA (25:24:1) y la mezcla de vórtice. Girar a 14k durante 5 minutos a temperatura ambiente. Por otra parte, el ADN puede ser extraído por medio de Qiagen kit de purificación de PCR.
- Se transfiere la capa sobrenadante / acuosa en un nuevo tubo, y añadir acrilamida lineal hasta una concentración final de 20 mcg / ml (Alternativamente 1 l de glucógeno en 20 mg / ml por cada ml de sobrenadante 1 también se puede utilizar. Glucógeno se utiliza para qPCR posterior o los análisis de PCR, mientras que la acrilamida lineal se utiliza para la secuenciación de los ensayos.) Añadir 20 l de 3M NaOAc y 500 l de EtOH 100%. Mezclar bien y se incuba a 80 ° C durante 10 minutos. Girar a la velocidad máxima durante 20 minutos a 4 ° C.
- Remover el sobrenadante y lavar con 300 l de EtOH 70%. Aire seco y volver a suspender la muestra en 50 l de buffer TE. Ejemplo de ahora se puede almacenar a -20 ° C. La muestra puede ser utilizado para PCR cuantitativa (qPCR) de ensayo (Figura 1).
3a. Analizar chip-ed ADN utilizando qPCR
- Diluir el ADN genómico a la concentración siguiente para hacer una curva estándar: sin diluir, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/5000.
- Para cada pareja de cebadores, creado qPCR en dos ejemplares en una placa de 96 pocillos con el ADN genómico de 3a.1 paso a paso, de control de entrada y de chips de ADN-ed:
10 l 2x SYBR mezcla de PCR (Fermentas, K0222);
1 l de 10 mM Cebador;
1 l 10 mM primer inversa;
x l chip-ed ADN (control de entrada, o ADN genómico);
y l libre de nucleasa H 2 O para ajustar el volumen de reacción a 20 l. - Girar hacia abajo la placa de 96 pocillos con mini placa de control de giro (Labnet).
- Realizar qPCR con ABI 7300 PCR en tiempo real del sistema (u otros sistemas de PCR en tiempo real) con la siguiente condición:
Etapa 1: 50 ° C durante 2 min, 1 ciclo;
Etapa 2: 95 ° C durante 10 min, 1 ciclo;
Etapa 3: 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 1 min, 40 cycles;
Etapa 4 (fase de disociación): 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 1 min, 95 ° C durante 15 s. - Compruebe la curva de disociación: un pico en la gráfica la disociación térmica sugiere una amplificación de la única reacción de PCR. Más de un pico indica no específica del producto con el par de cebadores, los datos qPCR no debe ser utilizado.
- Determinar la fase lineal de amplificación exponencial de reacción de PCR para cada conjunto de cebadores, mediante el cálculo de la fórmula que resuelve cantidad de ADN de acuerdo con el Ct (ciclo umbral) de valor, que se basa en la curva estándar utilizando la serie de ADN genómico diluido en 3a. 1.
- Si el valor de Ct de chip-ed del ADN y control de entrada están dentro del rango lineal del valor Ct, calcular el enriquecimiento de chip-ed del ADN frente a la entrada, de acuerdo con el factor de dilución de chip-ed del ADN y control de entrada en el punto 2.4.
3b. Amplificar chip-ed del ADN para la secuenciación de alto rendimiento.
- Fin reparación de chip-ed mezcla de ADN (UseEpicentro final del ADN Kit de reparación), creado en el hielo:
1-34 ADN genómico de la etapa l 2,12 (0,1 a 5 mg)
5 l Fin 10x tampón reparación
5 l 2,5 mM dNTP mezcla
5 l de ATP 10 mM
x l H 2 O para ajustar el volumen de reacción a 49 l
1 l de fin de reparación enzima mezcla (polimerasa de ADN de T4 polinucleótido quinasa de T4 +)
Incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente. Purificar la reacción utilizando Qiagen reacción MinElute
Limpieza de equipo. Eluir en 30 tampón de elución l (EB). - Añadir A voladizos de al extremo 3 ':
30 l de producto de ADN eluido de 3b.1 paso
5 Buffer l NEB 10x # 2
10 l 1 mM dATP
2 l DH 2 O
3 l 5 U / l fragmento Klenow (3 '→ 5' exo-)
Incubar durante 30 minutos a 37 ° C. Purificar la reacción utilizando MinElute kit ReactionCleanup. Eluir en 10 l EB. - Solexa enlazador ligadura:
10 l de ADN eluido de 3b.2 paso
10 l ddH2O
2.5 μ l 10x tampón T4 ADN ligasa
Un adaptador de l oligo mezcla de Illumina (1/10-diluted en stock)
2,5 l ligasa de ADN T4 (400 unidades / l)
Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Purificar la reacción utilizando MinElute kit ReactionCleanup. Eluir en 20 l EB. Ejemplo de ahora se puede almacenar a -20 ° C. - Ejecutar la muestra de ADN eluido de 3b.3 paso utilizando el aparato de E-gel. Aislar la banda 300-500 pb en el gel y se purifica utilizando el kit Qiagen Gel Extraction (este paso elimina los ~ 125 pb auto-ligó enlazadores de la ligadura de adaptador oligo). Eluir EB en 12 l.
- Amplificar la biblioteca usando dos a dos finales (PE) de Illumina cebadores:
10,5 l de ADN eluido de 3b.4 paso
12,5 l de mezcla maestra (2X Phusion HF, Finnzymes)
1 l de PE1 cebador de PCR 1
1 l de PE2 cebador de PCR 2
PCR condiciones:
98 ° C durante 30 segundos
(98 ° C 10 seg, 65 ° C 30 seg, 72 ° C 30 segundos), se repiten 20 ciclos
72 ° C durante 5 minutos. - Las muestras de 3B.5 paso puede ser utilizado para chip-ss después de seleccionar el ADN de tamaño adecuado (300-500 pb) usando el estándar de 2% en gel de agarosa. Ejemplo de ahora se puede almacenar a -20 ° C. Lo mejor es aislar cada muestra en un gel de chip único para evitar la contaminación. Se pueden enviar muestras para la secuenciación de alto rendimiento.
3c. Solexa análisis de canalización
- La secuenciación de 25-pb lee se obtuvieron del Analizador de Illumina Genoma (GA) tubería.
- Todas las lecturas fueron alineados para el genoma de Drosophila (dm3) con el eland (alineación local eficiente de los datos de nucleótidos), permitiendo un máximo de dos desajustes con la secuencia de referencia.
- Lecturas asignadas únicamente se conservaron para su análisis posterior. Para múltiples lecturas idénticas, hasta tres copias fueron retenidas para reducir la posibilidad de sesgos de amplificación por PCR.
- La salida de la tubería de GA se convierten en datos extensibles navegador (BED) archivos.
- Para generarlos archivos de la peluca para subir a la UCSC navegador para la visualización, se utilizó un scrip de python que se ha descrito en una publicación anterior 3 de 4 pb como el tamaño de la ventana y de 160 pb como el tamaño de los fragmentos de ADN.
- Para clasificar los genes de Drosophila en los genes silenciosos y expresado, hemos utilizado un número digital llamado RPKM (lee / por kilobase fusionó región exonic / por millón de lecturas asignadas). Los genes con RPKM = 0 se clasifica en el grupo en silencio y con los genes RPKM ≥ 1 se clasificaron en los grupos expresados, los cuales pueden ser clasificados en tres subgrupos, como los genes con bajos niveles de expresión, moderado y alto, y cada grupo tiene aproximadamente el mismo número de los genes.
- Para comparar el nivel de modificación de las histonas y la expresión génica, se utilizó un script en Python que se ha descrito en una publicación anterior 3.
4. Los resultados representativos
Ejemplos de resultados qPCR con chip-bam (bolsa de canicas) mutante testículos se muestran en la Figura 1 4. En bam testículos, se produce un fallo en la transición de espermatogonias proliferativa a la diferenciación de espermatocitos 5, 6. Usamos BAM testículos como una fuente de células germinales no diferenciadas, que están enriquecidos en este tipo de tejido. Diferenciación de los genes necesarios para la diferenciación de los espermatozoides, como factor de transcripción específico de 87 hombres (mst87F), Don Juan (dj), y la cebolla difusa (FZO) no se expresan en Bam testículos. Estos genes son altamente enriquecido con la represión H3K27me3 modificación de las histonas 7 (Figura 1A), pero carecen de la participación activa de modificación de las histonas H3K4me3 8 (fig. 1B), una firma de la cromatina que se llama 'monovalente' 7. Enriquecimiento de cualquiera de las H3K27me3 o H3K4me3 se determina por la normalización de una ciclina expresada constitutivamente un gen (Cyca) 4.
contenido "> chip-ss análisis utilizando el mismo conjunto de anticuerpos (es decir, represiva y activa H3K27me3 H3K4me3) con Bam testículos mutantes (Figura 2) validó los resultados qPCR muestra en la Figura 1. Para los tres genes probados diferenciación terminal mst87F, dj y FZO , sus regiones genómicas son altamente enriquecido con H3K27me3 pero no H3K4me3 (Figura 2A-2C). En cambio, el gen expresado constitutivamente Cyca tiene H3K4me3 importante, pero poco H3K27me3 vinculante cerca de su sitio de inicio de la transcripción (TSS) (Figura 2D).Por otra parte, los perfiles de chip de H3K27me3 y H3K4me3 cerca de las DST de cuatro clases de genes expresados diferencialmente son consistentes con la función de cada modificación de las histonas. Como se muestra en la Figura 3A, el enriquecimiento de H3K27me3 aguas abajo de la DST está inversamente correlacionada con el nivel de expresión génica. Los genes silenciosos tienen la mayor H3K27me3 mientras que elgenes altamente expresados no vinculante H3K27me3. Estos datos son consistentes con el papel represivo de H3K27me3 sobre la expresión génica. En contraste, el enriquecimiento de H3K4me3 alrededor de los DST mostró la correlación opuesta con el nivel de expresión génica (Figura 3B), consistente con el papel activo de H3K4me3 sobre la expresión génica.
Figura 1. QPCR análisis de chip-ed ADN utilizando anticuerpos contra cualquiera de la represivo H3K27me3 modificación de las histonas (A) o activa H3K4me3 modificación de las histonas (B) en los testículos mutantes enriquecida con células no diferenciadas BAM. (A) En Bam testículos, los genes de diferenciación (Mst87F, dj, FZO) se enriquecen con la modificación de las histonas H3K27me3 represivo. (B) los genes de diferenciación se agotan con H3K4me3 marca activa. El nivel de chips de ADN (DNA chip / entrada) en el gen diana (Mst87F, dj o FZO) se normalizó primero en el lev El chip de ADN en el gen de control de Cyca. Las barras de error indican la desviación estándar de tres réplicas biológicas independientes.
Figura 2. UCSC genoma navegador instantáneas de H3K27me3 H3K4me3 y enriquecimiento a través de las regiones genómicas completas de (A) Mst87F (B) y dj (C) FZO, (d) los genes Cyca. El círculo H3K27me3 enriquecido región (D) refleja el estado de la cromatina un gen CG7264 superposición, que es humilde se expresa en los testículos bam (RPKM = 1), pero altamente expresado en los testículos de tipo salvaje (RPKM = 130) 8 (chip-ss datos de 7). Las sondas utilizadas en el análisis de PCR cuantitativa de los resultados de chip en la Figura 1 se marcan en la parte inferior de cada parcela. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
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Figura 3. Chip-y siguientes perfiles utilizando H3K27me3 y H3K4me3 en Bam testículos 7. Los cuatro grupos de genes (7.509 genes) fueron clasificados de acuerdo a sus niveles de expresión génica basado en RNA-Seq 8 resultados. Las clases representativas de los genes se trazan para el enriquecimiento de una modificación de las histonas en particular, el uso de secuencias de 3 KB de aguas arriba a aguas abajo 3kb de sus sitios de inicio de transcripción (DST). Esto genera un perfil de enriquecimiento de (A) H3K27me3 (K27) y (B) H3K4me3 (K4) y siguientes chip-análisis en cada grupo. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
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Discussion
La versatilidad de los análisis de chip discutidos en este protocolo se puede utilizar en diferentes tejidos, lo que proporciona una oportunidad para estudiar el estado de la cromatina en un sistema biológicamente relevantes. Experimentos chip usando células cultivadas procedentes de sistemas son convenientes para llevar a cabo porque gran cantidad de células se pueden obtener fácilmente. Sin embargo, las células cultivadas no reflejan necesariamente las células en un entorno multi-celular. Mediante el desarrollo de esta técnica, utilizando tejidos disecados de animales vivos, podemos hacer frente a muchas preguntas que las células cultivadas no pueden hacerlo.
A pesar de la utilidad de este protocolo, hay varias advertencias. Por ejemplo, el tejido disecado sigue siendo heterogénea con varios tipos de células diferentes. Mientras que las células relativamente homogéneas puede obtenerse en los tejidos de Drosophila, tales como discos imaginales, otros tejidos como tripas, testículos y ovarios todos los cuales contienen limitados células madre adultas son heterogéneas. Esta complicación puede ser parcialmenteabordarse mediante la genética de Drosophila poderosa. Por ejemplo, aunque las células madre adultas existen en una pequeña población en los tejidos discutidos anteriormente y son extremadamente difíciles de ser aislados en un número suficiente para el análisis de chip, la población de células madre puede ser enriquecida utilizando fondo genéticamente mutado. El gen bam es necesaria para la diferenciación de células madre de línea germinal en Drosophila linaje de 5,6. Por lo tanto bam gónadas mutantes son una buena fuente de células germinales indiferenciadas enriquecidos. Mediante la realización de chip con bam mutante, podemos obtener un paisaje epigenómico en las células germinales diferenciadas.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer el laboratorio del Dr. Zhao Keji (NIH / NHLBI) por su ayuda en la provisión de resultados de la secuenciación. También nos gustaría dar las gracias al proyecto del genoma UCSC para el uso de Genoma del navegador para visualizar la secuencia asignada lee.
Este trabajo ha sido financiado por el Camino R00HD055052 NIH para el Premio de la Independencia y R01HD065816 de NICHD, la Fundación Lucile Parkard, y la Universidad Johns Hopkins, la puesta en marcha fondos para XC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco, Sigma-Aldrich | 47083-U | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet International | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystems | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5’ exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corp. | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 | |
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
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