Summary
في الآونة الأخيرة زادت الإنتاجية العالية التكنولوجيا التسلسل كثيرا حساسية مناعي الكروماتين (رقاقة)، ودفعت تجربة تطبيقه باستخدام خلايا النقي أو أنسجة تشريح. نحن هنا تحدد طريقة لاستخدام تقنية رقاقة مع
Abstract
علم التخلق يبقى مجال ينمو بسرعة، كيف يمكن للدراسات حالة لونين يساهم في التعبير الجيني الفرق في أنواع الخلايا المتميزة في مراحل تنموية مختلفة. تنظيم جينية تسهم في طائفة واسعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك تمايز الخلايا أثناء التطور الجنيني والتوازن في الجسم في مرحلة البلوغ. استراتيجية بالغة الأهمية في دراسات جينية هو لبحث كيفية إدخال تعديلات بسيطة وعوامل شتى لونين تنظيم التعبير الجيني. للتصدي لهذا، يتم استخدام الكروماتين مناعي (رقاقة) على نطاق واسع للحصول على لقطة من الجمعيات من العوامل خاصة مع الحمض النووي في خلايا الفائدة.
تقنية رقاقة يستخدم عادة الخلايا المستزرعة كما بدءا المادية، التي يمكن الحصول عليها في وفرة وتجانس لتوليد البيانات استنساخه. ومع ذلك، هناك محاذير عدة: قد أولا، والبيئة لزراعة خلايا في طبق بيتري وهو يختلف عن ذلك في الجسم الحي، وبالتاليلا تعكس الحالة الذاتية لونين من الخلايا في كائن حي. ثانيا، لا يمكن لجميع أنواع خلايا الجسم الحي يكون السابقين مثقف. لا يوجد سوى عدد محدود من خطوط الخلايا، من الذي يمكن للناس الحصول على ما يكفي من المواد لفحص رقاقة.
نحن هنا وصفا لطريقة للقيام تجربة الرقاقة باستخدام الأنسجة ذبابة الفاكهة. يتم تشريح المواد بدءا من أنسجة حيوان، وبالتالي يمكن أن تعبر بدقة عن حالة لونين الذاتية. والقدرة على التكيف على هذه الطريقة مع العديد من أنواع مختلفة من الأنسجة تسمح للباحثين لمعالجة الكثير من المسائل ذات الصلة فيما يتعلق بيولوجيا تنظيم جينية في الجسم الحي 1 و 2. والجمع بين هذه الطريقة مع الإنتاجية العالية التسلسل (رقاقة وما يليها) تسمح مزيد من الباحثين للحصول على المشهد epigenomic.
Protocol
(الإجراء CHIP كامل يستغرق نحو يومين. التحضير للمكتبات رقاقة لعالية الإنتاجية تسلسل يأخذ آخر أيام 2-3.)
1. تشريح الأنسجة وإعداد لتجربة رقاقة (~ 1 مليون خلية)
- تشريح الأنسجة من مصلحة (على سبيل المثال 200 زوجا من الخصيتين ذبابة الفاكهة) في البرد المانع + PBS البروتيني 1X (1 بيليه من حل كوكتيل المانع البروتيني في 1.5 مل PBS 1X للحصول على حل 7X الأوراق المالية) + PMSF (نهائي تركيز 100 ميكروغرام / مل). شطف الأنسجة مرتين وresuspend الأنسجة في 200 ميليلتر من الحل في برنامج تلفزيوني واحد مع مثبطات.
- لإصلاح العينة، إضافة 5،5 ميكروليتر الفورمالديهايد بنسبة 37٪ (الفورمالديهايد دافئ في 37 درجة مئوية لمدة حمام ماء 1 دقيقة قبل استخدام). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، دوامة كل 5 دقائق بينهما.
- وضع عينة على الجليد للأنسجة لتسوية لمدة 2 دقيقة. شطف 2X مع 450 PBS ميكرولتر (مع مثبطات الأنزيم البروتيني وPMSF). يمكن أن تكون العينة الآن مخزند عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. كرر مرات عدة تشريح للحصول على ما يكفي من المواد لرقاقة.
2. إعداد الطافي (Supernatant) مع بروتين الدنا الإقتران لفحص CHIP
- الجمع بين عينة كافية من الخطوة 1.3 في أنبوب 1.75 إيبندورف مل.
- إزالة برنامج تلفزيوني من عينة الانسجة. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة تحلل (50 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.6، 1 ملم CaCl2، 0.2٪ تريتون X-100 أو NP 40، 5 الزبدات ملم، و1X كوكتيل المانع بروتين). إضافة جديدة إلى حل الأسهم PMSF العازلة تحلل (PMSF تركيز النهائي من 0.5 ملم). التجانس مع الخالط الأزرق (فيشر القط # 749521-1590) حتى فصل الأنسجة تماما من دون أي تجميع، في احتضان RT (درجة حرارة الغرفة) لمدة 10 دقائق.
- صوتنة: استخدام sonicator microtip (Misonix HS-XL200) في القوة 20. يصوتن لمدة 10 ثانية والباقي على الجليد لمدة 50 ثانية. كرر مرات 4-5 (ينبغي تحديد الوقت الأمثل صوتنة تجريبيا، كما يعد صوتنة سيؤدي إلى أجزاء أصغر. للحصول على الرقاقة باستخدام أجسام مضادة ضد هيستونه التعديلات، ونحن عادة يصوتن لونين إلى ما يقرب من 200-300 بي بي، لعامل النسخ أو منظم لونين (مثل البروتينات Polycomb)، ونحن عادة يصوتن لونين إلى 200-1000 شركة بريتيش بتروليوم. ومع ذلك، يجب اختبار حجم شظية الأمثل تجريبيا. ملاحظة: دائما نأخذ الأنبوب على الجليد وحتى خلال SONICATING لمنع عينة من تسخين!
- تمييع عينة عن طريق إضافة 1.8 مل RIPA العازلة (10 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.6، 1 ملم EDTA، 0.1٪ SDS، 0.1٪ نا Deoxycholate، تريتون 1٪ X-100، مع مثبطات الأنزيم البروتيني وPMSF في نفس التركيز كما هو موضح ) سابقا. وفر 40 ميكرولتر ومراقبة المدخلات وذلك بإضافة 2 ميكروليتر كلوريد الصوديوم 5M واحتضانها في 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها (O / N) لعكس تشعبي.
- لتصريف الأجسام المضادة إلى الخرز، واضافة 40 ميكرولتر البروتين والخرز لأنبوب 1،5 مل إيبندورف، ثم إضافة 600 PBS ميكرولتر والصخور في 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، وتطبيق الخرز لجذب وإزالة طاف. أضف 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني، والضد من مصلحة (وينبغي أن تحدد كمية من الأجسام المضادة امبراطوريه) جسديا. في احتضان RT لمدة 1 ساعة أو 4 درجات مئوية لمدة 4 ساعات.
- إزالة طاف من الخرز بواسطة مغناطيس وإضافة 1mL استخراج لونين من الخطوة 2.4 إلى الخرز. تناوب على 4 درجات ثاني / ن.
- تطبيق نموذج رقاقة لجذب وإزالة طاف. تغسل حبات مع المخزن المؤقت التالي في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق كل منها:
2X مع 1 مل من عازلة RIPA [1.89 مل 'RIPA العازلة' + 315 ميكرولتر مثبطات الأنزيم البروتيني 7X + 20 PMSF ميكرولتر]؛
2X مع 1 مل من عازلة RIPA + 0.3 متر كلوريد الصوديوم [1.89 مل RIPA عازلة + 220 ميكرولتر 3 M كلوريد الصوديوم]؛
2X مع 1 مل من عازلة LiCl (0.25 م LiCl، و 0.5٪ NP40، NaDOC 0.5٪)؛
1X مع 1 مل من TE 1X + 0.2٪ تريتون X-100؛
1X مع 1 مل من TE 1X. - على عكس تشعبي، resuspend الخرز في 100 العازلة ميكروليتر TE + 3 ميكرولتر 10٪ SDS + 5 ميكرولتر من K بروتين (20 ملغ / مل). في احتضان 65 درجة ثاني أكسيد الكربون / ن.
- تطبق الخرز لجذب ونقل طاف في أنبوب جديد. وطاف يحتوي عينتك الحمض النووي. تغسل حبات مع 100 ميكرولتر TE M 0.5 + كلوريد الصوديوم، والجمع بين طاف اثنين.
- الفينول، كلوروفورم استخراج عينة من الحمض النووي. إضافة 200 الفينول ميكرولتر: Chlorofrom: IAA (25:24:1) ومزيج دوامة. تدور في 14K لمدة 5 دقائق على RT. بدلا من ذلك، يمكن استخلاص الحمض النووي باستخدام QIAGEN عدة تنقية PCR.
- ويمكن أيضا نقل طبقة طاف / مائي في أنبوب جديد، وإضافة مادة الأكريلاميد خطي إلى تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل (بدلا من 1 ميكرولتر من الجليكوجين في 20 ملغ / مل لكل 1 مل من طاف يمكن استخدامها. يستخدم الجليكوجين لل qPCR لاحقة أو تحليل PCR في حين تستخدم مادة الأكريلاميد خطي لتسلسل المقايسات.) أضف 20 ميكرولتر من NaOAc 3M و 500 ميكرولتر EtOH 100٪. تخلط جيدا واحتضان في 80 لمدة 10 دقائق درجة مئوية. تدور في أقصى سرعة لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إزالة طاف وتغسل مع EtOH ميكرولتر 300 بنسبة 70٪. عينة الهواء الجاف وresuspend في 50 العازلة TE ميكرولتر. ويمكن الآن نموذج يمكن تخزينها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. ويمكن استخدام نموذج لفحص الكمية (qPCR) PCR (الشكل 1).
= "jove_title"> 3. تحليل الحمض النووي رقاقة إد
3A. تحليل الحمض النووي رقاقة إد باستخدام qPCR
- تخفيف الحمض النووي الجيني في تركيز التالية لجعل منحنى القياسية: غير مخفف، 1/10، 1/100، 1/1000، 1/5000.
- لكل زوج التمهيدي، التي أنشئت في qPCR مكررة في لوحة 96-جيدا مع الحمض النووي الجيني من 3a.1 الخطوة، ومراقبة المدخلات والحمض النووي رقاقة إد:
10 ميكرولتر 2X SYBR PCR مزيج (Fermentas، K0222)؛
1 ميكرولتر 10 ميكرومتر إلى الأمام التمهيدي؛
1 ميكرولتر عكس ميكرومتر 10 التمهيدي؛
س ميكرولتر رقاقة إد الحمض النووي (مراقبة المدخلات، أو الحمض النووي الجيني)؛
ذ ميكرولتر nuclease خالية من H 2 O لضبط حجم رد الفعل إلى 20 ميكروليتر. - تدور أسفل لوحة 96-البسيطة بشكل جيد مع لوحة الدوار (LABNET).
- أداء qPCR مع 7300 ABI PCR الوقت الحقيقي النظام (أو غيرها من أنظمة الوقت الحقيقي PCR) باستخدام الشرط التالي:
المرحلة 1: 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 1 دورة؛
المرحلة 2: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 1 دورة؛
المرحلة 3: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 40 جycles؛
مرحلة 4 (مرحلة التفكك): 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، و 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية. - تحقق من منحنى تفارق: واحد الذروة في مؤامرة الانفصال الحرارية يشير إلى وجود amplicon واحد من رد فعل PCR. أكثر من واحد يشير إلى ذروة غير محددة المنتج مع الزوج التمهيدي، لا ينبغي أن تستخدم البيانات qPCR.
- تحديد مرحلة خطية من التضخيم الهائل من رد فعل PCR لكل مجموعة التمهيدي، عن طريق حساب الصيغة التي تقرر كمية الحمض النووي وفقا لقيمة (عتبة دورة) ط م، والذي يقوم على أساس منحنى قياسي باستخدام سلسلة من الحمض النووي الجيني الواحد في 3A. 1.
- إذا كانت قيمة قيراط من الرقائق إد الحمض النووي ومراقبة المدخلات تقع ضمن نطاق خطي من قيمة ط م، وحساب في إثراء رقاقة إد الحمض النووي مقابل المدخلات، وفقا لعامل تمييع من رقاقة الحمض النووي ومراقبة إد مساهمة في 2.4.
3B. تضخيم رقاقة إد الحمض النووي لتسلسل إنتاجية عالية.
- نهاية إصلاح الحمض النووي من خليط الرقائق إد (استخدمEpicentre الحمض النووي نهاية إصلاح عدة)، التي أنشئت على الجليد:
1-34 الحمض النووي الجيني ميكرولتر من الخطوة 2.12 (0.1 إلى 5 ميكروغرام)
5 ميكرولتر إصلاح النهاية 10X العازلة
5 ميكرولتر 2.5 ملي مزيج dNTP
5 ميكرولتر 10 ملي للاعبي التنس المحترفين
س ميكرولتر H 2 O لضبط حجم الصوت رد فعل إلى 49 ميكروليتر
1 ميكروليتر مزيج الإنزيم نهاية تصليح (T4 بوليميريز الحمض النووي + T4 كيناز عديد النوكليوتيد)
احتضان لمدة 45 دقيقة في RT. تنقية رد فعل باستخدام QIAGEN MinElute رد الفعل
تنظيف عدة. أزل في 30 الواق شطف ميكروليتر (EB). - إضافة يتدلى إلى نهاية 3 ':
30 ميكرولتر من المنتج الحمض النووي مزال من 3b.1 خطوة
5 ميكرولتر الواق NEB 10X # 2
10 ميكروليتر 1 ملم dATP
2 ميكرولتر درهم 2 O
3 ميكروليتر 5 جزء Klenow U / ميكروليتر (3 '→ 5' EXO-)
احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تنقية رد فعل باستخدام MinElute ReactionCleanup عدة. أزل في 10 EB ميكرولتر. - Solexa ربط رابط:
10 ميكرولتر من الحمض النووي مزال من 3b.2 خطوة
10 ميكرولتر DDH 2 O
2.5 &مو؛ ل 10X يغاز الحمض النووي T4 العازلة
1 ميكروليتر مزيج بنسبة ضئيلة من محول البورشيد (1/10-diluted من الأسهم)
2،5 ميكرولتر يغاز الحمض النووي T4 (400 وحدة / ميكرولتر)
احتضان لمدة 1 ساعة على RT. تنقية رد فعل باستخدام MinElute ReactionCleanup عدة. أزل في 20 EB ميكرولتر. ويمكن الآن نموذج يمكن تخزينها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. - تشغيل عينة من الحمض النووي مزال من 3b.3 الخطوة باستخدام جهاز E-هلام. عزل الفرقة بي بي 300-500 في هلام وتنقية باستخدام استخراج جل QIAGEN عدة (هذه الخطوة يلغي ~ 125 شركة بريتيش بتروليوم الذاتي ligated linkers من محول ربط بنسبة ضئيلة). أزل في 12 EB ميكرولتر.
- تضخيم المكتبة باستخدام الاقتران في نهاية (PE) الاشعال من البورشيد:
10.5 ميكرولتر من الحمض النووي مزال من 3b.4 خطوة
12.5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي (2X Phusion HF، Finnzymes)
1 ميكرولتر من التمهيدي PCR PE1 1
1 ميكرولتر من التمهيدي PCR PE2 2
PCR حالة:
98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
(98 درجة مئوية 10 ثانية و 65 درجة مئوية و 30 ثانية و 72 درجة مئوية و 30 ثانية)، وتكرار دورات 20
72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. - ويمكن استخدام عينات من 3b.5 الخطوة وما يليها رقاقة بعد تحديد الحمض النووي مناسبة الحجم (300-500 بي بي) باستخدام معيار 2٪ الاغاروز هلام. ويمكن الآن نموذج يمكن تخزينها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. فمن الأفضل لعزل كل عينة رقاقة على مادة هلامية واحد لمنع التلوث. ويمكن تقديم عينات للالإنتاجية العالية التسلسل.
3C. Solexa خط أنابيب تحليل
- وقد تم الحصول على التسلسل 25-BP يقرأ من الجينوم محلل البورشيد (GA) خط أنابيب.
- وقد أيدت كل قراءة للجينوم ذبابة الفاكهة (DM3) باستخدام إيلاند (محاذاة محلي البيانات بشكل أكثر كفاءة النكليوتيد) والبرمجيات، مما يسمح ما يصل الى اثنين عدم التطابق مع تسلسل المرجعية.
- تم الإبقاء على قراءة تعيين فريد لتحليل اتجاه مجرى النهر. لقراءة متطابقة عدة، تم الإبقاء على ما يصل الى ثلاث نسخ إلى الحد من إمكانية التحيز من التضخيم PCR.
- تم تحويل الانتاج من خط GA إلى البيانات الموسعة متصفح (BED) الملفات.
- لتوليدالملفات شعر مستعار لتحميل لمتصفح UCSC عن التصور، واستخدمنا السهم بيثون التي وصفت في منشور السابق 3 مع 4 BP ويبلغ حجم نافذة و 160 شركة بريتيش بتروليوم كما الحمض النووي حجم شظية.
- لتصنيف جينات ذبابة الفاكهة في الجينات الصامتة، وأعرب عن استخدمنا عددا الرقمية دعا RPKM (يقرأ / لكل kilobase اندمجت المنطقة exonic / لكل مليون يقرأ معين). صنفت الجينات مع RPKM = 0 مثل مجموعة صامت والجينات مع RPKM صنفت ≥ 1 في المجموعات التي أعرب عنها، والتي يمكن تصنيفها في ثلاث مجموعات فرعية مثل الجينات مع مستويات التعبير منخفضة ومتوسطة وعالية، وكانت كل مجموعة لديها نفس العدد تقريبا من الجينات.
- للمقارنة بين مستوى تعديل هيستون والتعبير الجيني، استخدمنا سيناريو بيثون التي وصفت في السابق (3) منشورات.
4. ممثل النتائج
أمثلة على رقاقة qPCR النتائج باستخدام بام (كيس من الرخام) متحولة وتظهر الخصيتين في الشكل 1 4. في بام الخصيتين، وهناك فشل في الانتقال من أمهات المني التكاثري إلى تمييز الخلايا المنوية 5 و 6. نحن نستخدم بام الخصيتين كمصدر للخلايا غير متمايزة الجرثومية، والتي أثرت في هذا النوع من الأنسجة. لا يتم عبر الجينات اللازمة لتمايز التمايز الحيوانات المنوية، مثل عامل النسخ ذكر محددة 87 (mst87F)، دون جوان (دي جي)، والبصل غامض (fzo) في بام الخصيتين. والتخصيب هذه الجينات مع تعديل H3K27me3 القمعية هيستون 7 (الشكل 1A)، ولكن خالية من التعديل H3K4me3 نشط هيستون 8 (الشكل 1B)، وتوقيع لونين أسميناه "التكافؤ" (7). يتم تحديد تخصيب إما H3K27me3 أو H3K4me3 بواسطة التطبيع إلى Cyclin أعرب constitutively الجين (وفاء) 4.
محتوى "> الرقائق وما يليها تحليل باستخدام نفس مجموعة من الأجسام المضادة (أي H3K27me3 القمعية وH3K4me3 النشطة) مع بام الخصيتين متحولة (الشكل 2) التحقق من صحة النتائج qPCR هو مبين في الشكل رقم 1. للثلاثة مجربة الجينات التمايز محطة mst87F، دي جي وfzo ، والتخصيب الجيني مناطقها مع H3K27me3 ولكن ليس H3K4me3 (الشكل 2A-2C). وفي المقابل، فإن الجينات وفاء وأعرب constitutively ديه H3K4me3 كبيرة ولكن القليل H3K27me3 ملزم لها قرب موقع بداية النسخ (TSS) (الشكل 2D).وعلاوة على ذلك، لمحات من ذاك الأسد H3K27me3 وH3K4me3 قرب TSSs من أربع فئات من الجينات وأعرب تفاضلي تتفق مع وظيفة كل تعديل هيستون. كما هو مبين في الشكل 3A، يرتبط ارتباطا عكسيا تخصيب H3K27me3 المصب من TSSs مع مستوى التعبير الجيني. الجينات الصامتة لديها أعلى H3K27me3 في حين أنالجينات وأعرب جدا ليس لديهم ملزم H3K27me3. هذه البيانات متوافقة مع دور قمعي من H3K27me3 على التعبير الجيني. في المقابل، أظهرت تخصيب H3K4me3 حول TSSs العلاقة المعاكس مع مستوى التعبير الجيني (الشكل 3B)، بما يتفق مع الدور النشط للH3K4me3 على التعبير الجيني.
تحليل شخصية qPCR 1. من الرقائق إد الحمض النووي باستخدام الأجسام المضادة ضد إما تعديل H3K27me3 القمعية هيستون (A) أو نشط H3K4me3 تعديل هيستون (B) في الخصيتين متحولة غير متمايزة خلية التخصيب بام. (A) في مدينة بام وأثرى الخصيتين، الجينات التمايز (Mst87F، دي جي، fzo) مع تعديل H3K27me3 هيستون القمعية. (ب) ونضبت الجينات التمايز مع H3K4me3 علامة نشط. وكان طبيعيا لأول مرة على مستوى الحمض النووي رقاقة (DNA CHIP / الإدخال) في الجين الهدف (Mst87F، دي جي أو fzo) لليف ش من الحمض النووي في الجين الشذرة وفاء السيطرة. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري من ثلاثة البيولوجية مستقل مكررات.
الشكل 2. لقطات UCSC المتصفح جينوم H3K27me3 وH3K4me3 التخصيب عبر مناطق الجينوم كامل من (أ) Mst87F (B) DJ و (C) fzo، (D) الجينات وفاء. وحلقت H3K27me3 التخصيب في المنطقة (D)، ويعكس حالة من لونين الجينات المتداخلة CG7264، والذي أعرب عن المتواضع في بام الخصيتين (RPKM = 1) لكنه أعرب عن درجة عالية في البرية من نوع الخصيتين (RPKM = 130) 8 (رقاقة وما يليها من بيانات 7). وصفت تحقيقات المستخدمة في تحليل PCR الكمي لنتائج الشذرة في الشكل رقم 1 في الجزء السفلي من كل مؤامرة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
tp_upload/3745/3745fig3.jpg "/>
الشكل 3. رقاقة وما يليها محات باستخدام H3K27me3 وH3K4me3 في بام الخصيتين 7. تم تصنيف المجموعات الجينات الأربعة (7509 الجينات) وفقا لمستوياتها التعبير الجيني على أساس تسلسل الحمض النووي الريبي-8 نتيجة. يتم رسم الطبقات ممثل من الجينات لتخصيب اليورانيوم من التعديل هيستون خاص، وذلك باستخدام متواليات من المنبع إلى المصب 3KB 3KB من مواقعهم بدء النسخ (TSSs). هذا يولد لمحة عن تخصيب (A) H3K27me3 (K27) و (ب) H3K4me3 (K4) رقاقة وما يليها التحليلات في كل مجموعة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن استخدام براعة من التحليلات CHIP التي نوقشت في هذا البروتوكول على أنسجة مختلفة، الأمر الذي يوفر فرصة لدراسة حالة لونين في النظام ذات الصلة من الناحية البيولوجية. التجارب الرقاقة باستخدام خلايا من نظم مثقف ومريحة لأداء إذ لا يمكن أن كمية كبيرة من الخلايا التي تم الحصول عليها بسهولة. ومع ذلك، الخلايا المستزرعة لا تعكس بالضرورة الخلايا في بيئة متعددة الخلايا. من خلال تطوير هذه التقنية باستخدام نسيج من تشريح الحيوانات الحية، لا يمكننا معالجة العديد من الأسئلة التي لا يمكن أن الخلايا المزروعة.
على الرغم من فائدة من هذا البروتوكول، وهناك العديد من المحاذير. على سبيل المثال، والأنسجة تشريح لا تزال غير متجانسة مع عدة أنواع مختلفة من الخلايا. بينما يمكن الحصول على الخلايا متجانسة نسبيا في الأنسجة ذبابة الفاكهة مثل أقراص تخيلي، الأنسجة الأخرى مثل الشجاعة، الخصيتين، والمبيضين والتي تحتوي على جميع محدود الخلايا الجذعية للبالغين غير متجانسة. وهذا يمكن أن يكون جزئيا تعقيدتعالج باستخدام قوية ذبابة الفاكهة علم الوراثة. على سبيل المثال، على الرغم من أن الخلايا الجذعية البالغة موجودة في عدد صغير من السكان في الأنسجة التي نوقشت أعلاه، ويصعب جدا أن تكون معزولة في عدد كاف لتحليل الشذرة، يمكن المخصب الجذعية السكان الخلية باستخدام خلفية تحور وراثيا. الجين بام هو ضروري لتمايز الخلايا الجذعية في ذبابة الفاكهة سلالة الجرثومية نسب 5،6. ولذلك بام الغدد التناسلية متحولة هي مصدر جيد لخلايا غير متمايزة المخصب الجرثومية. عن طريق أداء الرقاقة باستخدام بام متحولة، يمكننا الحصول على المناظر الطبيعية epigenomic في الخلايا الجرثومية غير متمايزة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر مختبر الدكتور كيجي زهاو (المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI) لمساعدتهم في تقديم نتائج التسلسل. ونود أيضا أن نشكر مشروع الجينوم UCSC لاستخدام متصفح الجينوم لتصور التسلسل تعيين يقرأ.
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة المسار R00HD055052 على جائزة الاستقلال وR01HD065816 من معاهد الصحة القومية، وParkard مؤسسة وسيل، وجامعة جونز هوبكنز لبدء التمويل لXC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco, Sigma-Aldrich | 47083-U | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet International | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystems | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5’ exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corp. | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 | |
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
- Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
- McKearin, D. M., Spradling, A. C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
- Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, 42-42 (2010).
- Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-783 (2010).
