Summary
Недавно высокой пропускной последовательности технологий значительно увеличило чувствительность Хроматин иммунопреципитации (чип) эксперимент и побудило его применения с использованием очищенных клеток или расчлененные ткани. Здесь мы очертить метод использовать ChIP технику
Abstract
Эпигенетика остается быстро развивающейся области исследований, которые, как состояние хроматина способствует дифференциальной экспрессии генов в различных типах клеток на разных стадиях развития. Эпигенетической регуляции способствует широкий спектр биологических процессов, в том числе дифференцировки клеток в процессе эмбрионального развития и гомеостаза в зрелом возрасте. Важнейшую стратегию в эпигенетические исследования является изучение того, как различные модификации гистонов хроматина и факторы регулируют экспрессию генов. Для решения этой проблемы Хроматин иммунопреципитации (чип) широко используется для получения снимков связаны с разными факторами ДНК в клетках интерес.
ChIP техника обычно используется культуре клеток в качестве исходного материала, который можно получить в изобилии и однородности для получения воспроизводимых данных. Однако, есть несколько предостережений: во-первых, условия для роста клеток в чашке Петри отличается от того, в естественных условиях, таким образом, можетне отражают эндогенный состояние хроматина клеток в живом организме. Во-вторых, не все типы клеток может быть культурным бывших естественных условиях. Есть лишь ограниченное число клеточных линий, от которых люди могут получить достаточно материала для чипов анализа.
Здесь мы опишем способ сделать ChIP эксперимент с использованием дрозофилы тканей. В качестве исходного материала рассечена тканей у живого животного, таким образом, можно точно отражают эндогенный состояние хроматина. Адаптации этого метода с различными типами тканей позволит исследователям для решения гораздо более биологически значимых вопросов, касающихся эпигенетической регуляции естественных условиях в 1, 2. Сочетание этого метода с высокой пропускной последовательности (Chip-далее) в дальнейшем позволит исследователям получить эпигеномном ландшафта.
Protocol
(Вся процедура ChIP занимает около двух дней. Подготовка ChIP библиотеки для высокой пропускной последовательности занимает еще 2-3 дней).
1. Проанализируйте и подготовка ткани для чипа эксперимента (~ 1 млн. клеток)
- Проанализируйте ткани интерес (например, 200 пар Drosophila яичек) в холодном PBS + 1x ингибитор протеазы (растворить 1 шарик коктейль ингибитор протеазы в 1,5 мл 1x PBS получить 7x маточного раствора) + PMSF (конечная концентрация 100 мкг / мл). Промойте ткань в два раза и ресуспендируют ткани в 200 мкл того же раствора PBS с ингибиторами.
- Чтобы исправить пример, добавить 5,5 мкл 37% формальдегида (теплый формальдегида в 37 ° С водяной бане в течение 1 мин перед использованием). Инкубировать при температуре 37 ° С в течение 15 минут, вихрь каждые 5 минут между ними.
- Поместите образец на льду ткани решить в течение 2 минут. Промойте 2 раза с 450 мкл PBS (с ингибиторами протеазы и PMSF). Пример теперь может быть магазинг при температуре -20 ° C. Повторите несколько раз рассечение получить достаточно материала для чипов.
2. Подготовить Супернатант с белком ДНК сопряжения для чипов Пробирной
- Комбинат достаточно образцов, начиная с шага 1.3 в 1,75 мл трубку Эппендорф.
- Удалить PBS из образца ткани. Добавить 200 мкл лизирующего буфера (50 мМ Трис-HCl, рН 7,6, 1 мМ CaCl2, 0,2% Triton X-100 или NP-40, 5 мМ бутирата, и 1 ингибитора протеиназ коктейль). Добавить свежие акции PMSF решение лизис буфера (PMSF конечной концентрации 0,5 мМ). Однородный с голубыми гомогенизатор (Fisher Cat # 749521-1590) до тканей диссоциируют полностью без агрегации, инкубировать при комнатной температуре (комнатной температуры) в течение 10 минут.
- Ультразвуком: использование микроострийных sonicator (Misonix HS-XL200) при мощности 20. Разрушать ультразвуком в течение 10 секунд и отдыха на льду в течение 50 сек. Повторить 4-5 раз (оптимальное время обработки ультразвуком должны определяться эмпирически, а больше ультразвука даст более мелкие фрагменты. Для чипов с использованием антител против гистонаэлектронной модификаций, мы обычно разрушать ультразвуком хроматина около 200-300 б.п., для фактора транскрипции хроматина или регулятора (например, белки Polycomb), мы обычно разрушать ультразвуком хроматина в 200-1000 пар оснований. Тем не менее, оптимальный размер фрагмента должны быть проверены опытным путем. Примечание: Всегда держите пробирку на льду ДАЖЕ ВО ИЗБЕЖАНИЕ SONICATING ОБРАЗЕЦ от нагревательных UP!
- Разбавьте образец путем добавления 1,8 мл RIPA буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 7,6, 1 мМ ЭДТА, 0,1% SDS, 0,1% Na-Deoxycholate, 1% Тритон Х-100, с ингибиторами протеазы и PMSF в той же концентрации, как описано ранее). Скидка 40 мкл в качестве входного контроля путем добавления 2 мкл 5М NaCl и инкубировать при температуре 65 ° С в течение ночи (O / N) отменить сшивки.
- Для сопряженных антител к бисером, добавить 40 мкл белка бисером 1,5 мл трубки Эппендорф, а затем добавить 600 мкл PBS и рок-при 4 ° С в течение 2 минут, нанесите бисером магнита и удалить супернатант. Добавить 100 мкл PBS и антитело интереса (количество антител, должны быть определены эмпирическогочески). Выдержите при комнатной температуре в течение 1 часа или 4 ° C в течение 4 часов.
- Удалите супернатант из бисера магнитом и добавьте 1 мл экстракта хроматина, начиная с шага 2.4 бисера. Поворот на 4 ° CO / N.
- Применить ChIP образца магнита и удалить супернатант. Вымойте бисер со следующими буфера при 4 ° С в течение 10 минут каждый:
2 раза с 1 мл буфера RIPA [1.89 мл "RIPA буфера + 315 мкл 7x ингибиторов протеазы + 20 мкл PMSF];
2 раза с 1 мл буфера RIPA + 0.3 М NaCl [1.89 мл RIPA буфера + 220 мкл 3 М NaCl];
2 раза с 1 мл буфера LiCl (0,25 М LiCl, 0,5% NP40, 0,5% NaDOC);
1x 1 мл 1x TE + 0,2% Тритон Х-100;
1x 1 мл 1x TE. - Чтобы отменить сшивки, ресуспендируют бусины в 100 мкл буфера TE + 3 мкл 10% SDS + 5 мкл протеиназы К (20 мг / мл). Инкубировать при температуре 65 ° CO / N.
- Применить бисером магнита и передавать супернатант в новую пробирку. Супернатант содержащий образец ДНК. Вымойте бусин со 100 мкл TE + 0,5 МNaCl и объединить два супернатант.
- Фенол-хлороформ извлечь образец ДНК. Добавить 200 мкл фенола: Chlorofrom: IAA (25:24:1), перемешать и вихрь. Спиновая на 14k в течение 5 минут при комнатной температуре. Кроме того, ДНК может быть извлечен с помощью ПЦР Qiagen очистки комплект.
- Перенести супернатант / водный слой в новую пробирку и добавить линейный акриламида до конечной концентрации 20 мкг / мл (в качестве альтернативы 1 мкл гликогена в дозе 20 мг / мл на 1 мл надосадочной также может быть использован. Гликоген используется для последующие КПЦР или ПЦР в то время как линейный акриламида используется для секвенирования анализов). Добавьте 20 мкл 3М NaOAc и 500 мкл 100% этанола. Хорошо перемешать и инкубировать при температуре 80 ° С в течение 10 минут. Спиновая на максимальной скорости в течение 20 минут при 4 ° C.
- Удалить супернатант и промыть 300 мкл 70% этанола. Воздух сухой и ресуспендируют образца в 50 мкл буфера ТЕ. Пример теперь можно хранить при температуре -20 ° C. Пример может быть использован для количественной ПЦР (КПЦР) анализа (рис. 1).
3а. Анализ ChIP-е изд ДНК с использованием КПЦР
- Развести геномной ДНК на следующий концентрация сделать стандартной кривой: неразбавленным, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/5000.
- Для каждой пары праймеров, созданной КПЦР в двух экземплярах в 96-луночного планшета с геномной ДНК с шагом 3а.1, входного контроля и чип-е изд ДНК:
10 мкл 2x SYBR ПЦР смеси (Fermentas, K0222);
1 мкл 10 мкМ прямого праймера;
1 мкл 10 мкМ обратный праймер;
х мкл ChIP-е изд ДНК (входной контроль, или геномной ДНК);
у мкл нуклеазы свободного H 2 O, чтобы настроить реакцию объема до 20 мкл. - Спином вниз 96-луночного планшета с мини-пластинка счетчика (LabNet).
- Выполните КПЦР с ABI 7300 ПЦР в реальном времени система (или другой ПЦР в реальном времени системы) с использованием следующих условий:
Этап 1: 50 ° C в течение 2 мин, 1 цикл;
Этап 2: 95 ° C в течение 10 мин, 1 цикл;
Этап 3: 95 ° C в течение 15 с, 60 ° С в течение 1 мин, 40 сycles;
4 этап (этап диссоциации): 95 ° C в течение 15 с, 60 ° С в течение 1 мин, 95 ° C в течение 15 секунд. - Проверьте кривой диссоциации: один пик на участке тепловой диссоциации указывает на одну из ампликона реакции ПЦР. Более одного пика указывает неспецифический продукт с пары праймеров, КПЦР данные не должны быть использованы.
- Определение линейной фазе экспоненциального усиления реакции ПЦР для каждого праймера набор, путем расчета по формуле, которая разрешает количество ДНК в соответствии с Ct (цикл порогового) значения, которое базируется на стандартной кривой с применением последовательности геномной ДНК, разбавленный в 3а. 1.
- Если значение Ct чип-е изд ДНК и входной контроль в пределах линейного диапазона значение Ct, расчет обогащения чип-е изд ДНК в зависимости от входного, в соответствии с фактором разбавления чип-е изд ДНК и входной контроль 2.4.
3b. Усиление ChIP-е изд ДНК для секвенирования высокой пропускной способностью.
- Окончание ремонта чип-е изд смесь ДНК (используйтеЭпицентр ДНК-END Ремонтный комплект), созданный на льду:
1-34 мкл геномной ДНК с шагом 2.12 (от 0,1 до 5 мкг)
5 мкл 10х буфера ремонт End
5 мкл 2,5 мМ дНТФ смеси
5 мкл 10 мМ ATP
х мкл H 2 O, чтобы настроить реакцию объема до 49 мкл
1 мкл конечного ремонта ферментов смеси (T4 ДНК-полимеразы T4 + киназы полинуклеотидных)
Инкубировать 45 минут при комнатной температуре. Очисти реакции с использованием Qiagen MinElute реакции
Очистка комплекта. Элюции в 30 мкл буфера элюирования (EB). - Добавить-выступы на конец 3 ':
30 мкл элюированных продукт ДНК шаг 3b.1
5 мкл 10х буфера NEB № 2
10 мкл 1 мМ дАТФ
2 мкл дН 2 O
3 мкл 5 U / мкл фрагмента Кленова (3 '→ 5' экзо-)
Инкубировать 30 минут при 37 ° C. Очисти реакции с использованием MinElute ReactionCleanup комплект. Элюции в 10 мкл EB. - Solexa компоновщик перевязки:
10 мкл элюированных ДНК шаг 3b.2
10 мкл DDH 2 O
2,5 иму, л 10x буфер Т4 ДНК-лигазы
1 мкл адаптер олиго смесь из Illumina (1/10-diluted со склада)
2,5 мкл T4 ДНК-лигазы (400 ед / мкл)
Выдержите в течение 1 часа при комнатной температуре. Очисти реакции с использованием MinElute ReactionCleanup комплект. Элюции в 20 мкл EB. Пример теперь можно хранить при температуре -20 ° C. - Запустите элюированных образец ДНК шаг 3b.3 помощью E-гель аппарата. Изолят 300-500 б.п. полосы в геле и очистить использованием Добыча Qiagen гель комплект (этот шаг устраняет ~ 125 б.п. самостоятельно перевязанной линкеры с перевязкой адаптер олиго). Элюции в 12 мкл EB.
- Усиление библиотеки с помощью парного класса (PE) грунтовки от Illumina:
10,5 мкл элюированных ДНК шаг 3b.4
12,5 мкл Mix Master (2х Phusion HF, Finnzymes)
1 мкл PE1 ПЦР праймер 1
1 мкл PE2 ПЦР праймер 2
ПЦР условия:
98 ° C в течение 30 сек
(98 ° C 10 сек, 65 ° С, 30 сек, 72 ° C 30 сек), повторите 20 циклов
72 ° C в течение 5 минут. - Образцы шаг 3b.5 могут быть использованы для чип-далее после выбора соответствующего размера ДНК (300-500 б.п.), используя стандартный 2% агарозном геле. Пример теперь можно хранить при температуре -20 ° C. Лучше всего, чтобы изолировать каждый чип образца на одном гель для предотвращения загрязнения. Образцы могут быть представлены для высокой пропускной последовательности.
3c. Solexa трубопровода анализ
- 25 б.п. последовательности чтения были получены из Illumina Genome Analyzer (GA) трубопровода.
- Все чтения были согласованы с геном дрозофилы (дм3) с помощью Эланд (Эффективное местное выравнивание нуклеотидных данных) программное обеспечение, позволяющее до двух несоответствия со ссылкой последовательности.
- Уникальная отображается чтения были сохранены для последующих анализа. Для нескольких одинаковых чтения, до трех экземпляров были сохранены, чтобы уменьшить вероятность отклонений от ПЦР.
- Выход трубопровода GA был преобразован в браузере расширяемой данных (BED) файлы.
- Для созданияпарик файлы для загрузки в УСК браузер для визуализации, мы использовали питона сума, которая была описана в предыдущей публикации 3 на 4 б.п., как размер окна и 160 б.п., как размер фрагментов ДНК.
- Для классификации дрозофилы гены в тихом и выразил генов, мы использовали цифровой номер, называемый RPKM (чтение / в килобаз объединены exonic области / на миллион подключенных читает). Гены с RPKM = 0 были классифицированы как тихий и группы генов с RPKM ≥ 1 были разделены на выраженные группы, которые могут быть разделены на три подгруппы, как гены с низким, средним и высоким уровнем экспрессии, и каждая группа имеет примерно такое же количество генов.
- Для сравнения уровня модификации гистонов и экспрессии генов, мы использовали Python скрипт, который был описан в предыдущих 3 публикации.
4. Представитель Результаты
Примеры чип-КПЦР результатов с помощью БАМ (мешок мрамор) мутант яички показано на рисунке 1 4. В бац яичках, происходит сбой в процессе перехода от пролиферации сперматогоний к дифференциации сперматоциты 5, 6. Мы используем бац яички как источник недифференцированных клеток зародыша, которые обогащаются в этой ткани типа. Дифференциация генов, необходимых для спермы дифференциации, таких как мужчины конкретного фактора транскрипции 87 (mst87F), Дон Жуан (DJ), а также нечеткие лук (ФЗО), не выражены в бац яичек. Эти гены обогащенного с репрессивным H3K27me3 гистонов модификация 7 (рис. 1а), но лишены активного H3K4me3 гистонов модификации 8 (рис. 1б), хроматина подписи мы назвали "моновалентная" 7. Обогащение либо H3K27me3 или H3K4me3 определяется нормализацией к конститутивно выразил циклин (CycA) гена 4.
Содержание "> Chip-далее анализ, используя тот же набор антител (т.е. репрессивной H3K27me3 и активного H3K4me3) с бам мутант яичек (рис. 2) подтверждены КПЦР результаты, показанные на рисунке 1. За три проверенных генов дифференциации терминал mst87F, ди-джей и ФЗО , их генома высоко обогащенного H3K27me3 но не H3K4me3 (рис. 2A-2C). В отличие от конститутивно выразил CycA ген имеет значительный H3K4me3 мало H3K27me3 обязательным вблизи старта транскрипции сайт (TSS) (рис. 2D).Кроме того, чип профили H3K27me3 и H3K4me3 у TSSs из четырех классов-разному экспрессируются гены в соответствии с функцией каждого гистона модификации. Как показано на рисунке 3A, обогащение H3K27me3 вниз по течению от TSSs обратно коррелирует с уровнем экспрессии гена. Молчащие гены имеют самый высокий в то время как H3K27me3высокий уровень экспрессии генов не H3K27me3 обязательным. Эти данные согласуются с репрессивной роли H3K27me3 на экспрессию генов. В отличие от обогащения H3K4me3 вокруг TSSs показали противоположную корреляцию с уровнем экспрессии генов (рис. 3В), в соответствии с активной ролью H3K4me3 на экспрессию генов.
Рисунок 1. КПЦР анализ чип-е изд ДНК с использованием антител против любой репрессивный H3K27me3 гистонов модификации (А) или активный H3K4me3 гистонов модификации (B) в недифференцированные клетки обогащенного БАМ мутант яичек. (A) в бац яичек, дифференциацию генов (Mst87F, диджей, ФЗО) обогащены H3K27me3 репрессивных гистоновых модификаций. (Б) дифференциация генов с обедненным H3K4me3 активный знак. Уровень ChIP ДНК (ДНК ChIP / вход) на ген-мишень (Mst87F, ди-джей или ФЗО) впервые была нормирована на лев Эл ChIP ДНК в геном контроль CycA. Ошибка полоски указывают на отклонение от трех независимых биологической репликации.
Рисунок 2. УСК геноме браузера снимки H3K27me3 и H3K4me3 обогащение всей геномных регионов (A) Mst87F (B) и ди (C) ФЗО, (D) CycA генов. Кружил H3K27me3 обогащенного региона (D) отражает статус хроматина перекрывающихся генов CG7264, который скромно выраженная в бац яички (RPKM = 1), но очень выраженный в дикого типа яичек (RPKM = 130) 8 (Chip-последующие данные из 7). Датчики используются в количественном анализе ПЦР ChIP результаты на рисунке 1 обозначены в нижней части каждого участка. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
tp_upload/3745/3745fig3.jpg "/>
Рисунок 3. ChIP-след профилей с использованием H3K27me3 и H3K4me3 в бац яички 7. Четыре группы генов (7509 генов) были классифицированы в соответствии с их уровнями экспрессии генов на основе РНК-последующие результаты 8. Представитель класса генов построены для обогащения определенной модификации гистонов, используя последовательность из 3кб вверх по течению вниз по течению 3кб своих сайтов старта транскрипции (TSSs). Это создает профиль обогащения (A) H3K27me3 (K27) и (B) H3K4me3 (К4) чип-последующие анализы в каждой группе. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Универсальность ChIP анализа обсуждаются в этот протокол может быть использован на различных тканях, что дает возможность изучить состояние хроматина в биологически соответствующей системы. ChIP экспериментов с использованием клеток из культуры системы удобно проводить, потому что большое количество клеток, могут быть легко получены. Тем не менее, культуре клеток, не обязательно отражают клеток многоклеточных окружающей среды. Развивая эту технику использовании расчлененные тканей живых животных, мы можем решить многие вопросы, которые культивируемых клеток не может.
Несмотря на полезность этого протокола, есть несколько предостережений. Например, рассеченные ткани по-прежнему гетерогенных с различными типами клеток. В то время как относительно однородные клетки могут быть получены в тканях Drosophila, таких как имагинальной дисков, других тканей, как кишки, яичек и яичников в каждом из которых ограниченные взрослые стволовые клетки неоднородны. Это осложнение может быть частичнорешить с помощью мощных дрозофилы генетики. Например, хотя взрослые стволовые клетки существуют в небольшой численности населения в тканях выше, и очень трудно выделить в достаточном количестве для чипа анализа стволовых клеток населения может быть обогащена использованием генетически мутировавшего фоне. Бам гена необходимо для дифференциации стволовых клеток дрозофилы в зародышевой линии 5,6. Поэтому бац мутант гонад являются хорошим источником для обогащенного недифференцированных клеток зародыша. Выполняя чипов с помощью бац мутант, мы можем получить эпигеномном пейзаж в недифференцированных клеток зародыша.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить лаборатории доктора Кеджи Чжао (NIH / NHLBI) за их помощь в обеспечении последовательности результатов. Мы также хотели бы поблагодарить УСК проект генома для использования генома браузер наглядно отображается последовательность чтения.
Эта работа была поддержана Путь R00HD055052 NIH на премию независимости и R01HD065816 из NICHD, Люсиль Parkard Фонда и Университета Джонса Хопкинса запуск финансирования для XC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco, Sigma-Aldrich | 47083-U | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Kontes pellet pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Linear polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 56575-1ML | |
| Glycogen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR green/ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plate spinner | Labnet International | Z723533 | |
| Real time PCR system | Applied Biosystems | 4351101 | |
| Small Volume Ultrasonic Processor | Misonix | HS-XL2000 | Model discontinued |
| Dynabeads, Protein A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magnet | Invitrogen | 123-21D | |
| Phenol:Chlorofrom:IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow Fragment (3’→5’ exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corp. | M1794 | |
| Adaptor oligonucleotides | Illumina | PE-400-1001 | |
| Paired-End Primer 1.0 and 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 | |
| E-Gel Electorphoresis system | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
References
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
- Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
- McKearin, D. M., Spradling, A. C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
- Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, 42-42 (2010).
- Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-783 (2010).
