Summary
Denne rapporten beskriver bruken av levende celle bildebehandling og photobleach teknikker for å bestemme overflaten uttrykket, transport stier og trafficking kinetikk eksogent uttrykt, pH-sensitive GFP-merket proteiner på plasmamembranen av nerveceller.
Abstract
Protocol
1. Cellekultur, Viral Transduksjon, og protein uttrykk
- Kultur høy tetthet hippocampus nerveceller fra embryonale dag 18 (E18) rotteunger på poly-L-lysin-belagte glass Dekkglass for 14-25 dager in vitro (DIV).
- 6-24 timer før de live eksperimenter, transduce celler med svekket Sindbis viruset inneholder membran protein av interesse, merket med super-ekliptikken pHluorin (SEP).
- Legg til pseudovirion-holdig medium direkte til dekkglass inneholder 1 ml aircondition media og returnerte til kulturinkubatoren. Den titer og tid for protein uttrykk følge viral transduksjon vil variere avhengig av virus bakst og bør bestemmes for hvert parti før igangsetting live celle eksperimenter.
2. FRAP-FLIP Live-Cell Imaging
- Utstyr set-up
- Overfør dekkglass til bildebehandling kammer av en Zeiss Axiovert LSM 510 META confocal mikroskop.For å minimere strømsvingninger under bildebehandling, sikre mikroskop er slått på, med 100% laser utgang, i minst 20 minutter før bildebehandling.
- Umiddelbart erstatte kultur medium med forvarmes (37 ° C) ekstracellulære opptak løsning inneholder 140 mM NaCl, 5 mm KCl, 15 mM glukose, 1,5 mm 2 CaCl, 1,5 mm 2 MgCl, 20-25 mm HEPES (pH justert til 7,4 med NaOH) og plasser i kammeret på forvarmet stadium (37 ° C) av Zeiss Axiovert.
Sikre osmolaritet av ekstracellulær opptaket løsningen tilpasses innenfor 10 mOsm av din kultur medium. Forutsatt ingen signifikant fordampingen oppstår under timecourse av forsøket, er dette CO 2 uavhengige løsning egnet for korte eksperimenter (<10 timer). Supplere med 1-2 mm natrium bikarbonat anbefales.
- Definere imaging fange parametrene
- Først identifiserer et nevron uttrykke rekombinante proTEIN av interesse og få den i fokus.
- Med en 63x olje protesterte, erverve et bilde av hele cellen ved hjelp av 488nm laser lys magnetisering ved lav laser makt. For å minimere photobleaching, bruk en rask nominell hastighet (7-9) og lav oppløsning (512-512) holde total skannehastighet <1 sekund.
- Velg en del av dendrite til bilde og zoom for å fange en ramme som inneholder ROI (~ 1.5 til 2.5 x optisk zoom). Der det er mulig, sikre synsfeltet inneholder flere prosesser slik at målinger fra referansenummer dendritter kan oppnås, for å avgjøre om ikke-spesifikk photobleaching grunn kjøpet skjer.
- Juster filtre, pinhole, skannehastighet og detektor gevinst å muliggjøre maksimal fluorescens fra minimal laser eksitasjon, men med begrenset metning. En stor pinhole diameter anbefales, for å maksimere foton samling (2μm er egnet for pigger og trefoldig dendritter). Detektoren gevinst skal være sterk nok til å oppdage små fluorescens trinn,slik at de aller første bildene, før fotobleking ikke overvinne 10% av mettede piksler.
- Lagre denne konfigurasjonen skal brukes til pre-/ post-blekemiddel og utvinning faser av forsøket.
- Neste definere photobleach regioner; velge en ROI for den første photobleach og flankerer regioner for den påfølgende repeterende fotobleking fase. Sørg for at flankerer regionene er brede nok til å hindre utvinning ved diffusjon mellom skanninger (typisk 5 mikrometer, se fig. 2).
- Juster blekemidler parametrene for begge photobleach Rois. Den innledende photobleach bør være rask (0.1 til 0.5 sek) krever mellom 1-5 gjentakelser, avhengig av optisk zoom og volumet av avkastningen. For de flankerer regionene bør laser eksitasjon bli justert for å sikre kontinuerlig fotobleking av de flankerer regionene, men uten fototoksisk skade.
- Som en retningslinje, bruker vi 100% laser magnetisering for den første photobleach, og 10% for repeterende photobleaching phASE.
- Bilde oppkjøp
- Når alle parametere er satt, utfører FRAP-FLIP eksperiment som en variabel time-lapse bilde sekvens, skissert i de 4 kvartaler nedenfor:
Blokk 1: 3-10 pre-blekemiddel baseline bilder, ved lav laser makt, ingen tidsforsinkelse
Blokk 2: Photobleach den sentrale ROI på full laser makt, 1-5 iterasjoner
BLOCK 3: 3-10 post-bleke utvinning bilder
Blokk 4: Gjentatte photobleach av flankerer regioner ved middels laser strøm med fotografering på et typisk intervall på 1 - 5 sekunder, avhengig av utvinningsgraden av protein under etterforskning. - Endelig erstatte ekstracellulære opptak løsning med opptak løsning bufret på pH6 inneholder 140 mM NaCl, 5 mm KCl, 15mm glukose, 1,5 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 20-25 mm MES (å slukke fluorescens) eller supplert med 50 mm NH4Cl inneholder 90 mM NaCl, 5 mm KCl, 15 mM glukose, 1,8 mM CaCl 2, 0,8 mm2 MgCl, 20-25 mm HEPES og pH7.4 (å avdekke de proteiner i lav pH intracellulære butikker), (se fig. 2).
- Samle minst 10 til 20 datasett for hver rekombinant protein, for å muliggjøre statistisk analyse. For å unngå bias resultater, sikrer imaging vilkår er opprettholdt konsekvent på tvers av replikater. Kast alle datasett der ufullstendig bleking, vesentlig fokusplan drift eller fototoksisk celleskader blir observert.
- Når alle parametere er satt, utfører FRAP-FLIP eksperiment som en variabel time-lapse bilde sekvens, skissert i de 4 kvartaler nedenfor:
3. Data Analysis
- Åpne bilder med ImageJ programvare.
- Juster stabler å gjøre rede for små svingninger i xy planet som kan ha oppstått gjennom hele tidsserien ved hjelp Stackreg plugin (programtillegg → stackreg → transformasjon: stiv kropp →
). - For bilder tatt på Zeiss confocal, bruke LSM Toolbox plugin til å rapportere de tidsverdier som en tekstfil (plugins → LSM Toolbox → Vis LSM Toolbox →
→ ),og importere disse verdiene inn i en analyse regneark. - For å måle fluorescens svingningene i løpet av FRAP-FLIP eksperiment, dele photobleached segmentet i enkelte pixel regioner (~~~HEAD=NNS 20pixels) og måle gjennomsnittlig fluorescens av disse Rois på hvert tidspunkt (F). Hvis du raskt skaffe disse verdiene, velger flere Rois bruker ImageJ 'ROI Manager "analyseverktøy (Analyze → Verktøy → ROI Manager) og rapporterer gjennomsnittlig fluorescens per piksel ved hjelp av' Plot Z-aksen profil 'kommando (Bilete → Stacks → Plot Z -aksen profil).
- Gjenta dette trinnet for å måle fluorescens intensiteten av en bakgrunn, ikke fluoriserende region.
- Normalisere fluorescensintensiteten på hvert tidspunkt ved å trekke bakgrunnsverdiene for å fjerne eksperimentell støy, og dele alle verdier av gjennomsnittlig pre-bleket baseline mål.
- Mål fluorescensintensiteten av tilstøtende ikke-photobleached dendritter å vurdere nivået av ikke-spesifikkphotobleaching under oppkjøpet. Korreksjon for ikke-spesifikk fotobleking frarådes for tolkning av "FRAP-Flip 'data, og bør unngås når det er mulig.
- For å beregne om oppsving har skjedd i en ROI, trekker gjennomsnittet av de siste 5-10 mål på sekvensen fra gjennomsnittet av de første 5-10 tiltak (ΔF) og bestemme statistisk signifikans. Kategorisere utvinne og ikke-utvinne Rois å vurdere mønsteret av eksocytose (dvs. eksocytose hotspots eller ryggraden vs aksel Recovery).
4. Representative Resultater
Utfallet av typiske FRAP-FLIP eksperiment er vist i fig. 2. Her har et nevron uttrykke GluA2 subenheten av AMPA typen glutamat reseptor, merket med september vært selektivt photobleached langs en region av dendrite. Fig. 2. En illustrerer regionen dendrite som har blitt avbildet og indikerer Rois som har blitt valgt for photobleaching (hvite boksen regioner). The stor hvit eske området ble bleket gang, etterfulgt av repeterende bleking av flankerer eske regionene, markert med doble ledet blå piler. Den røde pilen viser den målte ROI, vist i høy forstørrelse i de nedre panelene.
Fig 2.b, viser fluorescensintensiteten i den målte avkastningen over tid løpet av eksperimentet. I dette eksempelet, ble ett minutt restitusjonsperiode registreres etter første photobleach å tillate ubleikede reseptorer å gå inn i ROI ved lateral diffusjon. Når flankerer regionene er photobleached, er fluorescens signalet fra denne svært bevegelige brøkdel av reseptorer okkludert fra den sentrale regionen, og de innenfor regionen er fortynnet ut. Økningen i fluorescens (ΔF) observert over 'Flip' sekvensen kan derfor tilskrives innføring av SEP-GluA2 i dendrittiske akselen. Den lave pH vask og pH 7,4 + NH4Cl tillegg henholdsvis bekrefter at den målte fluorescens er avledet fra overflatenproteiner og avsløre hvor stor andel av intracellulære og isolert proteiner innenfor den målte avkastningen.
I motsetning til FRAP, isolerer denne metodikken utvinning på grunn av eksocytose, noe som resulterer i et sterkt redusert nivå av fluorescens utvinning i photobleached regionen. Hittil ingen pålitelig matematisk modell er utviklet for å passe og analysere oppgangen sporer opp ved bruk av denne selektive bleking teknikk. Det er imidlertid mulig å montere utvinning spor med en mono eksponentiell recovery:
F (t) = A s - A 0 e (-t / τ)
Hvor F (t) er fluorescens ved tiden t, er A s steady state verdi, A 0 er offset ved tid 0, er τ tiden konstant. Oppgangen Veksten er festet med en gitt sats for å nå en likevekt, svarende til en stabil tilstand mellom innsetting og diffusjon. Viktigere, hentet tiden konstant fra dette ennalysis reflekterer ikke tidskonstant eksocytose og kan bare brukes for sammenlignende behandlinger for en individuell protein.
Videre er det forventet mønster av fluorescens utvinning vil trolig bli observert i sub-domener langs photobleached regionen. Analyse av små ROI innenfor en photobleached segment kan være avgjørende for å avsløre eksocytose "hotspots", og det er tilrådelig å analysere regioner av sammenlignbare lengder som variasjonen av tetthet av disse plassene blant dendrite vil påvirke beregnet rate.
Fig. 3 viser en forlengelse av denne protokollen, påføre photobleach til stor del ROI med flere dendritter i synsfeltet, etterfulgt av selektiv repetitive bleking av bare én dendrite. Denne tilnærmingen gjør tradisjonelle "FRAP 'og' FRAP-Flip 'data som skal erverves parallelt. I dette eksempelet har hippocampus nevroner blitt smittet med en glutamat reseptor subenhet av kainate klassen; SEP-merket GluK2. PRIOr til bildebehandling, ble neurons-disse behandles med cylcohexamide (2 timer på 200μg/ml), for å blokkere proteinsyntesen. Som sådan, fluorescens utvinning i de respektive målt Rois (Fig 3.b) avslører andelen utvinning på grunn av lateral diffusjon og gjenvinning i standard FRAP dendrite versus resirkulering alene i dendrite utsatt til 'FRAP-FLIP' protokoll. Sammenligning av ΔF verdiene fra FRAP versus 'FRAP-Flip' utvinning kurver, de relative bidrag til resirkulering (ΔF rec = 11,05%) versus lateral diffusjon (ΔF diff = 9,35%) kan utledes. I motsetning til Figur 2, ikke oppgangen ikke opprettholde en stabil tilstand nivå, men snarere på grunn av hemming av proteinsyntesen, viser en forbigående økning og påfølgende drop-off i signalet, tilsvarende utarming av det tilgjengelige reseptor bassenget (ca 20% nedgang observert over opptaket perioden).
Figur 1. Skjematisk av prinsippene til FRAP vs FRAP-FLIP protokoller Denne skjematiske illustrerer resultatene av en vanlig FRAP versus en 'FRAP-FLIP' protokoll, med SEP-merkede reseptorer. Fluorescens utvinning i tradisjonell FRAP vises på venstre side. Målt fluorescens utvinning i det sentrale ROI skyldes en kombinasjon av lateral diffusjon f non-photobleached SEP-merket reseptorer fra utenfor photobleached ROI og innsetting av reseptorer gjennom resirkulering og / eller de novo eksocytose i dendrittiske akselen. I motsetning til repeterende photobleached av flankerer Rois illustrert i høyre side, viser hvordan dette endret 'FRAP-FLIP' protokoll stillhet utvinning på grunn av lateral diffusjon. Dermed kan eventuelle målte fluorescens utvinning tilskrives direkte innsetting i ROI.
Figur 2.Innsetting av SEP-GluA2 i plasma membran på dendrittiske akselen
A) En hippocampus nevron uttrykker SEP-GluA2, selektivt photobleached langs en region av dendrite. Skjematisk illustrerer regionen dendrite som har blitt fotografert, mens den øvre venstre panel understreker Rois som har blitt valgt for photobleaching. Det store hvite eske området ble bleket gang, etterfulgt av repeterende bleking av flankerer eske regionene, markert med doble ledet blå piler. Dette panelet viser dendrite før photobleaching. Den røde pilen viser den målte ROI, vist i høy forstørrelse i de nedre panelene. B) viser fluorescensintensiteten i den målte avkastningen over tid løpet av forsøket, plottet som grå nivå i ROI (ikke normalisert). Den svarte pilen markere endepunktet i den innledende photobleach og grønn pil indikerer starten av repeterende fotobleking. ΔF indikerer the økning i fluorescens observert over utvinning perioden, grunnet innsetting av SEP-GluA2 til dendrittiske akselen. Etterfølgende lav pH og pH 7,4 + NH 4 cl vasker bekrefte at den gjenopprettede fluorescens gjelder overflaten uttrykt reseptorer.
Figur 3. Resirkulering og lateral spredning vs Gjenvinning av SEP-GluK2 på dendrittiske skaftet etter cyclohexamide behandling
A) En hippocampus nevron uttrykker SEP-GluK2, selektivt photobleached med parallell FRAP og 'FRAP-Flip' utvinning protokoller utført langs separat dendrittiske Rois. Dette nevron var underlagt forbehandling med cyclohexamide, for å blokkere proteinsyntesen (2 timer ved 200 mikrogram / ml). Skjematisk illustrerer regionen dendrite som har blitt fotografert, mens panelet til venstre fremhever Rois som har blitt valgt for photobleaching. The stor hvit eske området ble bleket gang, etterfulgt av repeterende bleking av flankerer eske regionene, av nedre dendrite bare markert med doble ledet blå piler. Dette panelet viser dendritter før photobleaching. Røde piler markere Rois vist i høy forstørrelse i B) illustrerer fluorescens oppgangen i tradisjonell FRAP versus 'FRAP-FLIP' protokoll. Sammenligninger av nivåer av fluorescens intensitet sent stadium av utvinning (tredje paneler) viser bidraget av lateral diffusjon og gjenvinning versus resirkulering alene. C) viser fluorescensintensiteten i den målte Rois over tid løpet av forsøket, plottet som normalisert intensitet verdier. Den svarte pilen markere endepunktet i den innledende photobleach og grønn pil indikerer starten av repeterende fotobleking. ΔF rec indikerer forbigående bedring på grunn av reseptor gjenvinning, bestemmes ut fra FRAP / FLIP dendrite mens ΔFdiff måler bidrag lateral spredning av SEP-GluK2 inn dendrittiske akselen i 'FRAP bare "avkastning. Den forbigående økning etterfølges av gradvis nedgang i signal, tilsvarende oppløpet ned over tilgjengelige reseptorer som følge av cyclohexamide behandling. Den påfølgende lav pH og pH 7,4 + NH 4 cl vasker bekrefte at den gjenopprettede fluorescens gjelder overflaten uttrykt reseptorer.
Discussion
Vi beskriver en innovativ strategi for å visualisere de komponentene i plasma membran protein menneskehandel. Den kombinatorisk tilnærming photobleaching teknikker med SEP-tagget protein gjør selektivt plasma membran innsetting hendelser skal vurderes. Ved kontinuerlig photobleaching de membran proteiner i flankerer regioner under utvinning, vurderer 'FRAP-Flip' metode bidrag vesikulær menneskehandel til fluorescens utvinning. Denne romanen tilnærmingen gjør direkte opptak av protein membran innsetting, slik både antall sub-avdelinger der utvinning er observert og amplituden av oppgangen (ΔF) ved steady state som skal bestemmes. Videre tillater sammenligning av FRAP med og uten FLIP andelen utvinning tilskrives lateral spredning skal beregnes.
Videre, i samme eksperiment, kan regionene ikke-photobleached dendrite grenser mot flankerer photobleached regionene værekvalitativt vurdert under utvinning, fluorescens tap observert i disse regionene vil skyldes lateral spredning av photobleached reseptorer i disse ikke-photobleached segmenter av dendrite.
Dette selektiv photobleaching protokollen kan benyttes til å undersøke en rekke cellulære trafficking prosesser som karakteriserer excocytosis i plasmamembranen i definerte delområder (for eksempel dendritter eller pigger) eller vurdere bidraget av lateral spredning vs innsetting ved å gjennomføre parallelle FRAP og 'FRAP -Flip 'protokoller langs tilstøtende dendritter (fig 3).
Åpenbart, mens spesifikke retningslinjer har blitt presentert, vil hver lab trenger optimalisere imaging parametere i henhold til bestemte prøver og utstyr. Viktigere, alle overflate reseptorer i ROI må være photobleached, uavhengig av z-aksen fokusplanet, men uten vesentlig fototoksisk skader eller uspesifikke fotobleking. OssERS bør utvise forsiktighet når du prøver denne protokollen på cellen Soma, som den høye prosentandelen av relativt lav pH intracellulære rom vanligvis resulterer i høy bakgrunnsfluorescens i disse regionene. Videre, mens vi har vist hvordan denne teknikken kan brukes i varierer måter, før igangsetting selektive photobleaching eksperimenter på en ny SEP-merket konstruere, anbefaler vi at en første karakterisering av de merkede reseptorene er først gjennomføres, som beskrevet av Ashby m.fl. 2.
Samlet sett er denne metoden en kraftig og allsidig tilpasning av standarden FRAP protokollen, slik at innsettingspunktet hendelser i plasma membran skal vurderes i nær sanntid.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Wellcome Trust og ERC for økonomisk støtte. IMGG er en embo Fellow. KLH er en BBSRC-finansiert PhD student. Vi takker Philip Rubin og Patrick Tidball for teknisk og cellekultur støtte og Dr Andrew Doherty for vedlikehold og assistanse med mikroskop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24mm glass coverslips | VWR international | 631-0161 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | 1mg/ml in borate buffer to coat coverslips |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 2% in neuronal plating and feeding medium |
| Penicillin Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 1% in neuronal plating and feeding medium |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 2mM / 0.8mM in plating/feeding medium |
| Horse Serum | Biosera | DH-291H | 10% in neuronal plating media only |
| pSIN ReP5 cloning vector | Invitrogen | K75001 | For Sindbis virus production |
| LSM510 META confocal system | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Image J Software | National Institutes of Health | open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/ |
References
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP. Trends Neurosci. 27, 257-261 (2004).
- Swaminathan, R., Hoang, C. P., Verkman, A. S. Photobleaching recovery and anisotropy decay of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion. Biophys. J. 72, 1900-1907 (1997).
- Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).
- Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. Fluorescent proteins for live cell imaging: opportunities, limitations, and challenges. IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).
- Ashby, M. C. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24, 5172-5176 (2004).
- Bouschet, T., Martin, S., Henley, J. M. Receptor-activity-modifying proteins are required for forward trafficking of the calcium-sensing receptor to the plasma membrane. J. Cell. Sci. 118, 4709-4720 (2005).
- Ashby, M. C., Maier, S. R., Nishimune, A., Henley, J. M. Lateral diffusion drives constitutive exchange of AMPA receptors at dendritic spines and is regulated by spine morphology. J. Neurosci. 26, 7046-7055 (2006).
- Martin, S., Bouschet, T., Jenkins, E. L., Nishimune, A., Henley, J. M. Bidirectional regulation of kainate receptor surface expression in hippocampal neurons. J. Biol. Chem. 283, 36435-36440 (2008).
- Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent membrane drift recruits AMPA receptors to dendritic spines. J. Biol. Chem. 284, 12491-12503 (2009).
