Summary
Dit rapport beschrijft het gebruik van live cell imaging en photobleach technieken om de oppervlakte-expressie, transportroutes en handel in kinetiek van exogeen uitgedrukt, pH-gevoelige GFP-gelabelde eiwitten in de plasmamembraan van neuronen te bepalen.
Abstract
Protocol
1. Cultuur van de Cel, virale transductie, en eiwitexpressie
- Cultuur met een hoge dichtheid hippocampale neuronen uit embryonale dag 18 (E18) jonge ratten op poly-L-lysine-gecoate dekglaasjes voor 14-25 dagen in vitro (DIV).
- 6-24 uur voorafgaand aan de live-experimenten, transduceren cellen met een verzwakte Sindbis virus met het membraan eiwit van belang, gelabeld met de super-ecliptica pHluorin (SEP).
- Direct Voeg de pseudovirion-bevattende medium om de dekglaasje met 1 ml van de geconditioneerde media en keerde terug naar de cultuur incubator. De titer en tijd na virale eiwitexpressie transductie afhankelijk van de virusbatch en worden voor elke partij alvorens aan levende cellen experimenten.
2. FRAP-FLIP live cell imaging
- Apparatuur set-up
- Breng het dekglaasje aan de beeldvorming kamer van een Zeiss Axiovert LSM 510 META confocale microscoop.Om schommelingen in de spanning te minimaliseren tijdens de beeldvorming, zorgen voor de microscoop is ingeschakeld, met 100% laser output, gedurende tenminste 20 minuten voorafgaand aan de beeldvorming.
- Onmiddellijk vervangen kweekmedium met voorverwarmd (37 ° C) extracellulaire oplossing die 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glucose, 1,5 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 20-25 mM HEPES (pH ingesteld op 7,4 met NaOH) en plaats de kamer op de voorverwarmde fase (37 ° C) van de Zeiss Axiovert.
Zorgen de osmolariteit van het extracellulaire oplossing wordt tot binnen 10 mOsm van kweekmedium. Mits geen significante verdamping plaatsvindt tijdens het tijdsverloop van het experiment CO 2 onafhankelijke oplossing geschikt is voor korte experimenten (<10 uur). Aan te vullen met 1-2 mM natrium-bicarbonaat wordt aanbevolen.
- Het definiëren van de beeldvorming capture parameters
- Eerst identificeren van een neuron expressie van het recombinante proeiwit van interesse en breng het in beeld.
- Met een 63x olie bezwaar, krijgen een beeld van de hele cel met behulp van 488nm laserlicht excitatie bij lage laservermogen. Het minimaliseren van fotobleken, gebruik maken van een snelle nominale snelheid (7-9) en lage pixel resolutie (512-512) het bijhouden van de totale scan snelheid <1 seconde.
- Selecteer een deel van dendriet om beeld en zoom in op een frame met daarin de ROI (~ 1.5-2.5 x optische zoom) vast te leggen. Indien mogelijk voor het gezichtsveld bevat verschillende processen is dat metingen uit referentie dendrieten kunnen worden verkregen, om te bepalen of niet-specifieke photobleaching door verwerving optreedt.
- Pas de filters, pinhole-, scan-snelheid en de detector winst voor maximale fluorescentie in staat stellen van minimale laser excitatie, maar met beperkte verzadiging. Een grote pinhole diameter wordt aanbevolen om foton collectie te maximaliseren (2 pm is geschikt voor stekels en ternaire dendrieten). De detector winst moet sterk genoeg zijn om kleine fluorescentie stappen op te sporen,zodanig dat de eerste beelden voor het fotobleken niet meer dan 10% verzadigde pixels overwinnen.
- Sla deze configuratie worden gebruikt voor het pre-/ na bleken en herstel fasen van het experiment.
- Vervolgens bepalen de photobleach regio's; het selecteren van een ROI voor de eerste photobleach en flankerende gebieden voor de volgende repetitieve fotobleken fase. Zorg ervoor dat de flankerende gebieden zijn breed genoeg om het herstel te voorkomen door diffusie tussen de scans (typisch 5 micrometer, zie Fig. 2).
- Pas het bleekmiddel parameters voor beide photobleach ROI. De eerste photobleach dient snel (0,1-0,5 sec) die tussen 1-5 iteraties, afhankelijk van de optische en het volume van de ROI. Voor de flankerende gebieden dient de laser excitatie aangepast continue fotobleken van de flankerende gebieden waarborgen zonder fototoxisch schade.
- Als leidraad gebruiken we 100% laser excitatie voor de eerste photobleach, en 10% voor de repetitieve fotobleken phase.
- Beeldacquisitie
- Als alle parameters zijn ingesteld, voert u de FRAP-FLIP experiment als een variabele time-lapse beeld sequentie, die in de 4 blokken hieronder:
VAK 1: 3-10 pre-bleach baseline beelden, bij lage laservermogen, geen tijd vertraging
Blok 2: Photobleach de centrale ROI op volle laservermogen, 1-5 herhalingen
BLOCK 3: 3-10 na bleken herstel beelden
Blok 4: Repetitive photobleach van de flankerende gebieden op medium laservermogen met het vastleggen van beelden op een typische tijdsinterval van 1 - 5 seconden, afhankelijk van de opbrengst van het eiwit in onderzoek. - Tenslotte de extracellulaire oplossing opname gebufferd op PH6 met 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15mm glucose, 1,5 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 20 tot 25 mM MES (tot doven fluorescentie) of aangevuld met 50 mM NH4Cl met 90 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glucose, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mMMgCl2, 20-25 mM HEPES, pH 7,4 (de eiwitten tonen in een lage pH intracellulaire voorraad) (zie Fig. 2).
- Verzamelen ten minste 10 tot 20 gegevens voor elk recombinant eiwit, statistische analyse mogelijk. Om vertekening resultaten te voorkomen, zorgen voor beeldvorming omstandigheden worden gehandhaafd consistent repliceert. Gooi alle gegevenssets waarbij onvolledige bleken, belangrijke focal plane drift of fototoxische celbeschadiging in acht worden genomen.
- Als alle parameters zijn ingesteld, voert u de FRAP-FLIP experiment als een variabele time-lapse beeld sequentie, die in de 4 blokken hieronder:
3. Data-analyse
- Open de beelden met ImageJ software.
- Lijn de stapels om rekening te houden voor kleine fluctuaties in het xy-vlak die zich hebben voorgedaan in de tijdreeksen met behulp van de STACKREG plugin (Plugins → STACKREG → transformatie: stijve carrosserie →
). - Voor foto's gemaakt op Zeiss confocale, gebruik maken van de LSM Toolbox plugin om de tijd die waarden als een tekstbestand (Plugins → LSM Toolbox → Toon LSM Toolbox melden →
→ ),en importeer deze waarden in een analyse spreadsheet. - Om de fluorescentie schommelingen tijdens de FRAP-FLIP experiment te meten, verdelen de photobleached segment in afzonderlijke pixel regio's (~ 20pixels) en meet de gemiddelde fluorescentie van deze ROI op elk tijdstip (F). Om snel te verkrijgen van deze waarden, selecteert u meerdere ROI met behulp van de ImageJ 'ROI Manager' analyse-instrument (Analyze → Extra → ROI Manager) en rapporteert de gemiddelde fluorescentie per pixel met behulp van de 'Plot Z-as profiel' opdracht (Afbeelding → Stacks → Plot Z -as profiel).
- Herhaal deze stap om de fluorescentie-intensiteit van een achtergrond, niet fluorescerende regio te meten.
- Normaliseren de fluorescentie-intensiteit op elk tijdstip door het aftrekken van de achtergrondwaarden van experimentele ruis te verwijderen, en alle waarden te delen door de gemiddelde pre-gebleekt nulmeting.
- Meet de fluorescentie-intensiteit van naburige niet-photobleached dendrieten tot het niveau van niet-specifieke beoordelenfotobleken tijdens de overname. Correctie voor niet-specifieke fotobleken wordt afgeraden voor interpretatie van 'FRAP-FLIP' gegevens en moeten zoveel mogelijk worden vermeden.
- Om te berekenen wanneer een significant herstel heeft plaatsgevonden in een ROI, af te trekken van het gemiddelde van afgelopen 5-10 maatregelen van de volgorde van het gemiddelde van de eerste 5-10 maatregelen (AF) en bepalen van de statistische significantie. Categoriseren de herstellende en niet-herstellende ROI om het patroon van exocytose (dat wil zeggen exocytose hotspots of wervelkolom vs as herstel) te beoordelen.
4. Representatieve resultaten
Het resultaat van typische FRAP-FLIP experiment wordt getoond in Fig. 2. Hier is een neuron de uiting van de GluA2 subeenheid van AMPA het type glutamaat receptor, gelabeld met SEP is selectief photobleached langs een regio van dendriet. Figuur 2.A illustreert de regio dendriet die is afgebeeld en geeft aan dat de ROI die zijn geselecteerd voor fotobleken (witte doos regio's). The grote witte doos gebied was ooit gebleekt, gevolgd door herhaalde bleken van de flankerende omkaderde gebieden, gemarkeerd met dubbele geleide blauwe pijlen. De rode pijl geeft de gemeten ROI, te zien in een hoge vergrotingsfactor in de onderste panelen.
Figuur 2.B, toont de fluorescentie-intensiteit in de gemeten ROI over de tijd loop van het experiment. In dit voorbeeld werd een minuut herstelperiode opgenomen na de eerste photobleach om ongebleekt receptoren het rendement door laterale diffusie voeren. Wanneer de flankerende regio's photobleached wordt het fluorescentiesignaal van deze zeer beweeglijke deel van receptoren opgesloten uit het centrale gebied en die binnen de regio verdund uit. De toename van de fluorescentie (AF) die gedurende de 'Flip' sequentie kan dus worden toegeschreven aan het inbrengen van SEP-GluA2 in de dendritische as. De lage pH was-en pH 7,4 + NH4Cl Daarnaast respectievelijk bevestigen dat de gemeten fluorescentie is afgeleid van het oppervlakeiwitten en onthullen het aandeel van de intracellulaire, afgezonderd eiwitten binnen het gemeten ROI.
In tegenstelling tot FRAP Deze werkwijze isolaten herstel door exocytose, waardoor een sterk verminderde mate van fluorescentieherstel in de photobleached regio. Om geen betrouwbare wiskundig model op heden is ontwikkeld om te passen en het herstel sporen geregistreerd met behulp van deze selectieve bleken techniek te analyseren. Het is echter mogelijk om het herstel spoor te voorzien van een mono-exponentiële herstel:
F (t) = A s - A 0 e (-t / τ)
Wanneer F (t) fluorescentie op tijdstip t, s A is steady state waarde A 0 is de verschuiving op tijdstip 0 τ de tijdconstante. Het herstel groei wordt bevestigd met een bepaald percentage om een evenwicht te bereiken, overeenkomend met een steady state tussen het inbrengen en diffusie. Belangrijk is dat de tijdkonstante uit deze eenNALYSE geeft niet de tijdconstante van exocytose en kan alleen worden gebruikt voor vergelijkende behandelingen voor een individuele eiwit.
Bovendien is het verwachte patroon van fluorescentie herstel waarschijnlijk acht te worden genomen in sub-domeinen langs de photobleached regio. Analyse van kleine ROI binnen photobleached segment kan essentieel zijn om exocytose "hotspot" tonen en is het raadzaam om delen van vergelijkbare lengten de variabiliteit van de dichtheid van deze vlekken bij het analyseren dendrieten de berekende snelheid beïnvloeden.
Figuur 3 toont een uitbreiding van dit protocol, waarbij de photobleach te groot gedeelte ROI met meerdere dendrieten in het gezichtsveld, gevolgd door selectief herhaalde bleken slechts een dendrieten. Deze benadering maakt traditionele 'FRAP' en 'FRAP-FLIP' data te verkrijgen in parallel. In dit voorbeeld zijn hippocampale neuronen geïnfecteerd met glutamaat receptor subeenheid van het kaïnaat klasse SEP-gelabeld GluK2. Prior om beeldvorming, werden neuronen-deze behandeld met cylcohexamide (2 uur op 200μg/ml), om de eiwitsynthese te blokkeren. Als zodanig, fluorescentie herstel in de respectieve gemeten ROI (Fig 3.B) toont het aandeel van herstel als gevolg van laterale diffusie en recycling in de standaard FRAP dendriet versus recycling alleen in de dendriet onderworpen aan de 'FRAP-FLIP' protocol. Het vergelijken van de AF waarden uit de FRAP versus 'FRAP-FLIP' herstel bochten, de relatieve bijdragen van recycling (AF rec = 11,05%) ten opzichte van laterale diffusie (AF diff = 9,35%) kan worden afgeleid. Anders figuur 2, het herstel niet een gelijkmatige state maar meer, de remming van de eiwitsynthese toont een tijdelijke toename en daaropvolgende afname in signaal, dat overeenkomt met uitputting van de beschikbare receptor pool (ongeveer 20% waargenomen daling gedurende de opname periode).
Figuur 1. Schematische voorstelling van de principes van FRAP vs FRAP-FLIP protocollen Dit schema illustreert de resultaten van een regelmatige FRAP versus protocol een 'FRAP-FLIP', met behulp van SEP-gelabeld receptoren. Fluorescentieherstel in traditionele FRAP wordt op links. Gemeten fluorescentieherstel in de centrale ROI wordt toegeschreven aan een combinatie van laterale diffusie f niet photobleached SEP-gelabeld receptoren buiten photobleached ROI en insertie van receptoren door recycling en / of de novo exocytose de dendritische as. Daarentegen, de repetitieve photobleached van de flankerende ROI geïllustreerd in uw rechterhand, laat zien hoe dit gewijzigde 'FRAP-FLIP' protocol stiltes herstel als gevolg van laterale diffusie. Als zodanig kan iedere gemeten fluorescentieherstel worden toegeschreven aan directe insertie in de ROI.
Figuur 2.Het inbrengen van SEP-GluA2 in de plasmamembraan van de dendritische as
A) Een hippocampal neuron uiten SEP-GluA2, selectief photobleached langs een regio van dendriet. Het schema illustreert de regio van dendriet die is afgebeeld, terwijl de bovenste linker paneel wijst op de ROI die zijn geselecteerd voor fotobleken. De grote witte doos gebied was ooit gebleekt, gevolgd door herhaalde bleken van de flankerende omkaderde gebieden, gemarkeerd met dubbele geleide blauwe pijlen. Dit paneel toont de dendriet voorafgaand aan fotobleken. De rode pijl geeft de gemeten ROI, te zien in een hoge vergrotingsfactor in de onderste panelen. B) toont de fluorescentie-intensiteit in de gemeten ROI gedurende het tijdsverloop van het experiment, uitgezet grijsniveau de ROI (niet genormaliseerd). De zwarte pijl markeert de meetpunt van de eerste photobleach en groene pijl duidt de start van de herhalende fotobleken. AF geeft aan ee toename van de fluorescentie waargenomen gedurende de herstelperiode, als gevolg van het inbrengen van SEP-GluA2 in de dendritische as. Na een lage pH en pH 7,4 + NH 4 Cl wasbeurten bevestigen dat de herstelde fluorescentie heeft betrekking op de oppervlakte uitgedrukt receptoren.
Figuur 3. Recycling en laterale diffusie vs Recycling van SEP-GluK2 op de dendritische as na cyclohexamide behandeling
A) Een hippocampal neuron uiten SEP-GluK2, selectief photobleached met parallelle FRAP en 'FRAP-FLIP' nuttige toepassing protocollen uitgevoerd langs verschillende dendritische ROI. Dit neuron werd onderworpen aan een voorbehandeling met cyclohexamide te eiwitsynthese (2 uur bij 200 pg / ml) blokkeert. Het schema illustreert de regio van dendriet die is afgebeeld, terwijl het linkerpaneel wijzen op de ROI die zijn geselecteerd voor fotobleken. The grote witte doos gebied was ooit gebleekt, gevolgd door herhaalde bleken van de flankerende omkaderde gebieden, van de lagere dendriet alleen gemarkeerd met een dubbele leiding blauwe pijlen. Dit paneel toont de dendrieten voorafgaand aan fotobleken. Rode pijlen wijzen op de ROI getoond in een sterke vergroting in B) ter illustratie van de fluorescentie herstel van de traditionele FRAP versus protocol de 'FRAP-FLIP'. Vergelijking van niveaus van fluorescentie-intensiteit in de late fase van herstel (derde panelen) tonen de bijdrage van laterale diffusie en recycling versus recycling alleen. C) toont de fluorescentie-intensiteit in de gemeten ROI gedurende het tijdsverloop van het experiment, uitgezet genormaliseerde intensiteit waarden. De zwarte pijl markeert de meetpunt van de eerste photobleach en groene pijl duidt de start van de herhalende fotobleken. AF rec geeft aan dat het van voorbijgaande aard herstel als gevolg van receptor recycling, bepaald door de FRAP / FLIP dendriet, terwijl AFdiff meet de bijdrage van laterale diffusie van SEP-GluK2 in de dendritische as in de 'FRAP slechts' ROI. De tijdelijke verhoging wordt gevolgd door geleidelijke daling signaal overeenkomt met de afdaling beschikbare receptoren als gevolg van cyclohexamide behandeling. De daaropvolgende lage pH en pH 7,4 + NH 4 Cl wasbeurten bevestigen dat de herstelde fluorescentie heeft betrekking op de oppervlakte uitgedrukt receptoren.
Discussion
We beschrijven een innovatieve strategie om de componenten van plasma membraaneiwit handel te visualiseren. De combinatoriële benadering van fotobleken technieken met SEP-gemerkte eiwit maakt selectief plasmamembraan inbrengen gebeurtenissen worden beoordeeld. Door voortdurend fotobleken het membraan eiwitten in flankerende gebieden tijdens het herstel, de 'FRAP-FLIP-methode beoordeelt de bijdrage van vesiculair transport naar fluorescentie herstel. Deze nieuwe aanpak maakt het mogelijk direct de opname van eiwit membraan inbrengen, waardoor zowel het aantal sub-compartimenten waarin het herstel wordt waargenomen en de amplitude van het herstel (AF) op de steady-state te bepalen. Verder vergelijking FRAP met en zonder FLIP kan het percentage herstel toe te schrijven aan laterale diffusie worden berekend.
Bovendien hetzelfde experiment kan gebieden niet photobleached dendrieten naast de flankerende regio's photobleachedkwalitatief beoordeeld tijdens het herstel; fluorescentie verlies waargenomen in deze regio's zal als gevolg van laterale diffusie van photobleached receptoren in deze niet-photobleached segmenten van de dendriet.
Deze selectieve fotobleken protocol kan worden gebruikt om verschillende cellulaire transport processen zoals kenmerkend excocytosis de plasmamembraan in bepaalde deelgebieden (bijvoorbeeld dendrieten of ruggen) of waarin de bijdrage van laterale diffusie vs aanbrengen door een parallel FRAP en "FRAP onderzoeken -Flip 'protocollen langs aangrenzende dendrieten (afb. 3).
Het is duidelijk dat, terwijl de specifieke richtlijnen zijn gepresenteerd, zal elk lab nodig optimaliseren van de beeldvorming parameters volgens specifieke monsters en apparatuur. Belangrijk alle oppervlakte receptoren in de ROI moeten photobleached, onafhankelijk van de z-as brandvlak zonder aanzienlijke beschadiging fototoxische of niet-specifieke fotobleken. Onsers dienen voorzichtigheid te betrachten bij een poging dit protocol in de cel soma, zoals het hoge percentage van relatief lage pH intracellulaire compartimenten meestal resulteert in een hoge achtergrond fluorescentie in deze regio's. En hoewel we hebben aangetoond hoe deze techniek kan worden toegepast op verschillende manieren, alvorens aan selectieve fotobleken experimenten op nieuwe SEP-gelabelde construeren raden dat een eerste karakterisering van de gemerkte receptor eerst uitgevoerd zoals beschreven door Ashby et al. 2.
Over het geheel genomen is deze methode een krachtige en veelzijdige aanpassing van de standaard FRAP-protocol, waardoor het inbrengen gebeurtenissen in plasmamembraan te worden geëvalueerd in de buurt van real-time.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar voor de Wellcome Trust en de ERC voor financiële steun. IMGG is een EMBO Fellow. KLH is een BBSRC gefinancierde promovendus. Wij danken Philip Rubin en Patrick Tidball voor technische en celkweek ondersteuning en dr. Andrew Doherty voor het onderhoud en hulp bij de microscopen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24mm glass coverslips | VWR international | 631-0161 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | 1mg/ml in borate buffer to coat coverslips |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 2% in neuronal plating and feeding medium |
| Penicillin Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 1% in neuronal plating and feeding medium |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 2mM / 0.8mM in plating/feeding medium |
| Horse Serum | Biosera | DH-291H | 10% in neuronal plating media only |
| pSIN ReP5 cloning vector | Invitrogen | K75001 | For Sindbis virus production |
| LSM510 META confocal system | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Image J Software | National Institutes of Health | open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/ |
References
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP. Trends Neurosci. 27, 257-261 (2004).
- Swaminathan, R., Hoang, C. P., Verkman, A. S. Photobleaching recovery and anisotropy decay of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion. Biophys. J. 72, 1900-1907 (1997).
- Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).
- Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. Fluorescent proteins for live cell imaging: opportunities, limitations, and challenges. IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).
- Ashby, M. C. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24, 5172-5176 (2004).
- Bouschet, T., Martin, S., Henley, J. M. Receptor-activity-modifying proteins are required for forward trafficking of the calcium-sensing receptor to the plasma membrane. J. Cell. Sci. 118, 4709-4720 (2005).
- Ashby, M. C., Maier, S. R., Nishimune, A., Henley, J. M. Lateral diffusion drives constitutive exchange of AMPA receptors at dendritic spines and is regulated by spine morphology. J. Neurosci. 26, 7046-7055 (2006).
- Martin, S., Bouschet, T., Jenkins, E. L., Nishimune, A., Henley, J. M. Bidirectional regulation of kainate receptor surface expression in hippocampal neurons. J. Biol. Chem. 283, 36435-36440 (2008).
- Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent membrane drift recruits AMPA receptors to dendritic spines. J. Biol. Chem. 284, 12491-12503 (2009).
