Summary
Denne rapport beskriver anvendelsen af levende celler billeddannelse og photobleach teknikker til bestemmelse af overfladen ekspression transportveje og handel kinetik eksogent udtrykt, pH-følsom GFP-mærkede proteiner til plasmamembranen af neuroner.
Abstract
Protocol
1. Cell Culture, viral transduktion, og proteinekspression
- Kultur høj densitet hippocampale neuroner fra embryonisk dag 18 (E18) rotteunger på poly-L-lysin-overtrukne dækglas for 14-25 dage in vitro (DIV).
- 6-24 timer forud for levende forsøgene transducere celler med attenueret Sindbis virus indeholdende membranprotein af interesse, mærket med super-ekliptika pHluorin (SEP).
- Tilføje pseudovirion-holdige medium direkte til dækglasset indeholdende 1 ml af konditionerede medier og returneres til kulturen inkubator. Titeren og tid for proteinekspression efter viral transduktion vil variere afhængigt af virus batch og bør bestemmes for hvert parti før påbegyndelse levende celle eksperimenter.
2. FRAP-FLIP Live-Cell Imaging
- Udstyr set-up
- Overfør dækglas til billeddannelse kammer i et Zeiss Axiovert LSM 510 META konfokal mikroskop.At minimere det elforbrug udsving i billedbehandling, sikre mikroskop er blevet tændt, med 100% laser output, i mindst 20 minutter før billeddannelse.
- Umiddelbart erstatte dyrkningsmediet med forvarmet (37 ° C) ekstracellulære optagelse opløsning indeholdende 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 15 mM glucose, 1,5 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 20-25 mM HEPES (pH indstillet til 7,4 med NaOH) og anbringes i kammeret på den forvarmede trin (37 ° C) af Zeiss Axiovert.
Sikre osmolariteten af den ekstracellulære optagelsen opløsningen indstilles til inden for 10 mOsM din dyrkningsmedium. Forudsat ingen signifikant fordampning forekommer under tidsforløbet for eksperimentet, er denne CO 2 uafhængige opløsning egnet til korte eksperimenter (<10 timer). Supplere med 1-2 mM natriumbicarbonat anbefales.
- Definition af de billeddannende capture parametre
- Første identificere en neuron, der udtrykker rekombinante proTein af interesse og bringe den i fokus.
- Med en 63X olie modsatte erhverve et billede af hele cellen ved hjælp af 488 nm laserlys excitation ved lav lasereffekt. For at minimere fotoblegning, skal du bruge en hurtig nominel hastighed (7-9) og lav pixel opløsning (512-512) at holde alt scanningshastighed <1 sekund.
- Vælg en del af dendritceller til billede og zoom til at fange en ramme, der indeholder ROI (~ 1,5-2,5 x optisk zoom). Hvor det er muligt, sikre synsfeltet indeholder flere processer, således at målinger fra reference dendritter kan fås, at afgøre, om non-specifik fotoblegning grund af købet sker.
- Juster filtre, pinhole, scan hastighed og detektor gevinst at sætte maksimal fluorescens fra minimal laser excitation, men med begrænset mætning. En stor pinhole diameter anbefales at maksimere foton samling (2 um er egnet til pigge og ternære dendritter). Detektoren gain skal være stærk nok til at detektere små fluorescens trin,sådan, at de allerførste billeder, før fotoblegning ikke overvinde 10% af mættede pixels.
- Gemme denne konfiguration kan anvendes til præ-/ post-blegemiddel og genopretning faser af eksperimentet.
- Næste definere photobleach regionerne; vælge en ROI til den indledende photobleach og flankerende regioner for den efterfølgende gentagne fotoblegning fase. Sørg for de flankerende regioner er brede nok til at forhindre inddrivelse ved diffusion mellem scanninger (typisk 5 um, se fig. 2).
- Juster blegemiddel parametre for både photobleach ROIs. Den indledende photobleach bør være hurtig (0,1-0,5 s) kræver mellem 1-5 gentagelser, afhængigt af optisk og volumenet af ROI. For de flankerende regioner, bør laser excitation justeres for at sikre kontinuerlig fotoblegning af de flankerende regioner, men uden fototoksisk beskadigelse.
- Som en retningslinje, bruger vi 100% laser excitation til den indledende photobleach, og 10% for gentagne fotoblegning phASE.
- Billede erhvervelse
- Når alle parametre er blevet indstillet, udføre FRAP-FLIP eksperiment som en variabel time-lapse billede sekvens, der er skitseret i de 4 blokke nedenfor:
BLOK 1: 3-10 pre-blegemiddel baseline billeder, ved lav laser strøm, ingen tidsforsinkelse
Blok 2: Photobleach den centrale ROI ved fuld lasereffekt, 1-5 gentagelser
Blok 3: 3-10 post-blegemiddel inddrivelse billeder
Blok 4: Gentagende photobleach af flankerende regioner på medium laser magt med billedoptagelse på en typisk tidsinterval på 1 - 5 sekunder, afhængigt af genfindingsprocenten for proteinet under undersøgelsen. - Endelig erstatte den ekstracellulære optagelse opløsning med optagelse opløsning bufret ved pH 6 indeholdende 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 15 mM glucose, 1,5 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 20-25 mM MES (for at standse fluorescens) eller suppleret med 50 mM NH4Cl indeholdende 90 mM NaCl, 5 mM KCI, 15 mM glucose, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mMMgCl2, 20-25 mM HEPES, pH 7,4 (for at afsløre de proteiner med lav pH intracellulære lagre), (se figur 2).
- Indsamle mindst 10 til 20 datasæt for hver rekombinant protein, således statistisk analyse. For at undgå bias resultater, sikrer imaging forhold opretholdes konsistent på tværs af gentagelser. Kassér alle datasæt, hvor ufuldstændige blegning, betydelig fokusplan afdrift eller fototoksisk celle skader er observeret.
- Når alle parametre er blevet indstillet, udføre FRAP-FLIP eksperiment som en variabel time-lapse billede sekvens, der er skitseret i de 4 blokke nedenfor:
3. Dataanalyse
- Åbne billeder med ImageJ software.
- Juster stakke at tage højde for små udsving i xy-planet, der kan have fundet sted i hele tidsserien ved hjælp af Stackreg plugin (Plugins → stackreg → transformation: stive krop →
). - Til billeder taget på Zeiss konfokal, skal du bruge LSM Værktøjskasse plugin til at rapportere den tid værdier som en tekstfil (plugins → LSM Toolbox → Vis LSM Toolbox →
→ ),og importere disse værdier i en analyse regneark. - At måle fluorescens udsving i løbet af FRAP-flip eksperiment opdele Lysbleget segment i individuelle pixel regioner (ca. 20pixels) og måle den gennemsnitlige fluorescens af disse ROI'er på hvert tidspunkt (F). Hvis du hurtigt vil opnå disse værdier ved at vælge flere ROIs bruge ImageJ "ROI Manager 'analyseværktøj (Analyze → Værktøjer → ROI Manager) og rapportere den gennemsnitlige fluorescens per pixel ved hjælp af' Plot Z-aksen profil 'kommando (Billede → Stakke → Plot Z -aksen profil).
- Gentage dette trin for at måle fluorescensintensiteten af en baggrund, ikke fluorescerende region.
- Normalisere fluorescensintensitet på hvert tidspunkt ved at subtrahere baggrunds-værdier for at fjerne eksperimentelle støj, og dividere alle værdier af gennemsnit for-bleget basislinie foranstaltning.
- Måle fluorescensintensiteten af hosliggende ikke-Lysbleget dendritter at vurdere niveauet af non-specifikfotoblegning under købet. Korrektion for ikke-specifik fotoblegning frarådes for fortolkning af 'FRAP-flip' data og bør så vidt muligt undgås.
- At beregne, hvis betydeligt opsving har fundet sted i en ROI, trækkes middelværdien af de sidste 5-10 foranstaltninger i den sekvens fra gennemsnittet af de første 5-10 foranstaltninger (Af) og bestemme den statistiske signifikans. Kategoriser genvinding og ikke-inddrive ROIs at vurdere mønstret for exocytose (dvs. exocytose hotspots eller rygsøjlen vs aksel recovery).
4. Repræsentative resultater
Resultatet af typiske FRAP-flip eksperiment er vist i fig. 2. Her er en neuron, der udtrykker GluA2 underenheden af AMPA-type glutamat-receptor, mærket med SEP blevet selektivt Lysbleget langs en region af dendritceller. Figur 2.A illustrerer området af dendritceller, som er afbildet og viser ROI'er, der er blevet udvalgt for fotoblegning (hvidt felt regioner). The stor hvid indrammede areal blev bleget en gang, efterfulgt af gentagne blegning af flankerende boxed regioner, der er fremhævet med dobbelt ledelse blå pile. Den røde pil viser den målte ROI, vist i stor forstørrelse i de nederste paneler.
Figur 2B viser fluorescensintensiteten i det målte ROI over tidsforløbet af forsøget. I dette eksempel blev et minut restitutionsperiode registreret efter den indledende photobleach at tillade ublegede receptorer til at indtaste ROI ved lateral diffusion. Når de flankerende regioner Lysbleget er fluorescens-signalet fra meget motile fraktion af receptorer okkluderet fra det centrale område, og dem, der inden for området fortyndes ud. Stigningen i fluorescens (bf) i løbet af "flip-sekvensen kan således tilskrives indsættelse af SEP-GluA2 i dendritiske akslen. Den lave pH vask og pH 7,4 + NH4Cl tilsætning henholdsvis bekræfte, at den målte fluorescens stammer fra overfladenproteiner og afslører andelen af intracellulære og afsondrede proteiner i den målte ROI.
I modsætning til FRAP, isolerer denne metode genvinding grund eksocytose, hvilket resulterer i en stærkt reduceret niveau af fluorescens opsving i Lysbleget region. Til dato er ingen pålidelig matematisk model er udviklet til at passe og analysere inddrivelse spor optaget med denne selektive blegning teknik. Det er imidlertid muligt at montere inddrivelse spor med en mono eksponentiel genopretning:
F (t) = A er - A 0 e (-t / τ)
Hvor f (t) er fluorescens på tidspunktet t A s ligevægtstilstand værdi A 0 er forskydningen ved tiden 0, τ er tidskonstanten. Opsvinget Væksten er fastgjort med en given hastighed til at nå en ligevægt, svarende til en steady state mellem indsætning og diffusion. Vigtigt, at tidskonstanten ekstraheret fra enNALYSE afspejler ikke tidskonstant eksocytose, og kan kun anvendes til sammenligningsformål behandlinger af en enkelt protein.
Desuden, det forventede mønster af fluorescens opsving er sandsynligvis vil blive observeret i sub-domæner langs Lysbleget regionen. Analyse af små ROI inden for en Lysbleget segment kan være afgørende for at afsløre exocytose "hotspots", og det er tilrådeligt at analysere regioner af sammenlignelige længder som variation af tætheden af disse pletter blandt dendritceller vil påvirke den beregnede sats.
Figur 3 viser en forlængelse af denne protokol, anvender photobleach til stor del ROI med flere dendritter i synsfeltet, efterfulgt af selektiv gentagne blegning af kun én dendritceller. Denne tilgang gør det muligt for traditionelle 'FRAP' og 'FRAP-flip' data, der skal erhverves parallelt. I dette eksempel er hippocampale neuroner blevet inficeret med en glutamat-receptor-subunit af kainat klassen, SEP-mærket GluK2. Prior for billeddannelse blev neuroner-disse behandles med cylcohexamide (2 timer ved 200μg/ml), for at blokere proteinsyntese. Som sådan, fluorescens opsving i de respektive målt ROIs (fig. 3.B) afslører at andelen af opsving på grund af lateral diffusion og genbrug i standard FRAP dendritceller versus genbrug alene i dendritceller udsat for 'FRAP-flip' protokol. Sammenligning af bf værdierne fra FRAP versus 'FRAP-flip' recovery kurver og de relative bidrag af genanvendelse (bf rec = 11,05%) versus laterale diffusion (bf diff = 9,35%) kan udledes. Modsætning figur 2, omfatter genindvinding ikke opretholde en steady state niveau, men som følge af inhibering af proteinsyntese, viser en forbigående stigning og efterfølgende fald i den signal, svarende til udtømning af den tilgængelige receptoren puljen (ca. 20% observeret nedgang i optagelsen periode).
Figur 1. Skematisk af hovedpersonerne i FRAP vs FRAP-flip protokoller Denne skematiske viser resultaterne af en regelmæssig FRAP versus en 'FRAP-flip "protokol, anvendelse af Sep-mærkede receptorer. Fluorescens opsving i traditionelle FRAP er vist på venstre side. Målte fluorescens opsving i den centrale ROI tilskrives en kombination af lateral diffusion f ikke Lysbleget SEP-mærkede receptorer uden for Lysbleget ROI og insertion af receptorer ved genbrug og / eller de novo eksocytose i den dendritiske akslen. Derimod gentagne Lysbleget af den flankerende ROIs illustreret i højre side viser, hvordan denne modificeret «FRAP-flip 'protokol tavshed opsving på grund af lateral diffusion. Som sådan kan en vilkårlig målt fluorescens opsving henføres til direkte indsættelse i ROI.
Figur 2.Insertion af SEP-GluA2 i plasmamembranen på dendritiske akslen
A) En hippocampale neuroner udtrykker SEP-GluA2 selektivt Lysbleget langs en region af dendritceller. Den skematiske illustrerer området af dendritceller, som er afbildet, medens den øvre venstre panel fremhæver ROI'er der er udvalgt til fotoblegning. Det store hvide indrammede areal blev bleget en gang, efterfulgt af gentagne blegning af flankerende boxed regioner, der er fremhævet med dobbelt ledelse blå pile. Dette panel viser dendritceller før fotoblegning. Den røde pil viser den målte ROI, vist i stor forstørrelse i de nederste paneler. B) viser fluorescensintensiteten i det målte ROI over tidsforløbet for eksperimentet afbildet som grå niveau i ROI (ikke normaliseret). Den sorte pil fremhæve tidspunkterne af den oprindelige photobleach og grønne pil indikerer begyndelsen af den repetitive fotoblegning. Df viser the stigning i fluorescens observeret i løbet af tilbagebetalingsperioden, på grund af indsættelse af SEP-GluA2 i dendritiske akslen. Efterfølgende lav pH og pH 7,4 + NH4Cl vaskninger bekræfte, at den genvundne fluorescens angår overfladen udtrykte receptorer.
Figur 3. Genbrug & lateral diffusion vs Genvinding af SEP-GluK2 på dendritiske akslen efter cyclohexamid behandling
A) En hippocampus neuron udtrykker SEP-GluK2, selektivt Lysbleget med parallel FRAP og 'FRAP-flip' recovery-protokoller, der udføres sammen separat dendritiske ROIs. Dette neuron blev underkastet forbehandling med cyclohexamid, at blokere proteinsyntese (2 timer ved 200 ug / ml). Den skematiske illustrerer området af dendritceller, som er afbildet, medens den venstre panel fremhæver ROI'er der er udvalgt til fotoblegning. The stor hvid indrammede areal blev bleget en gang, efterfulgt af gentagne blegning af flankerende boxed regioner, af den lavere dendritceller eneste, fremhævet med dobbelt hovede blå pile. Dette panel viser dendriterne før fotoblegning. Røde pile fremhæve ROIs vist i stor forstørrelse i B), der viser fluorescens opsving i traditionelle FRAP versus 'FRAP-flip' protokol. Sammenligninger af niveauer af fluorescens-intensiteten i den sene fase af genvinding (tredje panel) viser bidrag lateral diffusion og genvinding versus genvinding alene. C) viser fluorescensintensiteten i det målte ROI'er over tidsforløbet for eksperimentet afbildet som normaliseret intensitet værdier. Den sorte pil fremhæve tidspunkterne af den oprindelige photobleach og grønne pil indikerer begyndelsen af den repetitive fotoblegning. Bf rec angiver forbigående opsving på grund af receptor genbrug, bestemmes ud fra FRAP / FLIP dendritceller, mens dfdiff måler bidrag lateral diffusion af SEP-GluK2 i dendritiske akslen i 'FRAP kun' ROI. Den kortvarige stigning efterfulgt af en gradvis nedgang i signalet, der svarer til nedslidt af tilgængelige receptorer som et resultat af cyclohexamid behandling. Den efterfølgende lav pH og pH 7,4 + NH4Cl vaskninger bekræfte, at den genvundne fluorescens angår overfladen udtrykte receptorer.
Discussion
Vi beskriver en innovativ strategi til at visualisere de komponenter plasmamembranprotein menneskehandel. Den kombinatoriske fremgangsmåde fotoblegning teknikker med SEP-mærket protein muliggør selektiv plasmamembran indsættelse begivenheder, der skal vurderes. Ved løbende at fotoblegning de membranproteiner i flankerende regioner under genopretning, vurderer 'FRAP-flip' metode bidrag af vesikulær menneskehandel til fluorescens opsving. Denne nye fremgangsmåde giver mulighed for direkte optagelse af protein membraninsertion, så både antallet af sub-rum, hvis inddrivelsen er observeret, og amplituden af opsvinget (bf) ved steady state, der skal fastlægges. Yderligere sammenligning af FRAP med og uden FLIP tillader andelen af genvinding tilskrives lateral diffusion beregnes.
Desuden i det samme eksperiment, kan områder af ikke-Lysbleget dendritceller stødende op til de flankerende Lysbleget regioner værekvalitativt vurderet under opsvinget, fluorescens tab observeret i disse regioner vil være på grund af lateral diffusion af Lysbleget receptorer i disse ikke-Lysbleget segmenter af dendritceller.
Denne selektive fotoblegning protokol kan anvendes til at undersøge en række cellulære handel processer, såsom kendetegnende excocytosis i plasmamembranen i definerede underområde (f.eks dendritter eller udløberne) eller til vurdering bidrag lateral diffusion vs insertion ved udførelse parallelle FRAP og 'FRAP -flip "protokoller langs hosliggende dendritter (fig. 3).
Klart, at mens specifikke retningslinjer er blevet forelagt, vil hver Lab skal optimere de billeddannende parametre efter specifikke prøver og udstyr. Vigtigt, at alle overflade-receptorer i ROI skal være Lysbleget, uafhængigt af z-aksen brændplanet, men uden signifikant fototoksisk skade eller ikke-specifik fotoblegning. OsERS bør udvise forsigtighed, når de forsøger denne protokol på celle-Soma, som den høje andel af relativt lave pH intracellulære rum typisk resulterer i høj baggrundsfluorescens i disse regioner. Desuden, mens vi har vist, hvordan denne teknik kan anvendes på forskellige måder, før påbegyndelse af selektive fotoblegemidler eksperimenter på en ny september-mærket konstruere, anbefaler vi, at en første karakterisering af de mærkede receptorer først udføres, som beskrevet af Ashby et al 2.
Alt i alt, denne metode er en kraftfuld og alsidig tilpasning af standarden FRAP-protokollen, der muliggør indsættelse begivenheder i plasmamembranen, der skal evalueres i nær realtid.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Wellcome Trust og ERC for finansiel støtte. IMGG er en EMBO Fellow. KLH er et BBSRC-finansieret ph.d.-studerende. Vi takker Philip Rubin og Patrick Tidball for teknisk og cellekultur støtte og Dr. Andrew Doherty til vedligeholdelse og bistand med mikroskoper.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24mm glass coverslips | VWR international | 631-0161 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | 1mg/ml in borate buffer to coat coverslips |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 2% in neuronal plating and feeding medium |
| Penicillin Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 1% in neuronal plating and feeding medium |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 2mM / 0.8mM in plating/feeding medium |
| Horse Serum | Biosera | DH-291H | 10% in neuronal plating media only |
| pSIN ReP5 cloning vector | Invitrogen | K75001 | For Sindbis virus production |
| LSM510 META confocal system | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Image J Software | National Institutes of Health | open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/ |
References
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP. Trends Neurosci. 27, 257-261 (2004).
- Swaminathan, R., Hoang, C. P., Verkman, A. S. Photobleaching recovery and anisotropy decay of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion. Biophys. J. 72, 1900-1907 (1997).
- Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).
- Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. Fluorescent proteins for live cell imaging: opportunities, limitations, and challenges. IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).
- Ashby, M. C. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24, 5172-5176 (2004).
- Bouschet, T., Martin, S., Henley, J. M. Receptor-activity-modifying proteins are required for forward trafficking of the calcium-sensing receptor to the plasma membrane. J. Cell. Sci. 118, 4709-4720 (2005).
- Ashby, M. C., Maier, S. R., Nishimune, A., Henley, J. M. Lateral diffusion drives constitutive exchange of AMPA receptors at dendritic spines and is regulated by spine morphology. J. Neurosci. 26, 7046-7055 (2006).
- Martin, S., Bouschet, T., Jenkins, E. L., Nishimune, A., Henley, J. M. Bidirectional regulation of kainate receptor surface expression in hippocampal neurons. J. Biol. Chem. 283, 36435-36440 (2008).
- Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent membrane drift recruits AMPA receptors to dendritic spines. J. Biol. Chem. 284, 12491-12503 (2009).
