Summary
Att använda särskilda glycosidases att ta bort socker från glykoproteiner följt av SDS-PAGE är en värdefull metod för att upptäcka glycan ändringar på protein prover och är ett bra val för en första Glycobiology studier. Förändringar efter deglycosylation kan upptäckas så förskjutningar i gel rörlighet eller genom färgning med glycan känsliga reagenser.
Abstract
Glykosylering, tillägg av kovalent kopplade socker, är en stor post-translationell modifiering av proteiner som väsentligt kan påverka processer såsom cell adhesion, molekylär människohandel, clearance och signaltransduktion 1-4. I eukaryoter, den vanligaste glykosylering ändringar i Utsöndringsvägarna är tillägg på rester konsensus asparagin (N-linked), eller på serin eller treonin rester (O-linked) (Figur 1). Inledande av N-glycan syntes är starkt konservativa i eukaryoter, medan slutprodukterna kan variera mycket mellan olika arter, vävnader eller proteiner. Vissa glycans förblir oförändrade ("high mannos N-glykaner") eller bearbetas ytterligare i Golgi ("komplex N-glykaner"). Ökad mångfald är för O-glykaner, som börjar med ett gemensamt N-acetylgalaktosamin (GalNAc) rester i djurceller men skiljer sig i lägre organismer 1.
ENT "> En detaljerad analys av glykosylering av proteiner är ett område i sig själv och kräver omfattande resurser och kompetens för att utföra ordentligt. Men en mängd som finns enzymer som tar bort socker (glycosidases) gör det möjligt att ha en allmän uppfattning om glykosylering status . ett protein i en vanlig laboratoriemiljö Här illustrera användningen av glycosidases för analys av en modell glykoprotein:. rekombinant humant koriongonadotropin beta (hCGβ), som bär två N-glykaner och fyra O-glykaner 5 Tekniken kräver endast enkel instrumentering och typiska förbrukningsvaror och den kan lätt anpassas till analys av flera glykoprotein prover.Flera enzymer kan användas parallellt för att studera ett glykoprotein. PNGase F kan ta bort nästan alla typer av N-bundna glykaner 6,7. För O-glykaner, så finns inga tillgängliga enzym som kan klyva en intakt oligosackarid från the protein ryggrad. Istället är O-glykaner trimmas genom exoglycosidases till en kort kärna, som sedan lätt bort med O-Glycosidase. Den Protein Deglycosylation Mix innehåller PNGase F, O-Glycosidase, neuraminidas (sialidase), β1-4 galaktosidas och β-N-Acetylglucosaminidase. Det används för att samtidigt ta bort N-glykaner och några O-glykaner 8. Slutligen var Deglycosylation Blanda kompletteras med en blandning av andra exoglycosidases (α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, α1-3, 6 galaktosidas och β1-3 galaktosidas), som bidra till att undanröja annars resistenta monosackarider som kan finnas i vissa O-glykaner.
SDS-PAGE/Coomasie blått används för att visualisera olika protein migration före och efter glycosidase behandling. Dessutom visar en socker-specifik färgning metod, ProQ Emerald-300, minskade signal glykaner är Succéssively bort. Detta protokoll är utformad för analys av små mängder glykoprotein (0,5 till 2 mikrogram), även enzymatiska deglycosylation kan skalas upp för att rymma större mängder protein som behövs.
Protocol
1. Enzymatisk deglycosylation
- Använd PCR-rör för att minimera vatten förlust på grund av avdunstning. Etikett en uppsättning rör 1 till 7.
- Tina 10X G7 buffert, den 10X glykoprotein denaturering buffert, och 10% NP-40 och slå försiktigt rören för att blanda innehållet. Förvara i rumstemperatur.
- Placera enzymet som innehåller flaskor på is. Försök att minimera tina / frysa cykler.
- Lös upp innehållet i hCGβ injektionsflaska (150 mikrogram) i 600 l av dH 2 O och hålla på is.
- Bered 1 ml 1X G7 buffert genom att späda 10x lager i dH 2 O.
- Späd 0,5 ìl PNGase F i 25 l 1X G7 buffert och hålla på is.
- Förbered exoglycosidase mix (EG mix) genom att kombinera 2 l varje α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, β1-3 galaktosidas och α1-3, 6 galaktosidas.
- Ställ in PCR-rör som anges:
| Rör / prov # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| hCGβ (0.25mg/ml) | 9μl | 9μl | 9μl | 9μl | - | - | - |
| 10X Glykoprotein Denaturering buffert | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl |
| dH 2 O | - | - | - | - | 9μl | 9μl | 9μl |
- Cap rören, blanda försiktigt och placera den itermocykler, stäng locket och förstörs de proteiner genom att inkubera 10 minuter vid 94 ° C, följt av en 4 ° C håller (med hjälp av PCR-rör i en termocykler kraftigt hindrar avdunstning i liten volym prover).
- Ta bort rören från termocykler och centrifugera att ta bort synliga kondens.
- Lägg till följande reagenser som anges:
| Exempel # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 10% NP-40 | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl |
| 10X G7 Buffer | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2,5 & mu; L | 2.5μl |
| PNGase F 1:50 DIL. | - | 2μl | - | - | 2μl | - | - |
| Deglycosylation Mix | - | - | 2μl | 2μl | - | 2μl | 2μl |
| EG mix | - | - | - | 2μl | - | - | 2μl |
| dH 2 O | 10μl | 8μl | 8μl | 6μl | 8μl | 8μl | 6μl |
| Totalt reaktion vol. | 25 μ l | 25 μ l | 25 μ l | 25 μ l </ Td> | 25 μ l | 25 μ l | 25 μ l |
- Stäng PCR-rör med hjälp av nya lock (kassera den använda dem eftersom de inte passar ordentligt efter en inkubationstid cykel).
- Blanda rören genom att försiktigt knacka 4 gånger och sedan snurra innehållet ner.
- Placera rören i termocykler och inkubera vid 37 ° C under 4 timmar sedan svalna proverna till 4 ° C.
2. SDS-PAGE av deglycosylated prover
- Förbered 130 l färska 3X minska SDS buffert genom att lägga till 4 ìl 1.25m DTT.
- Tillsätt 12,5 l av det beredda 3X minska SDS buffert till varje prov.
- Stäng rören med nya lock och slå försiktigt rören att blanda.
- Inkubera rören i en termocykler vid 94 ° C i 5 minuter och kyl sedan till 4 ° C.
- Belastning 30 ìl av varje prov och 10 ìl av proteinet markören på en 10-20% Tris-Glycine gel. Spara resten av provet för delen 3,1. Ladda 10μl av ColorPlus Prestained Protein Marker.
- Elektrofores gelen vid 130 volt i rumstemperatur tills färgen är nära botten av gelen.
- När gelen har körts bort gelen från rollistan och placera den i en liten plastlåda med tillräckligt Coomasie blånad att täcka gelen.
- Färga gelen i 1 timme under försiktig omrörning.
- Tvätta gel tre gånger under 30 minuter i 50 ml Avfärga lösning.
- Spela in bilderna med hjälp av ett vitt ljus transilluminator eller scanner. Alternativt kan gelen torkas mellan ark av cellofan i en ram.
3. Pro-Q Emerald 300 för detektion av glykosylerade proteiner i SDS-PAGE geler
- Parallellt med gelen i 2,1), ladda resten av prover på en 10-20% Tris-Glycine gel. Load 10 & mu; L ColorPlus Prestained Protein Marker.
- Medan gelen körs upplösa Pro-Q Emerald reagens med DMF och förbereda beståndet Fix, tvätta och oxiderande lösningar för Pro-Q Emerald 300 fläcken efter den produkt som medföljer satsen.
- När elektrofores är klar, ta bort gelen från gjutna och placera den i en plastlåda.
- Fix gelen genom att tillsätta 100 ml Fix lösning och låter stå över natten i rumstemperatur under försiktig omrörning.
- Tvätta gelen med 100 ml tvättlösning i 10 till 20 minuter vid rumstemperatur med icke-judiska agitation. Upprepa tvätta med färska tvättlösning.
- Oxiderar kolhydrater genom inkubering av gelen under försiktig omrörning i 30 minuter i 25 ml Oxiderande lösning.
- Tvätta gelen som beskrivs i steg 3,5.
- Medan gel tvätt bered nya Pro-Q Emerald 300 fläcken genom att tillsätta 500 l av Pro-Q Emerald 300 reagenslösningen upplöst i steg från 3,2 till 25 mlfärgning buffert ingår i kitet.
- Fläck gelen genom att tillsätta 25 ml av fläcken som bereddes i steg 3,8 och inkuberas i mörker under försiktig omrörning för 90 till 120 minuter.
- Upprepa de två tvättar steg som beskrivs i steg 3,5.
- Spela in bilder med en UV-transilluminator vid 300 nm. Använd 80 kDa markör, som är märkt med Pro-Q Emerald Green, för att överlappa UV-bild till ett vitt ljus bild av gelen som visar prestained stege.
- Jämför bilder av Coomasie färgade gelen i steg 2,10 med Pro-Q Emerald färgade gel från steg 3,11.
4. Representativa resultat
De förändringar i proteinet migrationen efter enzymatisk deglycosylation visas i figur 2. Jämför det stickprov (panel A, körfält 1) med PNGase F behandling (borttagande av N-glykaner, körfält 2) och Deglycosylation Mix (PNGase F, plus endo-och exoglycosidases att ta bort O-glykaner, Lane 3). Inga ytterligare minskningi storlek ses efter uppslutning med ytterligare glycosidases (Lane 4). Förutom en förändring i massa band blir skarpare som glycans tas bort. Ett band som kör under 17 kDa markör (asterisk) representerar helt deglycosylated hCGβ polypeptid (MW: 16 kDa). Andra band kan bero på ofullständiga deglycosylation eller från flera oidentifierade proteiner som finns i hCGβ urvalet (se bana 1). Lanes 5 till 7 (kontroller) visar banden motsvarar glycosidases.
Den glykoprotein färgning av Smaragdgrön visas i panelen B. Detta reagens oxideras och fläckar alla glycans närvarande i en proteinmolekyl. Därför intensiteten i signalen minskar då hCGβ är enzymatiskt deglycosylated (Lane 1 till bana 4). De återstående signal i körfält 3 och 4 anger att det finns glycan motiv, som är resistenta mot den använda enzymer. De extra glycosidases används i Lane 4 bort ett par extra sockergrupperna: proteinet migration är densamma, menen liten minskning i intensitet i färgning kan ses. Resistenta socker beståndsdelarna var inte närvarande i alla protein arter: vissa band inte upptäcks av Emerald Green (frånvarande i UV bilden, inom parentes), vilket indikerar att de i stor utsträckning var deglycosylated. Ytterligare data stödjer slutsatsen att hCGβ heterogent är glykosylerat. Det lägre band på körfält 2 (pil) är svag på det smaragdgröna bilden, medan det övre bandet på körfält 2 är ljus, vilket tyder på att många glycans grupper som fortfarande finns kvar. Dessa uppgifter stödjer slutsatsen att rekombinanta hCGβ uttrycks i musceller innehåller flera glycoforms 9. Dessa olika glycoforms beror på den inneboende heterogenitet glykosylering där några polypeptider inte får en glycan i varje konsensus webbplats och / eller någon glycans utvidgas medan andra även på samma protein inte är det.
Figur 1.Typiska glykosyleringsmönster för utsöndras eller cellytan glykoproteiner.
Figur 2. SDS PAGE geler visar enzymatisk deglycosylation av hCGβ. Panelen A visar ett Coomasie blå färgning medan Panel B visar resultatet av Pro-Q Emerald 300 för visualisering av glykosylerat protein. Prov nummer: 1, hCGβ kontroll, 2, PNGase F matsmältningen, 3, Deglycosylation Blanda matsmältningen, 4, Deglycosylation Mix Plus exoglycosidases matsmältningen, prover från 5 till 7 är reagensen kontrollerna (O-Glyc, O-Glycosidase, GNA, β-N -Acetylglucosaminidase; Gal / Fuc, β1-3 galaktosidas, α1-3, 6 galaktosidas och α1-2 Fucosidase, GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase, Neu, Neuraminidasenzymets, PNGase, PNGase F)
Discussion
Metoden som beskrivs här med enzymatisk deglycosylation och SDS-PAGE kan ge värdefull information om glykosylering tillståndet av ett protein av intresse, medan glycan-specifika reagenser underlätta tolkningen av data. Detta protokoll är avsedd för inledande studier av protein glykosylering och det är särskilt lämpad för sekretoriska och glykoproteiner membran från däggdjursceller: de enzymer som valts i detta fall kommer särskilt att ta bort alla N-glykaner och eller N-glykaner plus och de vanligaste socker förlängning och utgör kärnan i O-glykaner. Glycosidases har den extra fördelen av att vara mild, jämfört med kemiska deglycosylation metoder, bevara integriteten av både socker och protein ryggrad.
För att belysa beläggning (som aminosyror är glykosylerat), omfattning av glykosylering, eller för att bestämma den fina struktur glykaner, mer sofistikerade tekniker som mass spektrometri, vätskekromatografi eller NMR behövs.
På grund av sin enkelhet, kan flera steg i detta protokoll justeras, ersättas, och / eller kombineras för att tillgodose olika experimentella behov. Men för att få resultat som klart kan tolkas är det viktigt att förstå dess styrka och begränsningar. Första, specificitet och renhet glycosidases är avgörande: endast välkarakteriserad enzymer testade för att vara fri från proteaser och andra förorenande verksamhet bör användas. Tyvärr finns det ingen standard enhet enzym definition för glycosidases, användaren bör bestämma lämplig ersättning enligt tillverkarens specifikationer. För det andra är ett noggrant val av upptäckt nödvändiga: a) Protein färgreagenser är användbara endast om deglycosylation resulterar i en betydande förändring i molekylmassa. Ett sådant tydligt resultat som visas här är inte alltid uppnås. I andra fall har vi sett onormalt miintegration efter deglycosylation (långt ifrån den förväntade molekylvikten, eller ännu långsammare migration). Detta fenomen är inte bra förstås, men det kan sägas att någon förändring i migration är bevis för att protein har deglycosylated. B) Socker detektion med antikroppar innebär unika utmaningar begränsar deras tillämplighet. Det har varit mycket svårt att skapa allmänna anti-glycan antikroppar, de är oftast riktas mot en komplex glycan mål, vilket begränsar deras användning. Dessutom har ett flertal monoklonala anti-glycan antikroppar visa oönskade korsreaktivitet 10. C) Lektiner (proteiner med inneboende socker affinitet) är väl lämpade för socker upptäckt, plus att de ger insikt om glycan struktur. Men inte alla av dem har en smal specificitet, och många är bara delvis kännetecknas (vilket innebär att de kunde ha okända tillhörighet). Som en följd av positiv lektin färgning ger indikation, inga bevis om förekomsten av ett GIven socker. d) Kemisk märkning kit (baserat på periodate oxidation av socker) är en lämplig metod för att färga alla glykoproteiner, och därmed väl lämpad att följa deglycosylation.
Vid bearbetning av ett okänt prov, är det en god idé att inkludera glykoprotein kontroller. Fetuin är en lättillgänglig N - och O-glykoprotein, koriongonadotropin (båda subenheter) är också ett bra val. Bovint serumalbumin (BSA) kan användas som en negativ kontroll. Det bör dock noteras att vissa icke glykosylerat protein reagerar lätt med Pro-Q Emerald 300, särskilt när de används vid höga koncentrationer. Icke glykosylerat molekylvikt standarder, såsom prestained protein som markör i detta protokoll, har fördelen av att visa vassa band. Bara av en slump är ett av dessa proteiner (80 kDa) reaktiv till Pro-Q Emerald 300. Därför kan användaren vill köra en stege glykoprotein standard istället, till exempel Candy-Cane från Invitrogen.
Slutligen är enkel i-gel detektion av nucleocytosolic glykoproteiner (som är modifierade med en O-GlcNAc) möjligt med hjälp av en monoklonal antikropp, längs β-N-Acetylglucosaminidase för specificitet kontroll 11. Beskrivningen av denna teknik ligger utanför ramen för denna artikel, men det bör nämnas som glycosidases är användbara verktyg för att studera många andra glykoproteiner och Glycoconjugates finns i celler. En omfattande behandling av alla kända former av glykosylering finns i den andra upplagan av "Essentials of Glycobiology", tillgänglig gratis online på NCBI Bookshelf (Bokhylla ID: NBK1908; PMID: 20.301.239) 12.
Disclosures
Författarna är anställda av New England Biolabs, som producerar många av de reagenser som används i denna artikel.
Acknowledgments
Don Comb
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human chorionic gonadotropin β | Sigma-Aldrich | C6572 | |
| PCR Tubes | VWR international | 20170-004 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 4359659 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704 | Supplied with buffers |
| Protein Deglycosylation Mix | New England Biolabs | P6039 | Supplied with buffers |
| α-N-Acetylglalactosaminidase | New England Biolabs | P0734 | Supplied with buffer |
| α1-2 Fucosidase | New England Biolabs | P0724 | Supplied with buffer |
| α1-3,6 Galactosidase | New England Biolabs | P0731 | Supplied with buffer |
| β1-3 Galactosidase | New England Biolabs | P0726 | Supplied with buffer |
| 10X Buffer G7 (500 mM Sodium Phosphate) | New England Biolabs | --- | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
| 10X Glycoprotein Denaturing Buffer (5% SDS, 400 mM DTT) | New England Biolabs | --- | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
| 10% NP-40 | New England Biolabs | --- | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
| 3X SDS loading buffer (187.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% SDS, 30% glycerol, 0.03% bromophenol blue) | New England Biolabs | B7703 | Supplied with 1.25M DTT |
| ColorPlus Prestained Protein Marker | New England Biolabs | P7709 | |
| 10-20% Tris-Glycine Multigel | Cosmo Bio Co. | DCB-414893 | |
| Cassette Electrophoresis Unit | Cosmo Bio Co. | DCB-303111 | |
| Electrophoresis Power Supply EPS 301 | GE Healthcare | 18-1130-01 | |
| Pro-Q Emerald 300 Glycoprotein Stain Kit | Invitrogen | P-21857 | |
| Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B0149 | |
| AlphaImager HP System | Cell Biosciences | 92-13823-00 |
References
- Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in Cellular Mechanisms of Health and Disease. Cell. 126, 855-867 (2006).
- Arnold, J. N., Wormald, M. R., Sim, R. B., Rudd, P. M., Dwek, R. A. The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins. Annual Review of Immunology. 25, 21-50 (2007).
- Mitra, N., Sinha, S., Ramya, T. N. C., Surolia, A. N-linked oligosaccharides as outfitters for glycoprotein folding, form and function. Trends in Biochemical Sciences. 31, 156-163 (2006).
- Carlsen, R. B., Bahl, O. P., Swaminathan, N. Human chorionic gonadotropin. Linear amino acid sequence of the beta subunit. Journal of Biological Chemistry. 248 (19), 6810-6812 (1973).
- Tarentino, A. L., Plummer, T. H. Deglycosylation of Asparagine-linked Glycans by PNGaseF. Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 5 (23), 163-170 (1993).
- Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1-3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199, 647-652 (1991).
- Koutsioulis, D., Landry, D., Guthrie, E. P. Novel endo-α-N-acetylgalactosaminidases with broader substrate specificity. Glycobiology. 18 (10), 799-805 (2008).
- Thakur, D. Profiling the glycoforms of the intact alpha subunit of recombinant human chorionic gonadotropin by high-resolution capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (2), 8900-8907 (2009).
- Park, S., Lee, M. R., Shin, I. Carbohydrate microarrays as powerful tools in studies of carbohydrate-mediated biological processes. Chemical Communications. 37, 4389-4399 (2008).
- Zachara, N. E., Vosseller, K., Hart, G. W. Detection and analysis of proteins modified by O-linked N-acetylglucosamine. Current Protocols in Molecular Biology. 95, 17-17 (2011).
- Varki, A. Essentials of Glycobiology. , 2nd Ed, Clod Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
