Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

Summary

Het gebruik van specifieke glycosidases om suikers te verwijderen uit glycoproteïnen, gevolgd door SDS-PAGE is een waardevolle methode om glycan wijzigingen op eiwit-samples te detecteren en is een goede keuze voor de eerste glycobiologie studies. Veranderingen na deglycosylatie kunnen worden gedetecteerd als verschuivingen in gel mobiliteit of door kleuring met glycan gevoelige reagentia.

Abstract

Glycosylatie, de toevoeging van covalent gebonden suikers, is een belangrijke post-translationele modificatie van eiwitten die een belangrijke invloed kan processen zoals celadhesie, moleculaire mensenhandel, klaring, en signaaltransductie ^1-4. In eukaryoten, de meest voorkomende glycosylering wijzigingen in de secretieroute zijn toevoegingen om tot consensus te asparagine residu's (N-linked), of op serine of threonine residu's (O-linked) (figuur 1). Inleiding van N-glycan synthese is sterk geconserveerd in eukaryoten, terwijl de eindproducten kan sterk variëren tussen verschillende soorten, weefsels, of eiwitten. Sommige glycanen blijven ongewijzigd ("high mannose N-glycanen") of worden verder verwerkt in de Golgi ("complexe N-glycanen"). Een grotere diversiteit is gevonden voor O-glycanen, die beginnen met een gemeenschappelijke N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residu in dierlijke cellen, maar verschillen in lagere organismen ^1.

ENT "> De gedetailleerde analyse van de glycosylering van eiwitten is een gebied op zich en vereist uitgebreide middelen en expertise om goed uit te voeren. Maar een verscheidenheid van beschikbare enzymen die te verwijderen suikers (glycosidasen) mogelijk maakt om een ​​algemeen idee van de glycosylering status van . een eiwit in een standaard laboratorium instelling Hier illustreren we het gebruik van glycosidases voor de analyse van een model glycoproteïne:. recombinant humaan choriongonadotrofine beta (hCGβ), die twee N-glycanen en vier O-glycanen ⁵ draagt ​​De techniek vereist slechts eenvoudige instrumentatie en typische verbruiksgoederen, en het kan gemakkelijk worden aangepast aan de analyse van veelvoudige glycoproteïne monsters.

Verschillende enzymen kan worden gebruikt in parallel met een glycoproteïne studie. PNGase F is in staat om vrijwel alle soorten van N-gekoppelde glycanen ^6,7 te verwijderen. Voor de O-glycanen, is er geen beschikbare enzym dat kan splijten een intact oligosaccharide van the eiwit ruggengraat. In plaats daarvan worden O-glycanen geknipt exoglycosidases om een korte kern, die dan gemakkelijk verwijderd worden door O-glycosidase. De Protein deglycosylatie Mix bevat PNGase F, O-glycosidase, neuraminidase (sialidase), β1-4 galactosidase, en β-N-Acetylglucosaminidase. Het wordt gebruikt om tegelijkertijd te verwijderen N-glycanen en enkele O-glycanen ^8. Ten slotte werd de deglycosylatie Mix aangevuld met een mengsel van andere exoglycosidases (α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 fucosidase, α1-3, 6 galactosidase, en β1-3 galactosidase), die helpen verwijderen anders resistent monosacchariden die aanwezig kunnen zijn in bepaalde O-glycanen.

SDS-PAGE/Coomasie blauw wordt gebruikt om verschillen in eiwit-migratie voor en na de behandeling glycosidase te visualiseren. Daarnaast, een suiker-specifieke kleuring methode, ProQ Emerald-300, toont verminderde signaal als glycanen worden successively verwijderd. Dit protocol is ontwikkeld voor de analyse van kleine hoeveelheden glycoproteïne (0,5 tot 2 ug), hoewel enzymatische deglycosylatie kan worden opgeschaald naar grotere hoeveelheden van de eiwitten als nodig is tegemoet te komen.

Protocol

1. Enzymatische deglycosylatie

1. Gebruik PCR-buisjes om waterverlies door verdamping te minimaliseren. Label een stel buisjes 1 tot 7.
2. Ontdooi de 10X G7 buffer, de 10X glycoproteïne denaturerende buffer, en de 10% NP-40 en zachte tik op de buizen naar de inhoud te mengen. Bewaren bij kamertemperatuur.
3. Plaats het enzym-bevattende flesjes op het ijs. Probeer de dooi / vries-cycli te minimaliseren.
4. Los de inhoud van de hCGβ flacon (150 ug) in 600 ul van dH ₂ O en blijf op ijs.
5. Bereid 1 ml 1X G7 buffer door verdunning van de 10X voorraad in dH ₂ O.
6. Verdun 0,5 pi van PNGase F in 25 ul 1X G7 buffer en blijf op ijs.
7. Bereid de mix exoglycosidase (EG mix) door het combineren van 2 pi elk van α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 fucosidase, β1-3 galactosidase, en α1-3, 6 galactosidase.
8. Stel PCR-buisjes, zoals aangegeven:

ak ">

Tube / monster #	1	2	3	4	5	6	7
hCGβ (0.25mg/ml)	9μl	9μl	9μl	9μl	-	-	-
10X Glycoproteïne denatureren Buffer	1μl	1μl	1μl	1μl	1μl	1μl	1μl
dH 2 O	-	-	-	-	9μl	9μl	9μl

9. Cap de buizen, meng en plaats in hetthermocycler, sluit het deksel en de denaturatie van de eiwitten door het incuberen van 10 minuten bij 94 ° C, gevolgd door een 4 ° C te houden (met behulp van PCR-buizen in een thermocycler veel voorkomt verdamping in kleine hoeveelheden monsters).
10. Haal de buizen van thermocycler en centrifuge om zichtbare condensatie te verwijderen.
11. Voeg de volgende reagentia zoals aangegeven:

Sample #	1	2	3	4	5	6	7
10% NP-40	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl
10X G7 Buffer	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5μl	2.5 & mu; L	2.5μl
PNGase F 01:50 dil.	-	2μl	-	-	2μl	-	-
Deglycosylatie Mix	-	-	2μl	2μl	-	2μl	2μl
EG mix	-	-	-	2μl	-	-	2μl
dH 2 O	10μl	8μl	8μl	6μl	8μl	8μl	6μl
Totale reactie vol.	25 μ l	25 μ l	25 μ l	25 μ l </ Td>	25 μ l	25 μ l	25 μ l

12. Sluit de PCR-buisjes met behulp van nieuwe caps (gooi het gebruikte die omdat ze niet goed passen na een incubatie-cyclus).
13. Meng de buizen door zachtjes tikken vier keer en dan draaien de inhoud naar beneden.
14. Plaats de buizen in de thermocycler en incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur, dan de monsters afkoelen tot 4 ° C.

2. SDS-PAGE van deglycosylated monsters

1. Bereid 130 ul vers 3X ​​reducerende SDS laadbuffer door het toevoegen van 4 ul van 1.25m DTT.
2. Voeg 12,5 ul van de voorbereide 3x reducerende SDS laadbuffer aan elk monster.
3. Sluit de buizen met nieuwe caps en tik de buizen om te mengen.
4. Incubeer de buizen in een thermocycler bij 94 ° C gedurende 5 minuten en daarna afkoelen tot 4 ° C.
5. Belasting 30 pi van elk monster en 10 ul van het eiwit marker op een 10-20% Tris-Glycine gel. Sla de rest van de steekproef voor deel 3.1. Belasting 10μl van ColorPlus Prestained Protein Marker.
6. Electrophorese de gel op 130 volt bij kamertemperatuur totdat de kleurstof voorkant is de buurt van de onderkant van de gel.
7. Wanneer de gel is voltooid, verwijdert u de gel uit de cast en plaats deze in een klein plastic doosje met genoeg Coomasie blauwe vlek om de gel te dekken.
8. Vlekken op de gel gedurende 1 uur onder zacht schudden.
9. Was de gel drie keer voor 30 minuten in 50 ml van destain oplossing.
10. Noteer de beelden met behulp van een wit licht transilluminator of scanner. Als alternatief kan de gel worden gedroogd tussen de bladen van cellofaan in een frame.

3. Pro-Q Emerald 300 voor de detectie van geglycosyleerde proteïnen in SDS-PAGE gels

1. Parallel met de gel in 2.1), laad de rest van de monsters op een 10-20% Tris-Glycine gel. Belasting 10 & mu; L van ColorPlus Prestained Protein Marker.
2. Terwijl de gel loopt tot ontbinding van de Pro-Q Emerald reagens met DMF en de voorbereiding van de voorraad Fix, wassen en oxiderende oplossingen voor de Pro-Q Emerald 300 vlek na de product handleiding die bij de kit.
3. Als de elektroforese is voltooid, verwijdert u de gel van de cast en plaats deze in een plastic doos.
4. Bevestig de gel door het toevoegen van 100 ml van de Fix-oplossing en het verlaten van het 's nachts bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
5. Was de gel met 100 ml van de Wash-oplossing voor 10 tot 20 minuten bij kamertemperatuur met niet-joodse agitatie. Herhaal de wassen met verse Wash-oplossing.
6. Oxideren van de koolhydraten door het incuberen van de gel met zacht schudden gedurende 30 minuten in 25 ml van oxiderende oplossing.
7. Was de gel zoals beschreven in stap 3.5.
8. Terwijl de gel is wassen voor te bereiden verse Pro-Q Emerald 300 vlek door het toevoegen van 500 pi van de Pro-Q Emerald 300 reagens oplossing opgelost in stap 3.2 tot 25 ml vanvlekken buffer die in de kit.
9. Vlekken op de gel door toevoeging van 25 ml van de vlek bereid in stap 3.8 en incubatie in het donker met zacht schudden voor 90 tot 120 minuten.
10. Herhaal de twee wasstappen beschreven in stap 3.5.
11. Noteer de beelden met een UV-transilluminator bij 300 nm. Gebruik maken van de 80 kDa marker, die is voorzien van Pro-Q Emerald Green, de UV-afbeelding overlappen om een ​​wit licht beeld van de gel met de prestained ladder.
12. Vergelijk de beelden van de Coomasie gekleurde gel in stap 2,10 met de Pro-Q Emerald gekleurde gel vanaf stap 3.11.

4. Representatieve resultaten

De veranderingen in eiwit migratie na enzymatische deglycosylatie zijn weergegeven in figuur 2. Vergelijk de te controleren steekproef (panel A, baan 1) met de PNGase F behandeling (verwijdering van N-glycanen, laan 2), en deglycosylatie Mix (PNGase F, plus endo-en exoglycosidases naar O-glycanen te verwijderen, baan 3). Zonder verdere verlagingin grootte wordt gezien na het verteren met extra glycosidasen (baan 4). Naast een verandering in de massa, bands worden scherper als glycans worden verwijderd. Een band die draait onder de 17 kDa marker (asterisk) vertegenwoordigt de volledig deglycosylated hCGβ polypeptide (MW: 16 kDa). Andere bands zou kunnen voortvloeien uit onvolledige deglycosylatie of van de verschillende niet-geïdentificeerde eiwitten die aanwezig zijn in de hCGβ steekproef (zie baan 1). Lanen 5 tot 7 (controles) tonen de bands die overeenkomt met de glycosidases.

De glycoproteïne vlekken door Emerald Green is te zien in paneel B. Dit reagens oxideert en vlekken alle glycanen aanwezig zijn in een eiwitmolecuul. Daarom is de intensiteit van het signaal af naarmate hCGβ is enzymatisch deglycosylated (baan 1 tot baan 4). De resterende signaal in lanen 3 en 4 wijzen op de aanwezigheid van glycan motieven, die bestand zijn tegen de gebruikte enzymen. De extra glycosidases gebruikt in laan 4 verwijderen van een paar extra suiker residuen: het eiwit migratie is hetzelfde, maareen lichte daling van de intensiteit in vlekken te zien. Bestand tegen suiker-groepen waren niet aanwezig in alle eiwitten soorten: sommige banden werden niet gedetecteerd door Emerald Green (afwezig in de UV-beeld, tussen haakjes), dat aangeeft dat ze uitgebreid deglycosylated. Aanvullende gegevens ondersteunen de conclusie dat hCGβ heterogeen is geglycosyleerd. De lagere band op rijstrook 2 (pijl) is zwak op het Emerald Green beeld, terwijl de bovenste band op rijstrook 2 is helder, wat aangeeft dat veel suikers groepen nog steeds aanwezig zijn. Deze gegevens ondersteunen de conclusie dat recombinant hCGβ uitgedrukt in muizen cellen bevat meerdere glycovormen ^9. Deze verschillende glycovormen zijn te wijten aan de inherente heterogeniteit van glycosylering waar een aantal polypeptiden ontvangen geen een glycan in elke consensus site en / of een aantal glycanen worden uitgebreid, terwijl anderen zelfs op hetzelfde eiwit dat niet zijn.

Figuur 1.Typische glycosylering patronen voor uitgescheiden of cel-oppervlakte glycoproteïnen.

Figuur 2. SDS-PAGE-gels met enzymatische deglycosylatie van hCGβ. Paneel A toont een Coomasie blauwe vlekken, terwijl Paneel B toont de resultaten van Pro-Q Emerald 300 voor visualisatie van geglycosyleerde eiwitten. Voorbeeld nummer: 1, hCGβ controle; 2, PNGase F spijsvertering, 3, deglycosylatie Mix spijsvertering, 4, deglycosylatie Mix plus exoglycosidases spijsvertering, monsters 5 tot 7 zijn het reagens controles (O-Glyc, O-glycosidase, GNA, β-N -Acetylglucosaminidase; Gal / Fuc, β1-3 galactosidase, α1-3, 6 galactosidase, en α1-2 fucosidase, GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase, Neu, Neuraminidase, PNGase; PNGase F)

Discussion

De methode die hier beschreven met behulp van enzymatische deglycosylatie en SDS-PAGE kan waardevolle informatie over de glycosylering toestand van een eiwit van interesse te bieden, terwijl de glycan-specifieke reagentia vergemakkelijken de interpretatie van de gegevens. Dit protocol is bedoeld voor de eerste studies van eiwitten glycosylering en het is bijzonder geschikt voor secretoire en membraan glycoproteïnen uit zoogdiercellen: de enzymen gekozen in dit geval wordt specifiek verwijdert alle N-glycanen, en of N-glycanen plus en de meest voorkomende suikers uitbreiding en vormen de kern van O-glycanen. Glycosidases hebben het extra voordeel dat ze mild, vergeleken met chemische deglycosylatie methoden, het behoud van de integriteit van zowel de suikers en eiwitten ruggengraat.

Om de bezettingsgraad (die aminozuren zijn geglycosyleerd), de mate van glycosylering, of om de fijne structuur van glycanen, meer geavanceerde technieken zoals m vast te stellen toe te lichtenkont spectrometrie, vloeibare chromatografie of NMR zijn vereist.

Door zijn eenvoud, kunnen meerdere stappen in dit protocol worden aangepast, vervangen en / of gecombineerd met verschillende experimentele behoeften tegemoet te komen. Echter, voor het verkrijgen van resultaten die duidelijk geïnterpreteerd kunnen worden is het belangrijk om te begrijpen zijn sterke punten en beperkingen. Ten eerste, de specificiteit en de zuiverheid van de glycosidases zijn cruciaal: alleen goed gekarakteriseerde enzymen getest om vrij te zijn van proteasen en andere vervuilende activiteiten moeten worden gebruikt. Helaas is er geen standaard definitie voor enzym-eenheid glycosidasen, moet de gebruiker de juiste vervanging te bepalen volgens de specificaties van de fabrikant. Ten tweede, een zorgvuldige keuze van detectie is nodig: a) eiwitkleuring reagentia zijn alleen handig als deglycosylatie resulteert in een belangrijke verschuiving in de moleculaire massa. Zo'n een duidelijk resultaat zoals hier te zien is niet altijd verkregen. In andere gevallen hebben we gezien abnormale miintegratie na deglycosylatie (ver van de voorspelde moleculair gewicht, of zelfs langzamer migratie). Dit fenomeen is niet goed begrepen, maar het kan gezegd worden dat iedere verandering in de migratie is het bewijs dat het eiwit is deglycosylated. B) Suiker detectie met antilichamen unieke uitdagingen beperking van hun toepasbaarheid presenteert. Het is erg moeilijk om algemene anti-glycan antilichamen te genereren, zijn ze meestal aangevoerd tegen een complex glycan doelstelling, die het gebruik ervan beperkt. Verder zijn er verschillende monoklonale anti-glycan antilichamen scherm ongewenste kruisreactiviteit ^10. C) Lectines (eiwitten met suiker intrinsieke affiniteit) zijn zeer geschikt voor suiker detectie, plus ze geven inzicht in glycan structuur. Echter, niet alle van hen hebben een hoge specificiteit, en velen zijn slechts gedeeltelijk gekarakteriseerd (wat betekent dat ze kunnen onbekende affiniteiten hebben). Als gevolg daarvan positief lectine kleuring geeft indicatie, geen bewijs, van de aanwezigheid van een given suiker. d) Chemische de etikettering kits (gebaseerd op perjodaat oxidatie van suikers) zijn de methode bij uitstek om alle glycoproteïnen vlek, en dus zeer geschikt voor deglycosylatie volgen.

Bij het verwerken van een onbekend monster, is het een goede gewoonte om glycoproteïne controles omvatten. Fetuin is een direct beschikbaar N - en O-glycoproteïne, choriongonadotrofine (beide subeenheden) is ook een goede keuze. Bovine serum albumine (BSA) kan gebruikt worden als een negatieve controle. Er dient echter te worden opgemerkt dat sommige niet-geglycosyleerde eiwitten lichtjes reageren met de Pro-Q Emerald 300, in het bijzonder bij gebruik bij hoge concentraties. Niet-geglycosyleerde moleculair gewicht normen, zoals de prestained eiwit marker gebruikt in dit protocol, hebben het voordeel van het weergeven van scherpe bands. Alleen door toeval is een van deze eiwitten (80 kDa) reactief naar Pro-Q Emerald 300. Daarom kan de gebruiker willen een glycoproteïne standaard ladder in plaats daarvan lopen, zoals Candy-Cane uit Invitrogen.

Ten slotte is eenvoudig in-gel detectie van nucleocytosolic glycoproteïnen (die gemodificeerd zijn met een enkele O-GlcNAc) is mogelijk met het gebruik van een monoklonaal antilichaam, langs de β-N-Acetylglucosaminidase voor de specificiteit controle ^11. De beschrijving van deze techniek is verder dan de bestek van dit artikel, maar het dient te worden vermeld als glycosidasen zijn nuttige instrumenten voor de studie van vele andere glycoproteïnen en glycoconjugaten aanwezig in de cellen. Een uitgebreide behandeling van alle bekende vormen van glycosylering kan worden gevonden in de tweede editie van de 'Essentials voor Glycobiologie ", gratis beschikbaar online op de NCBI Bookshelf (boekenplank ID: NBK1908; PMID: 20301239) ^12.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human chorionic gonadotropin β	Sigma-Aldrich	C6572
PCR Tubes	VWR international	20170-004
PCR Thermocycler	Applied Biosystems	4359659
PNGase F	New England Biolabs	P0704	Supplied with buffers
Protein Deglycosylation Mix	New England Biolabs	P6039	Supplied with buffers
α-N-Acetylglalactosaminidase	New England Biolabs	P0734	Supplied with buffer
α1-2 Fucosidase	New England Biolabs	P0724	Supplied with buffer
α1-3,6 Galactosidase	New England Biolabs	P0731	Supplied with buffer
β1-3 Galactosidase	New England Biolabs	P0726	Supplied with buffer
10X Buffer G7 (500 mM Sodium Phosphate)	New England Biolabs	---	Supplied with PNGaseF or Degl Mix
10X Glycoprotein Denaturing Buffer (5% SDS, 400 mM DTT)	New England Biolabs	---	Supplied with PNGaseF or Degl Mix
10% NP-40	New England Biolabs	---	Supplied with PNGaseF or Degl Mix
3X SDS loading buffer (187.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% SDS, 30% glycerol, 0.03% bromophenol blue)	New England Biolabs	B7703	Supplied with 1.25M DTT
ColorPlus Prestained Protein Marker	New England Biolabs	P7709
10-20% Tris-Glycine Multigel	Cosmo Bio Co.	DCB-414893
Cassette Electrophoresis Unit	Cosmo Bio Co.	DCB-303111
Electrophoresis Power Supply EPS 301	GE Healthcare	18-1130-01
Pro-Q Emerald 300 Glycoprotein Stain Kit	Invitrogen	P-21857
Brilliant Blue R	Sigma-Aldrich	B0149
AlphaImager HP System	Cell Biosciences	92-13823-00