Summary
SDS - PAGE에 의해 다음 glycoproteins에서 설탕을 제거하는 구체적인 glycosidases를 사용하면 단백질 시료에 glycan 변경을 탐지하는 유용한 방법이며 초기 glycobiology 연구를위한 좋은 선택입니다. deglycosylation 다음과 같은 변경 사항은 겔 이동성의 교대 또는 glycan 민감한 시약과 염색법에 의해 감지 수 있습니다.
Abstract
글리코 실화, covalently 연결된 당분의 추가는, 크게 이러한 세포 접착, 분자 거래, 통관 및 신호 전달 1-4로 프로세스에 영향을 미칠 수있는 단백질의 주요 포스트 translational 수정합니다. 또는 세린 또는 트레오닌 잔류물에 (O - 연결된) (그림 1) eukaryotes에서 분비 경로에서 가장 일반적인 글리코 실화의 수정 합의 아스파라긴의 잔류물 (N - 연결된)에 추가됩니다. 최종 제품은 다른 종, 티슈, 또는 단백질 중에서 크게 다를 수 있지만 N - glycan 합성의 개시는 매우, eukaryotes에 보존되어있다. 일부 glycans은 수정되지 않은 ( "높은 mannose N - glycans") 또는 추가 잠돌군 Zz ( "복잡한 N - glycans")로 처리됩니다 남아 있습니다. 광역의 다양성은 동물 세포의 일반적인 N - Acetylgalactosamine (GalNAc) 잔여물로 시작하지만, 낮은 생물 1 다를 O - glycans에 대한 발견이다.
엔트 "> 단백질의 글리코 실화의 상세한 분석은 그 자체에게로 필드이며 광범위한 자원과 전문성이 제대로 실행이 필요합니다. 삭제 당분 (glycosidases가)의 글리코 실화 상태에 대한 일반적인 생각을 가능하게 사용할 수 효소 그러나 다양한 . 표준 실험실 환경에서 단백질이 여기 모델 당단백질의 분석 glycosidases의 사용 설명 :. 2 N - glycans과 네 개의 O - glycans 5 운반 재조합 인간 chorionic gonadotropin 베타 (hCGβ) 기술은 단순이 필요합니다 계측 및 일반 소모품, 그리고 그것은 쉽게 여러 개의 당단백질 샘플의 분석을 적용할 수 있습니다.여러 효소는 당단백질 연구를 병렬로 사용할 수 있습니다. PNGase F는 N - 연결된 glycans 6,7의 거의 모든 종류 제거할 수 있습니다. O - glycans 들어, 사용 가능한 효소가 없다고 다니엘이 일부터 손상 올리 고당 수E 단백질 백본. 대신, O - glycans 그러면 쉽게 O - Glycosidase에 의해 제거되는 짧은 핵심에 exoglycosidases으로 손질하고 있습니다. 단백질 Deglycosylation 믹스는 PNGase Neuraminidase F, O - Glycosidase (sialidase), β1 - 4 갈락토 및 β - N - Acetylglucosaminidase이 포함되어 있습니다. 그것은 동시에 N - glycans와 일부 O - glycans 8 제거하는 데 사용됩니다. 마지막으로, Deglycosylation 믹스는에있는 수 달리 강한 단당류를 제거하는 데 도움 다른 exoglycosidases의 혼합물 (6 갈락토, α1 - 3, α1 - 2 Fucosidase, α - N - Acetylgalactosaminidase 및 β1 - 3 갈락토)로 보충했습니다 특정 O - glycans.
SDS-PAGE/Coomasie 파란색 glycosidase 처리 전후의 단백질 마이 그 레이션의 차이를 시각화하는 데 사용됩니다. glycans가 succe 있으므로 또한, 설탕 특정 얼룩 방법, ProQ 에메랄드 - 300는 신호 저하를 보여줍니다ssively 삭제되었습니다. 효소 deglycosylation가 필요에 따라 단백질의 큰 수량을 수용까지 확장할 수 있지만이 프로토콜은, 당단백질 (0.5-2 μg)의 소량의 분석을 위해 설계되었습니다.
Protocol
1. 효소 deglycosylation
- 증발에 의한 수분 손실을 최소화하기 위해 PCR 튜브를 사용하십시오. 튜브 1 7 라벨 한 세트.
- 10X G7 버퍼, 10X 당단백질 denaturing 버퍼, 그리고 10 % NP - 40을 녹여 부드럽게 내용을 혼합하기 위해 튜브를 누릅니다. 상온에서 보관.
- 얼음에 효소 함유 튜브를 삽입합니다. 해동 / 정지 사이클을 최소화하기 위해보십시오.
- DH 2 O 600 μl에 hCGβ 유리병 (150 μg)의 내용을 해산하고 얼음에 보관.
- DH 2 O.에서 10X 주식을 diluting하여 1X G7 버퍼 1 ML 준비
- 25 μl 1X G7 버퍼에 PNGase F 0.5 μl를 희석하여 얼음 계속.
- 2 μl α - N - Acetylgalactosaminidase 각, α1 - 2 Fucosidase, β1 - 3 갈락토 및 α1 - 3, 6 갈락토를 결합하여 exoglycosidase 믹스 (예 혼합) 준비합니다.
- 표시된로 PCR 튜브를 설정합니다 :
| 튜브 / 샘플 # | 일 | 이 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| hCGβ (0.25mg/ml) | 9μl | 9μl | 9μl | 9μl | - | - | - |
| 10X 당단백질는 버퍼 Denaturing | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl |
| DH 2 O | - | - | - | - | 9μl | 9μl | 9μl |
- 튜브를 대장,에 부드럽게 믹스 및 장소thermocycler는 뚜껑을 닫고 94시 10 분 잠복기하여 단백질을 변성 ° 4 ° C 개최 다음 C (thermocycler에서 PCR 튜브를 사용하여 크게 소량의 샘플의 증발을 방지).
- thermocycler에서 튜브를 제거하고 눈에 보이는 결로를 제거하는 원심 분리기.
- 표시된대로 다음과 같은 시약을 추가합니다 :
| 샘플 # | 일 | 이 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 10% NP - 40 | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl |
| 10X G7 버퍼 | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5 & 뮤; 리터 | 2.5μl |
| PNGase F 1시 50분 dil. | - | 2μl | - | - | 2μl | - | - |
| Deglycosylation 믹스 | - | - | 2μl | 2μl | - | 2μl | 2μl |
| EG 믹스 | - | - | - | 2μl | - | - | 2μl |
| DH 2 O | 10μl | 8μl | 8μl | 6μl | 8μl | 8μl | 6μl |
| 총 반응 권. | 25 μ의 리터 | 25 μ의 리터 | 25 μ의 리터 | 25 μ의 L </ TD> | 25 μ의 리터 | 25 μ의 리터 | 25 μ의 리터 |
- 새로운 모자를 (그들은 하나의 인큐베이션 사이클 후에 제대로 맞지 않기 때문에 사용하는 것들을 버리고)를 사용하여 PCR 튜브를 닫습니다.
- 부드럽게 4 번 감청 다음 내용을 아래 스핀하여 튜브를 섞는다.
- 4 시간 ° C가 다음 4 ° C.에 샘플을 냉각 37 thermocycler과 부화에 튜브를 삽입
2. deglycosylated 샘플 SDS - PAGE
- 1.25M DTT 4 μl를 추가하여 130 μl 신선한 배 감소 SDS 로딩 버퍼를 준비합니다.
- 각 샘플에 대한 준비가 배 감소 SDS 로딩 버퍼의 12.5 μl를 추가합니다.
- 새로운 모자와 튜브를 닫고 부드럽게 섞어 튜브를 누릅니다.
- 94에서 thermocycler에 튜브를 품어 ° C 4 ° C.에 냉각 후 5 분에 대한
- 각 시료 30 μl와 10~20% 트리스 - 글리신 젤의 단백질 마커의 10 μl를로드합니다. 일부 3.1 예제의 나머지 부분을 저장합니다. ColorPlus Prestained 단백질 마커의 10μl를로드합니다.
- 염료 앞에는 젤 하단 때까지 실온에서 130 볼트에서 젤 Electrophorese.
- 젤이 실행 완료되면, 캐스트에서 젤을 제거하고 충분한 Coomasie 파란 젤을 충당하기 위해 얼룩이있는 작은 플라스틱 상자에 넣습니다.
- 부드러운 교반 1 시간 동안 젤 얼룩.
- destain 솔루션의 50 ML 30 분 동안 겔 세 번 씻으십시오.
- 흰색 라이트 transilluminator 또는 스캐너를 사용하여 이미지를 기록합니다. 또는 젤은 프레임에 셀로판의 시트 사이에 건조하실 수 있습니다.
3. SDS - PAGE의 젤의 glycosylated 단백질의 검출을위한 프로 Q 에메랄드 300
- 2.1 겔)과 병행하여, 10-20% 트리스 - 글리신 젤에있는 샘플의 나머지를로드합니다. 로드 10과 뮤; ColorPlus Prestained 단백질 마커의 리터.
- 젤 DMF와 프로 - Q 에메랄드 시약을 분해 및 재고 수정, 워시를 준비 실행하고 프로 - Q 에메랄드 300 솔루션을 산화하는 동안 키트와 함께 제공된 제품 설명서를 다음과 얼룩.
- 전기 영동이 완료되면 캐스팅에서 젤을 제거하고 플라스틱 상자에 넣습니다.
- 수정 솔루션 100 ML을 추가하고 부드러운 동요와 함께 실온에서 하룻밤을 떠나는하여 겔을 수정.
- 이방인의 교반과 함께 상온에서 10-20분에 대한 씻으 솔루션의 100 ML로 젤을 씻으십시오. 신선한 씻어 솔루션 세척을 반복합니다.
- 솔루션을 산화의 25 ML 30 분 부드러운 동요로 젤을 잠복기로 탄수화물을 산화.
- 3.5 단계에서 설명한대로 젤 씻으십시오.
- 젤은 25 ML 단계 3.2에서 녹아 프로 - Q 에메랄드 300 시약 용액 500 μl를 추가하여 신선한 프로 - Q 에메랄드 300 얼룩을 준비 세척하는 동안키트에 제공된 버퍼를 염색법.
- 3.8 단계에서 준비한 얼룩의 25 ML을 추가하고 90-120분위한 부드러운 동요와 함께 어둠 속에서 잠복기로 젤 얼룩.
- 3.5 단계에서 설명한 두 세척 단계를 반복합니다.
- 300nm에서 UV transilluminator로 이미지를 기록합니다. prestained 사다리를 보여주는 젤의 하얀 빛을 그림에 UV 이미지를 겹쳐 프로 - Q 에메랄드 그린으로 표시되는 80 kDa의 마커를 사용합니다.
- 3.11 단계의 프로 - Q 에메랄드 묻은 젤로 단계 2.10에서 Coomasie 스테인드 젤의 이미지를 비교합니다.
4. 대표 결과
효소 단백질 deglycosylation 후 마이 그 레이션의 변화는 그림 2에 표시됩니다. PNGase의 F 처리 (N - glycans의 제거, 차선 2), 그리고 Deglycosylation 믹스 (; 플러스 엔도와 O - glycans를 제거하는 exoglycosidases, 레인 3 PNGase F)와 (과 패널, 레인 1) 컨트롤 샘플을 비교합니다. 더 이상 감소하지크기 추가 glycosidases (레인 4) 소화 후 볼 수 있습니다. glycans가 제거 등 대량의 변경 외에도 밴드가 선명된다. 17 kDa의 마커 (별표)에서 실행 밴드는 완전히 deglycosylated hCGβ polypeptide (: 16 kDa MW)를 나타냅니다. 다른 밴드는 불완전 deglycosylation 또는 hCGβ 샘플에있는 여러 미확인 단백질 (레인 1 참조)에서 파생 수도 있습니다. 레인 5-7가 (컨트롤) glycosidases에 해당하는 밴드를 보여줍니다.
에메랄드 그린으로 당단백질의 얼룩이 시약은 단백질 분자에있는 모든 glycans를 산화 및 얼룩 패널 B.에 표시됩니다. hCGβ이 효소 (차선 4 차선 1) deglycosylated대로 따라서 신호의 강도가 줄어 듭니다. 레인 3과 4에서 잔여 신호가 사용되는 효소에 강한 glycan 모티프의 존재를 나타냅니다. 단백질 마이 그 레이션은 동일하지만 : 레인 4에 사용되는 추가 glycosidases 몇 가지 추가 설탕 잔류물을 제거얼룩의 강도에서 약간의 감소를 볼 수 있습니다. 저항 설탕 moieties은 모든 단백질 종에 존재되지 않은 몇 가지 밴드는 그들이 광범위 deglycosylated되었습니다 나타내는 에메랄드 그린 (괄호에 UV 이미지 결석)에 의해 감지되지 않았습니다. 추가 데이터 hCGβ가 glycosylated heterogeneously되는 결론을 지원합니다. 레인 2 위 밴드가 많은 glycans 그룹이 아직 존재했음을 나타냅니다 밝은 상태에서 차선 2 (화살표)에 대한 낮은 밴드는 에메랄드 그린 이미지에 희미합니다. 이 데이터는 마우스 세포에서 표현 재조합 hCGβ 여러 glycoforms에게 9에 들어있는 결론을 지원합니다. 심지어 같은 단백질에 다른 수는 없지만 이러한 다양한 glycoforms 일부 polypeptides 각 합의 사이트 및 / 또는 일부 glycans에서 glycan을받지 못한 글리코 실화의 고유 이질로 인해 아르가 연장됩니다.
그림 1.분비 또는 세포 표면 glycoproteins에 대한 일반적인 글리코 실화 패턴.
hCGβ의 효소 deglycosylation을 보여주는 그림 2. SDS - PAGE의 젤. 패널 B가 glycosylated 단백질의 시각화를위한 프로 - Q 에메랄드 300의 결과를 보여주는 동안 패널 A는 Coomasie 파란 얼룩을 보여줍니다. 샘플 번호 : 1, hCGβ 제어, 2, PNGase F 소화, 3, Deglycosylation 믹스 소화, 4, Deglycosylation 믹스 플러스 exoglycosidases의 소화, 샘플 5-7이 (O - Glyc, O - Glycosidase 시약 컨트롤되며 GNA, β - N - Acetylglucosaminidase; 걸 / Fuc, β1 - 3 갈락토, α1 - 3, 6 갈락토 및 α1 - 2 Fucosidase, GalNA, α - N - Acetylglalactosaminidase, NEU, Neuraminidase, PNGase, PNGase의 F)
Discussion
glycan 특정 시약은 데이터의 해석을 용이하게하면서 방법은 관심의 단백질의 글리코 실화 상태에 대한 유용한 정보를 제공할 수있는 효소 deglycosylation와 SDS - PAGE를 사용하여 여기에 설명했다. 이 프로토콜은 단백질 글리코 실화의 초기 연구를위한 것입니다 그리고 그것은 특히 포유 동물 세포에서 분비 및 멤브레인 glycoproteins에 적합합니다 :이 경우에는 선택한 효소는 특히 모든 N - glycans을 제거하고 또는 N - glycans 플러스 및 가장 일반적인 설탕 것입니다 확장하고 O - glycans의 핵심을 형성. Glycosidases은 당분과 단백질 백본 모두의 무결성을 보존, 화학 deglycosylation 방법에 비해 온화한되는 추가 이점이 있습니다.
인원의 비율 (아미노산가 glycosylated있는), 글리코 실화의 정도, 또는 glycans의 미세 구조와 같은 m와 같은보다 정교한 기술을 결정을 명료하게하다하기엉덩이 분광법, 액체 크로마 토그래피 또는 NMR이 필요합니다.
간단 때문에,이 프로토콜의 여러 단계, 조정 대체, 그리고 / 또는 다양한 실험 요구를 수용하기 위해 결합 수 있습니다. 그러나 명확하게 해석될 수 결과를 얻기 위해서는 자사의 강점과 한계를 이해하는 것이 중요합니다. 첫째, glycosidases의 특이성과 순결이 중요한 : 프로 테아제 및 기타 오염 활동의 자유를 테스트에만 잘 특징 효소를 사용해야합니다. 불행하게도, glycosidases에 대한 표준 효소 단위 정의가 없으며 사용자가 제조 업체의 사양에 따라 적절한 대체를 결정한다. 둘째, 감지주의 선택이 필요합니다 :) 단백질 얼룩의 시약이 유용한 경우에만 분자 덩어리에 큰 변화에 deglycosylation 결과하십시오. 여기에 그림과 같은 명확한 결과는 항상 얻을 수 없습니다. 다른 경우에, 우리는 비정상적인 미를 보지 못했습니까deglycosylation 후 gration (멀리 예측 분자량, 심지어 느린 마이 그 레이션에서). 이러한 현상은 잘 이해 아니라, 그것은 이전에 조금이라도 변화가 단백질이 deglycosylated되었다는 증거입니다. B) 항체와 설탕 감지가 적용을 제한 독특한 과제를 제시라고 할 수 있습니다. 그것은 일반적인 안티 glycan 항체를 생성하는 것은 매우 어려운되었습니다, 그들은 대개 자신의 사용을 제한 복잡한 glycan 대상, 반대 사육하고 있습니다. 또한, 여러 단클론 항체 안티 - glycan이 원하지 않는 교차 반응 10을 표시합니다. C) Lectins이 (내장 설탕 선호도와 단백질) 잘 설탕 탐지에 적합합니다, 게다가, 그들은 glycan 구조에 대한 통찰력을 제공합니다. 그러나 모든 이들은 좁은 특이성을 가지고, 그리고 많은 사람들이 부분적으로만 (그들이 알 수없는 동질성을 가지고 있다고 의미) 특징입니다. 그 결과 긍정적인 렉틴의 얼룩은 GI의 존재의 표시가 아닌 증거를 제공으로이리와 설탕. D) 화학 라벨링 키트 (당분의 periodate 산화에 따라) 모든 glycoproteins을 얼룩이 선택의 방법이며, 따라서 잘 deglycosylation에 따라 적합.
알 수없는 시료를 처리하면 당단백질 컨트롤을 포함하는 것이 좋습니다. Fetuin는 즉시 사용할 수 N합니다 - O - 당단백질, chorionic gonadotropin은 (두 subunits)도 좋은 선택입니다. 소 혈청 알부민은 (BSA)은 대조군으로 사용할 수 있습니다. 그러나 일부 비 glycosylated 단백질이 높은 농도에서 사용 특히, 프로 - Q 에메랄드 300과 약간 반응 것을인지해야합니다. 이와 프로토콜에서 사용되는 prestained 단백질 마커와 같은 비 glycosylated 분자량 표준, 선명한 밴드를 표시하는 장점이 있습니다. 유일한 기회로 프로 - Q 에메랄드 300 반응이 단백질 (80 kDa) 중 하나입니다. 따라서, 사용자는 Invitroge에서 막대 사탕 지팡이로 대신 당단백질 표준 사다리를 실행할 수도 있습니다N.
마지막으로, nucleocytosolic glycoproteins (하나의 O - GlcNAc로 수정되는)의 간단한에서 - 겔 감지 특이성 제어 11 β - N - Acetylglucosaminidase 함께 단클론 항체의 사용이 가능합니다.이 방법의 설명이없는 것입니다 glycosidases은 세포에있는 많은 glycoproteins와 glycoconjugates 연구를위한 유용한 도구입니다이 문서의 범위,하지만 그것은 언급되어야합니다. 12 :; NCBI의 책장 (20301239 PMID NBK1908 책장의 ID)에서 구할 무료 온라인, 글리코 실화의 알려진 모든 형태의 포괄적인 치료는 "Glycobiology의 기초"의 두 번째 버전에서 찾을 수 있습니다.
Disclosures
저자는이 문서에서 사용되는 시약의 많은 생산 뉴잉글랜드 Biolabs로 고용됩니다.
Acknowledgments
돈 빗
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human chorionic gonadotropin β | Sigma-Aldrich | C6572 | |
| PCR Tubes | VWR international | 20170-004 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 4359659 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704 | Supplied with buffers |
| Protein Deglycosylation Mix | New England Biolabs | P6039 | Supplied with buffers |
| α-N-Acetylglalactosaminidase | New England Biolabs | P0734 | Supplied with buffer |
| α1-2 Fucosidase | New England Biolabs | P0724 | Supplied with buffer |
| α1-3,6 Galactosidase | New England Biolabs | P0731 | Supplied with buffer |
| β1-3 Galactosidase | New England Biolabs | P0726 | Supplied with buffer |
| 10X Buffer G7 (500 mM Sodium Phosphate) | New England Biolabs | --- | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
| 10X Glycoprotein Denaturing Buffer (5% SDS, 400 mM DTT) | New England Biolabs | --- | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
| 10% NP-40 | New England Biolabs | --- | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
| 3X SDS loading buffer (187.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% SDS, 30% glycerol, 0.03% bromophenol blue) | New England Biolabs | B7703 | Supplied with 1.25M DTT |
| ColorPlus Prestained Protein Marker | New England Biolabs | P7709 | |
| 10-20% Tris-Glycine Multigel | Cosmo Bio Co. | DCB-414893 | |
| Cassette Electrophoresis Unit | Cosmo Bio Co. | DCB-303111 | |
| Electrophoresis Power Supply EPS 301 | GE Healthcare | 18-1130-01 | |
| Pro-Q Emerald 300 Glycoprotein Stain Kit | Invitrogen | P-21857 | |
| Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B0149 | |
| AlphaImager HP System | Cell Biosciences | 92-13823-00 |
References
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