Summary
في هذا التقرير تفاصيل عن البروتوكول المستخدمة لقياس آثار مكافأة عالية من الدهون الغذائية في الفئران باستخدام تقدمية مهمة نسبة تكييف هواء فعال.
Abstract
الأطعمة التي هي غنية في الدهون والسكر تساهم بشكل ملحوظ في معدلات الإفراط في الأكل والمتصاعد من السمنة. لا يمكن للاستهلاك الأغذية قبولا إحداث أثر مكافأة يعزز عمل، نتيجة جمعيات ويعزز السلوك في المستقبل تستهدف الحصول على هذه الأطعمة. أدلة متزايدة على أن آثار مكافأة للطاقة الكثيفة الأطعمة تلعب دورا عميقة في الإفراط في تناول الطعام ووضع السمنة وزيادة الاهتمام في دراسة الجينات والجزيئات والدوائر العصبية التي تعدل المواد الغذائية 1،2 الثواب. يمكن دراسة تأثير مكافأة من المحفزات المختلفة عن طريق قياس الرغبة في العمل للحصول عليها، كما هو الحال في المهام تكييف هواء فعال 3. اكتسبت نماذج استثابي القياس مكافأة الغذائية والاستجابات السلوكية الطوعية التي وجهت في الحصول على الغذاء. مقياس استخداما للقوة المكافأة هو إجراء استثابي المعروفة باسم نسبة تقدمية (PR) الجدول الزمني لتعزيز موقفها. 4،5 طن في العلاقات العامةنسأل، ويلزم هذا الموضوع لجعل عددا متزايدا من ردود استثابي لكل مكافأة متتالية. أظهرت دراسة رائدة من Hodos (1961) أن عدد الاجابات للحصول على مكافأة الماضي، ووصف نقطة الإيقاف، بمثابة مؤشر على قوة مكافأة 4. في حين أن الإجراءات استثابي قياس التغييرات في معدل الاستجابة وحدها لا يمكن الفصل بين التغيرات في قوة مكافأة من إحداث تغييرات في قدرة الأداء، ونقطة توقف المستمدة من الجدول الزمني للعلاقات العامة هو مقياس جيد التحقق من آثار مكافأة من المواد الغذائية. وقد استخدمت هذه المهمة العلاقات العامة على نطاق واسع لتقييم تأثير مكافأة تعاطيها والغذاء في الفئران (على سبيل المثال، 6-8)، ولكن إلى حد أقل في الفئران 9. وقد زاد من الاستخدام المتزايد للفئران معدلة وراثيا والنظام الغذائي الناجم عن نماذج الماوس السمنة مطالب باتخاذ تدابير سلوكية من مكافأة الغذاء في الفئران. في هذه المادة ونحن بالتفصيل المواد والإجراءات التي تستخدم لتدريب الفئران على الاستجابة (رافعة الصحافة) للحصول على الدهون عاليةوكريات الغذائية عالية من السكر على جدول زمني للعلاقات العامة لتعزيز موقفها. نظهر أن عتبات استجابة نقطة بعد زيادة الحرمان من الطعام وانخفاض حاد مع إدارة هامشية من هرمون اللبتين قهمي والتحقق من صحتها وبالتالي استخدام هذا النموذج الغذائي استثابي في الفئران.
Protocol
* أهم الخطوات.
1. المعدات والبرمجيات
- ويتم التدريب والاختبار في غرف الماوس استثابي مجهزة مع اثنين من العتلات، خفيفة للغاية قابل للسحب 1 المتمركزة على جانبي وعاء طعام (انظر الجدول 1). يقع ضوء التحفيز فوق كل ذراع، وهناك ضوء منزل في الجزء العلوي من القفص. يقع موزع بيليه خارج الدائرة. وتقع كل غرفة داخل حجرة الصوت مخففة مع مروحة التهوية. وترتبط الغرف لأجهزة الكمبيوتر الشخصية مع البرمجيات الرابع MedPC عبر مجلس الوزراء "التحكم الذكية" واجهة.
ملاحظة: عندما خفيفة للغاية العتلات لا تتوفر فمن المستحسن أن يتم استخدام الأنف كزة باعتبارها استجابة استثابي للدراسات الماوس. ومع ذلك، مع كل من الخيارات المتاحة نقترح اختيار خفيفة للغاية العتلات كإجراء أكثر موثوقية من التحفيز نظرا إلى أن الأنف كزة الردود يمكن أن بأثار ه بواسطة استكشافية استنشاق.
- تتم كتابة هذه البرامج MedPC المستخدمة لتشغيل المهام استثابي في تدوين رمز Medstate التي يمكن للمستخدم معرفة بمساعدة دليل البرمجة المتوفرة. برمجة يوفر مرونة للمستخدم لتعديل القوانين القائمة أو إنشاء المعلمات تجريبي فريد. ويمكن الحصول على رموز معينة مجانا من شركاء المتوسطي "Medstate الترقيم مستودع" http://www.mednr.com . ويمكن شراء رموز إضافية من شركاء البحر المتوسط.
2. التأقلم الماوس وتقييد الغذاء
- عند وصول الفئران هي المجموعة يضم ما لا يقل عن 10 أيام للتأقلم على عكس 12 دورة الضوء / الظلام ساعة وقدم مع وصول libitum الإعلانية على مستوى تشاو والمياه. في حالتنا نحن نستخدم الكبار C57BL / 6 الفئران التي تم شراؤها من نهر تشارلز (سانت ثابت، QC). يتم تنفيذ جميع التلاعب الماوس والتجارب السلوكية خلال دورة الظلام. جميع الموالينوقد وافق cedures التي تنطوي على استخدام الحيوانات من قبل لجنة رعاية CRCHUM الحيوان.
- وبعد ذلك الفئران منفردة تسكينهم وفرضت قيودا على المواد الغذائية (70٪ من كمية غذائهم اليومي) حتى تصل إلى 90-95٪ خالية من تغذية. وزن الجسم من أجل تسهيل الحصول على رافعة الصحافة الاستجابة وقدمت الفئران حصتها اليومية من الغذاء في قفص المنزل بعد انتهاء الدورة. عند الوصول إلى 5-10٪ وفقدان الوزن، يتم ضبط الغذائية اليومية المخصصة لتحقيق الاستقرار في انخفاض وزن الجسم للفترة المتبقية من فترة التدريب. مرة واحدة ولقد حققت معايير اكتساب الفئران (أنظر أدناه) وضعوا مرة أخرى على الجدول الزمني للتغذية libitum الإعلانية. الفئران على استعادة فقدت وزن الجسم في حوالي 3-4 أيام.
- يتم التعامل مع الفئران في غرفة اختبار لمدة 3 أيام متتالية قبل انعقاد الدورة التدريبية الأولى. في اليوم قبل بدء التدريب يتم وضعها 10-15 عالية من الدهون وارتفاع السكر (HFHS) الكريات في قفص المنزل لمنع التأثير المحتمل للneophobia الطعام على performan استثابيم. نحن نستخدم HFHS 20 ملغ، خالية من الغبار، الغذاء الكريات دقة (14 ملغ تتوفر أيضا) التي تحتوي على سعرة حرارية (48.9٪) والدهون (سيرف بيو، Frenchtown، ونيو جيرسي).
3. استثابي التدريب
- في البداية يتم تدريب الفئران للضغط على رافعة على نسبة ثابتة (FR) -1 الجدول الزمني لتعزيز بموجبه الصحافة رافعة واحدة يتسبب في تسليم بيليه الغذائية إلى وعاء. يتم تعيين واحد فقط رافعة بأنه "نشط" (اثار تسليم مكافأة الغذاء)، ويقابله تخصيص العتلات اليمين واليسار بين الفئران. من المهم أن تضيف ما لا يقل عن مهلة 5 2 (TO) للجدول الزمني FR1 (FR1/TO-5)، وخلالها رافعة ضغط إضافية لا يؤدي في تسليم المواد الغذائية بيليه. هذه الفترة ليتيح الوقت للفئران لاستهلاك الغذاء بيليه، ويمكن استخدام عموميات وقتا أطول ولكن إذا كان يشعر مجرب من الضروري للنموذج الفئران. كل دورة تدريبية تستمر FR 1 ساعة أو عندما تم تسليم 50 الكريات.
- معايير اكتساب *: </ strong> والمعايير المستخدمة لتحديد اكتساب الغذاء حافظت استثابي الاستجابة ما يلي: (1) الحد الأدنى لعدد الاستجابات الفعالة والمكافآت المكتسبة، (2) على قدر من التمييز بين دعامتين النشطة وغير النشطة، و (3) بين الدورة أداء استقرار. وتعتبر الفئران واظهار التمييز ≥ 03:01 لذراع نشط مقابل نشط والحصول على مكافآت ≥ 20 في كل دورة على مدى ثلاث جلسات متتالية من أجل تحقيق معايير اكتساب 10. وقد لاحظنا أن الغالبية (~ 75٪) من C57BL6 الفئران تتطلب حوالي 7-10 أيام من التدريب لتحقيق معايير اكتساب. الفئران التي لا تصل إلى معايير اكتساب هذا الوقت الخضوع لمزيد من التدريب لعدة أيام إضافية 1 5-7. استثنينا من فئران التجارب (~ 5٪ من الحالات) عندما لا يكون هناك تقدم كل يوم 5 تدريب اضافي. من المهم أن نضع في اعتبارنا أن اكتساب استثابي ضعف قد يكون نتيجة لبعض التدخلات الدوائية والوراثية، وينبغي بالتالي أن وثقت. </ لى>
- بعد ثلاث جلسات متتالية للحصول على ≥ 20 الكريات، ويتم زيادة جدول زمني لFR5/TO-5 ثانية في 5 الذي يضغط رافعة نشطة تؤدي الى تسليم الغذاء بيليه. تدريب على الجدول الزمني للFR5 يستمر ثلاثة ايام.
- * ثم يتم تدريب الفئران في نسبة تقدمية (PR) الجدول الزمني لتعزيز موقفها. ويمكن حساب الجدول الزمني نسبة الاستجابة خلال اختبار للعلاقات العامة وفقا للريتشاردسون وروبرتس (1996) 11 باستخدام الصيغة التالية (مقربة إلى أقرب عدد صحيح):
= [5 ه (R * 0.2)] - 5
حيث R هو مساو لعدد من المواد الغذائية المكافآت حصل بالفعل زائد 1 (أي معزز المقبل). وهكذا، فإن عددا من الاستجابات المطلوبة لكسب مكافأة الغذاء يتبع الترتيب: 1، 2، 4، 6، 9، 12، 15، 20، 25، 32، 40، 50، 62، 77، 95 وهلم جرا. النسبة النهائية الانتهاء هو نقطة. - دورة العلاقات العامة تستمر مدة أقصاها 1 ساعة. فشل في الضغط على رافعة في أية نتائج دقيقة في الفترة من 10 ختام الدورة. ادائهاويعتبر مانس على الجدول الزمني للعلاقات العامة لتعزيز الاستقرار عندما يكون عدد من الجوائز حصل في الدورة 1 ساعة ينحرف عن 10٪ ≤ مدة لا تقل عن 3 أيام متتالية.
4. تقدمية اختبار والتحقق من صحة نسبة
- للتحقق من صحة الغذاء حافظت استثابي الاستجابة في مهمة العلاقات العامة، يمكن للمرء أن يقيم نقطة التلاعب التالية الاستجابة معروف لتعديل مكافأة الغذاء. اختبار سهل نسبيا للاضطلاع هو الحرمان من الطعام والتي سوف تزيد من حالة تحفيزية للفأرة على الغذاء، وبالتالي زيادة نقاط. يجب أولا أن الفئران التي يتم اختبارها في مهمة العلاقات العامة خلال فترة الرضاعة libitum الإعلانية حتى يتحقق الاستقرار، والأداء خط الأساس. تتم إزالة في اليوم التالي لمشاركة الطعام "خط الأساس" يوم من قفص المنزل ويتم اختبارها ثم الفئران في مهمة العلاقات العامة بعد 24 ساعة من بدء الصيام.
- نحن أيضا التحقيق في ما إذا كانت إدارة هامشية من هرمون اللبتين قهمي سوف يكون له تأثير عكسي على نقطةالعتبات. وقد حلت ليبتين (AF Parlow، هرمون الوطنية وبرنامج الببتيد، جوائز كبيرة) في برنامج تلفزيوني العقيمة. وأجري اختبار للعلاقات العامة في أعقاب حقنة الملكية الفكرية من برنامج تلفزيوني في يوم واحد ثم بعد حقن هرمون الليبتين يوم (5 ملغ / كلغ) التالية. تم حقن هرمون الليبتين ساعة واحدة قبل الاختبار العلاقات العامة. وتمت مقارنة نقاط التوقف باستخدام الاقتران اختبار t (GraphPad بريزم).
5. ممثل النتائج
عند اختبار قدرة الحرمان من الطعام لتعديل نقطة توقف عن الاستجابة على جدول زمني للعلاقات العامة من التعزيز، فإننا نتوقع تحقيق زيادة كبيرة في نقاط التوقف كما هو موضح في الشكل رقم 1. في هذه التجربة أنتجت فترة 24 ساعة من الحرمان من الطعام 1 ~ 3.6 أضعاف الزيادة في نقاط مقارنة مع تلك التي حصلنا عليها في دولة خالية من التغذية الأساسية مما يوحي أن الحرمان من الغذاء يزيد من الآثار مكافأة من المواد الغذائية. في مجال الإدارة، وعلى النقيض هامشية من هرمون اللبتين قهمي (5 مغ / كغ، IP) ساعة واحدة قبل روينبغي أن esting تخفيض نقطة الاستجابة كما هو مبين في الشكل 2.
الشكل 1. الصوم يزيد من الآثار مكافأة من المواد الغذائية. صيام 24 ساعة زيادة كبيرة في نقاط التوقف على نسبة تقدمية (PR) الجدول الزمني للتعزيز في الفئران (ن = 4). يعني ± SEM *؛ ف <.05.
الشكل 2. اللبتين يقلل مكافأة الغذاء في الفئران. انخفضت إدارة يبتين الطرفية (5 ملغ / كلغ) عتبات العلاقات العامة استجابة نقطة توقف في الفئران (ن = 4). يعني ± SEM؛ * P <0.05.
Discussion
المهام تكييف هواء فعال توفر وسيلة فعالة لتقييم التغييرات في خصائص تحفيزية من المواد الغذائية. الإجراءات التجريبية تفصيلا في الوقت الحاضر الفئران مادة التدريب تصريح إلى الصحافة رافعة للحصول على مكافآت الغذاء وستابلي الرد على جدول زمني للعلاقات العامة لتعزيز موقفها.
قياس كمية الغذاء المستهلكة لا يوفر قراءات نفس تدابير الاستجابة جهد المستندة منذ ليست كل العوامل التي تؤثر على الاستهلاك الغذائي تعدل الآثار مكافأة من المواد الغذائية. على سبيل المثال، استنزاف للاستعمال الجلوكوز من قبل الإدارة 2-deoxyglucose الطرفية في الفئران يزيد من كمية الطعام المستهلكة متاحة بحرية ولكن فشل في تغيير نقاط لكسر الارسال في مهمة العلاقات العامة للغذاء 12. ويمكن للعلاقات العامة نقطة توقف عن الاستجابة تعكس أيضا التغييرات في نوعية المكافآت الغذاء. على سبيل المثال، ترتبط بشكل إيجابي نقاط لكسر الارسال مع تركيز السكروز مما يدل على أن الدافع وراء الزيادة السكروز بطريقة يلي الطعم الحلو 8 12-14.
عند استخدام هذا البروتوكول من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن الحصول على الغذاء حافظت تتعزز بشكل كبير استثابي الاستجابة من قبل تدريبية منتظمة (كل أيام 1-2)، وزيادة حالة تحفيزية من الفأرة عن طريق تطبيق نظام تقييد المواد الغذائية. وبالإضافة إلى ذلك، وضمان أن الفئران تبدي مستقرة نسبيا عن الاستجابة على الجدول الزمني لتعزيز واحد قبل الانتقال الى جداول أكثر تعقيدا (على سبيل المثال، إلى FR1 FR5) هو المفتاح لتقليل أداء متغير خلال الاختبار. على الرغم من تطبيق هذه الخطوات، ليس من غير المألوف للحصول على بعض التباينخصوصا بين الفئران مختلفة. لهذا السبب، ينصح بشدة لاستخدام داخل المواضيع (التدابير المتكررة) تصميم عندما يكون ذلك ممكنا لإزالة التباين عبر الموضوع. ويمكن على الرغم من داخل موضوع الاختبار ليس من الممكن للتحقيق في التعديلات الجينية مستقر (أي خروج المغلوب في مقابل السيطرة على الفئران) يمكن استخدامها لدراسة تأثير المخدرات، أو آفات حاد التلاعب الجيني (على سبيل المثال، optogenetic).
السمنة والبدانة والأمراض ذات الصلة مشكلة متنامية والتي زادت على الحاجة الملحة لتحديد الجزيئات والممرات العصبية المعنية. تراكم الأدلة يسلط الضوء على الدور الهام الذي تؤديه دائرة الإثابة في الدماغ في شغف الغذائي، وزيادة السعرات الحرارية وزيادة الوزن. مهمة العلاقات العامة هي أداة قيمة لقياس أثر التلاعب العصبية أو وراثية أو الدوائية على آثار مكافأة من المواد الغذائية.
Disclosures
وترعى الإنتاج وحرية الوصول من هذه المادة عن طريق الفيديو من قبل شركة ميد، أسوشيتس
Acknowledgments
وقد أيد هذا المشروع من المنح المقدمة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (355881)، ومؤسسة الكندي للابتكار.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse operant chambers |  Med Associates, Inc. |
ENV-009A | Med Associates Inc. PO Box 319 St. Albans, Vermont 05478, USA Phone: (802) 527-2343 |
| 8 inputs/16 inputs Smart Control Connection Panel | Med Associates, Inc. |
SG-716B | |
| Ultra-light retractable mouse lever | Med Associates, Inc. |
ENV-312 | |
| Pellet Dispenser | Med Associates, Inc. |
ENV-203 | |
| House Light | Med Associates, Inc. |
ENV-215 | |
| Stimulus Light | Med Associates, Inc. |
ENV-221 | |
| Dust-free Precision 20 mg high-fat & high-sugar pellets | Bio-Serv | F-06649 | Bio-Serv One 8th Street, Suite 1 Frenchtown, NJ 08825, USA Phone: (800)-996-9908 |
| Table 1. Specific equipment and material | |||
References
- Fulton, S. Appetite and reward. Front. Neuroendocrinol. 31, 85-103 (2010).
- Zheng, H., Lenard, N. R., Shin, A. C., Berthoud, H. R. Appetite control and energy balance regulation in the modern world: reward-driven brain overrides repletion signals. International journal of Obesity. 33, Suppl 2. S8-S13 (2009).
- Skinner, B. F. The Behavior of Organisms: An Experimental Analysis. , Appelton-Century. (1938).
- Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134, 943-944 (1961).
- Hodos, W., Kalman, G. Effects of increment size and reinforcer volume on progressive ratio performance. J. Exp. Anal. Behav. 6, 387-392 (1963).
- Stafford, D., LeSage, M. G., Glowa, J. R. Progressive-ratio schedules of drug delivery in the analysis of drug self-administration: a review. Psychopharmacology. , 139-169 (1998).
- Glass, M. J., O'Hare, E., Cleary, J. P., Billington, C. J., Levine, A. S. The effect of naloxone on food-motivated behavior in the obese Zucker rat. Psychopharmacology (Berl). 141, 378-384 (1999).
- Brennan, K., Roberts, D. C., Anisman, H., Merali, Z. Individual differences in sucrose consumption in the rat: motivational and neurochemical correlates of hedonia. Psychopharmacology (Berl). 157, 269-276 (2001).
- Vaughan, C., Moore, M., Haskell-Luevano, C., Rowland, N. E. Food motivated behavior of melanocortin-4 receptor knockout mice under a progressive ratio schedule. Peptides. 27, 2829-2835 (2006).
- Haluk, D. M., Wickman, K. Evaluation of study design variables and their impact on food-maintained operant responding in mice. Behav. Brain Res. 207, 394-401 (2010).
- Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J. Neurosci. Methods. 66, 1-11 (1996).
- Jewett, D. C., Cleary, J., Levine, A. S., Schaal, D. W., Thompson, T. Effects of neuropeptide Y, insulin, 2-deoxyglucose, and food deprivation on food-motivated behavior. Psychopharmacology (Berl). 120, 267-271 (1995).
- Fulton, S., Woodside, B., Shizgal, P. Modulation of brain reward circuitry by leptin. Science. 287, 125-128 (2000).
- Figlewicz, D. P., Bennett, J. L., Naleid, A. M., Davis, C., Grimm, J. W. Intraventricular insulin and leptin decrease sucrose self-administration in rats. Physiol. Behav. 89, 611-616 (2006).
