Summary
В настоящем докладе подробно протокол используется для измерения полезный эффект с высоким содержанием жиров пищи в мышей с использованием прогрессивных соотношение оперантного задача кондиционирования.
Abstract
Продукты, которые богаты содержанием жиров и сахара в значительной мере способствовать переедание и наращивание темпов ожирения. Потребление продуктов приемлемым может произвести полезный эффект, который усиливает действие-результат ассоциации и укрепляет будущее поведение, направленное на получение этих продуктов. Появляется все больше данных о том, что награждение последствия высококалорийных продуктов питания глубокой играть роль в перееданию и развитию ожирения имеет повышенный интерес к изучению генов, молекул и нейронных цепей, которые модулируют 1,2 пищевого вознаграждения. Награждение воздействие различных раздражителей может быть изучен путем измерения желание работать, чтобы получить их, например, в задачах оперантного кондиционирования 3. Оперантное моделей пищи мера вознаграждения приобрели и добровольных поведенческие реакции, которые направлены на добывание пищи. Обычно используется мера вознаграждения сила оперантного процедура, известная как прогрессивные отношения (PR) график подкрепления. 4,5 В PR-тспросить, тема требует, чтобы все большее число оперантного ответов для каждого последующего вознаграждения. Новаторское исследование Ходос (1961) показали, что количество ответов сделано для получения последней награды, называется останова, служит показателем силы вознаграждение 4. В то время как оперантное процедур, которые измеряют изменения в ответ ставка сама по себе не может отделить изменения в награду силу с изменениями работоспособность, точки останова, полученные от PR график хорошо проверены меры награждения эффект пищи. Задача PR широко используется для оценки воздействия награждения наркотики и пища у крыс (например, 6-8), но в меньшей степени у мышей 9. Более широкое использование генетически модифицированных мышей и диеты вызванных ожирением модели мыши повышенные требования к поведенческим меры пищевого вознаграждения у мышей. В настоящей статье мы подробно материалы и процедуры, используемые для обучения мышей реагировать (рычаг-пресс) для с высоким содержанием жираи с высоким содержанием сахара пищу гранулы по расписанию PR подкрепления. Мы показали, что порог прерывания ответ увеличения после острого лишение пищи и уменьшается с периферической администрации анорексией гормона лептина и тем самым проверить использование этой пищевой оперантного парадигмы у мышей.
Protocol
* Наиболее важные шаги.
1. Оборудование и программное обеспечение
- Обучение и тестирование проводится в мышь оперантного камеры оснащены двумя ультра-легкий, выдвижной рычаги 1 расположены по обе стороны от пищи сосуд (см. Таблицу 1). Световой раздражитель находится выше каждый рычаг и есть дом светом в верхней части клетки. Дозатор пеллет находится за пределами камеры. Каждая камера размещается внутри звукового ослабления кабина с вентиляционными вентилятора. Камеры подключены к ПК с программным обеспечением MedPC IV с помощью "Smart Control" интерфейс кабинета.
Примечание: При сверхлегкие рычаги не доступны, рекомендуется носом тыкают быть использован в качестве ответа на оперантное мыши исследований. Однако, как варианты мы предлагаем выбор из сверхлегких рычаги, как более надежные меры мотивации, учитывая, что нос совать ответов может бэлектронной вызвано поисковых нюхать.
- MedPC программ, используемых для запуска оперантного задачи записаны в Medstate обозначение код, который пользователь может узнать с помощью руководство по программированию при условии. Программирование обеспечивает гибкость для пользователя, чтобы изменить существующий код или создать уникальные экспериментальные параметры. Некоторые коды могут быть получены бесплатно от Med Associates "Medstate обозначения репозитория" http://www.mednr.com . Дополнительные коды можно приобрести Med Associates.
2. Acclimation мыши и продовольствия ограничения
- По прибытии мышей группы размещаются по крайней мере 10 дней, чтобы акклиматизироваться к обратному 12 ч свет / темнота цикл и обеспечивается вволю доступ к стандартным кормом и водой. В нашем случае мы используем взрослых мышей C57BL / 6 приобрести Charles River (Санкт-постоянная, QC). Все манипуляции мышью и поведенческие эксперименты проводятся в темное время цикла. Все пропроцедур, связанных с использованием животных были одобрены Комитетом по уходу животных CRCHUM.
- Мыши в дальнейшем однократно размещалась и пищевых ограничений (70% от их ежедневного рациона питания), пока они не достигают 90-95% свободного кормления массы тела для того, чтобы облегчить приобретение рычаг-пресс отвечать. Мыши были предоставлены их суточной нормы пищи в клетке дома после окончания сессии. Дойдя до 5-10% потери веса, ежедневная пища выделено регулируется для стабилизации веса нижней части тела в течение оставшегося периода обучения. Как только мыши достигли приобретение критериев (см. ниже), все они помещены обратно на питание график без ограничений. Мыши вернуть утраченные массы тела в 3-4 дней.
- Мыши обрабатываются в испытательной камере в течение 3 дней до первой тренировки. За день до начала тренировок 10-15 с высоким содержанием жиров и высоким содержанием сахара (HFHS) гранулы помещают в клетку домой, чтобы предотвратить возможное влияние пищи на неофобией оперантного performanсе. Мы используем 20 мг HFHS, пыли, гранул точность питания (14 мг также доступны), содержащий 48,9% ккал в виде жира (Bio Serv, Frenchtown, NJ).
3. Оперантное обучение
- Мыши изначально обучены нажимать на рычаг на фиксированный коэффициент (FR) -1 укрепление график которой одним нажатием рычага вызывает поставки шарик пищи для сосуда. Только один рычаг обозначен как "активный" (запуск доставки продовольствия вознаграждение) и выделение правого и левого рычага уравновешен между мышами. Важно добавить, по крайней мере 5 секунд тайм-аута (ТО) с графиком FR1 (FR1/TO-5), в ходе которого дополнительный рычаг, нажатие не приведет к доставке пищи гранул. Это период дает время для мыши потребляют пищу гранулы, однако больше времени выходы могут быть использованы, если экспериментатор считает это необходимым для их мышиной модели. Каждая сессия FR обучение длится 1 час, когда 50 гранулы были доставлены.
- * Приобретение критериям: </ STRONG> Критерии, используемые для определения приобретения пищевых поддерживается оперантного ответ включает в себя: (1), минимальное количество активных ответных мер и награды получил, (2) мера различия между активными и неактивными рычаги, и (3) между-сессии стабильность работы. Мыши выставке дискриминации ≥ 3:1 активной по сравнению с неактивными рычаг и получения ≥ 20 наград за одну сессию в течение трех последовательных сессиях рассматриваются достижения приобретение критериев 10. Мы заметили, что большинство (~ 75%) C57BL6 мышей потребует около 7-10 дней обучения для достижения приобретение критериям. Мыши, которые не доходят до приобретения критерии к этому времени пройти курс подготовки для дополнительных 5-7 дней. Мы исключаем мышей от тестирования (~ 5% случаев), когда нет прогресса, дополнительный 5-й день обучения. Важно помнить, что нарушение оперантного приобретение может быть результатом некоторых фармакологических и генетических вмешательств и поэтому должны быть документированы. </ LI>
- После трех последовательных сессиях получения ≥ 20 гранул, график увеличен до FR5/TO-5 секунд, в которых 5 активных прессы рычаг вызвать поставки пищевых гранул. Обучение по расписанию FR5 длится три дня.
- * Мышей затем стажировался в прогрессивном отношения (PR) график подкрепления. График ответ отношения во время тестирования PR может быть рассчитана в соответствии с Ричардсоном и Робертса (1996) 11 по следующей формуле (с округлением до ближайшего целого числа):
= [5 е (R * 0,2)] - 5
где R равна количеству пищи награды уже заработал плюс 1 (то есть, следующий подкрепления). Таким образом, количество ответов необходимо, чтобы заработать награду пищи следить за тем: 1, 2, 4, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 32, 40, 50, 62, 77, 95 и так далее. Окончательное соотношение завершено является останова. - На заседании PR длится максимум 1 час. Невыполнение нажмите на рычаг в любой период 10 мин приводит к прекращению работы сессии. PerforОсвоив по расписанию PR арматуры считается стабильным, если число наград, полученных в 1 час отклоняется сессии ≤ 10% в течение 3 дней подряд.
4. Прогрессивная тестирование и проверка соотношения
- Для проверки пищевых поддерживается оперантного ответ в задаче PR, можно оценить останова ответа следующие манипуляции известно модулировать питание вознаграждение. Относительно простой тест, чтобы проводить это лишение пищи, которая увеличит мотивационные состояния мыши на продукты питания и тем самым увеличить останова. Мыши сначала должны быть испытаны в задачи PR в период кормления объявления без ограничений, пока стабильна, базовые характеристики достигаются. На следующий день после последнего "базового" день пищи удаляются из дома клетки мышей и затем протестирован в задачи PR 24 часов после начала поста.
- Мы также исследовали ли периферической администрации анорексией гормона лептина будет иметь противоположный эффект прерыванияпороги. Лептин (AF Parlow, Национальный гормонов и пептидов программы, NIDDK) растворяли в стерильном PBS. PR-тестирование было проведено после введения IP PBS в течение одного дня, а затем после инъекции лептина (5 мг / кг) на следующий день. Лептин был введен один час до тестирования PR. Прерывания сравнивали с помощью парного Т-теста (GraphPad Prism).
5. Представитель Результаты
При тестировании способности лишение пищи, чтобы модулировать останова отвечать на график PR подкрепления, мы ожидаем значительного увеличения точек останова, как показано на рисунке 1. В этом эксперименте 24 ч период лишения пищи производится ~ 3,6-кратное увеличение точек останова по сравнению с результатами, полученными в свободном кормлении исходного состояния тем самым предполагая, что лишение пищи увеличивает полезный эффект пищи. В отличие от периферических администрации анорексией гормона лептина (5 мг / кг, IP) за один час до тИнтересный должно уменьшаться останова ответ, как показано на рисунке 2.
Рисунок 1. Пост увеличивает полезный эффект пищи. 24 ч быстрой значительно увеличили точки останова на прогрессивные отношения (PR) график подкрепления у мышей (п = 4). Средняя ± стандартная ошибка; * р <0,05.
Рисунок 2. Лептина уменьшается питание награды у мышей. Периферийные лептина (5 мг / кг) снизилась PR пороги останова ответ у мышей (п = 4). Средняя ± стандартная ошибка; * р <0,05.
Discussion
Оперантное задач кондиционирования обеспечивают эффективные средства для оценки изменений в мотивационные свойства пищи. Экспериментальные процедур, описанных в настоящей статье разрешение обучение мышей нажмите рычаг для пищевых вознаграждений и стабильно реагировать на график PR подкрепления.
Измерение количества потребляемой пищи не обеспечивает считывание как же усилий на основе мер реагирования, поскольку не все факторы, влияющие на потребление пищи модулировать эффекты награждения пищи. Например, истощая усвояемой глюкозы периферическими 2-дезоксиглюкозы у крыс увеличивается количество свободно доступных потребляемой пищи, но не изменять точки останова в задаче PR пищи 12. PR останова ответ также может отражать изменения в качество пищи награды. Например, точки останова положительно коррелирует с концентрацией сахарозы демонстрирует, что мотивацией для сахарозы увеличивается таким образом, что следующим сладкий вкус 8 12-14.
При использовании этого протокола очень важно иметь в виду, что приобретение пищевых поддерживается оперантного отвечает значительно усиливается регулярное обучение (каждые 1-2 дня) и за счет увеличения мотивационные состояния мыши, реализуя режим ограничения пищи. Кроме того, обеспечение, что мыши обладают относительно стабильным отвечает на одном графике подкрепление прежде чем перейти к более сложной графики (например, FR1 для FR5) является ключом к минимуму переменную производительность во время тестирования. Несмотря на применение этих шагов, она не является необычным, чтобы получить некоторую изменчивостьособенно между различными мышами. По этой причине настоятельно рекомендуется использовать внутри субъектов (повторных измерений) проектирования, когда можно снять по теме изменчивость. Хотя внутри предмета тестирования не представляется возможным для исследования стабильных генетических модификаций (например, нокаутом в сравнении с контролем мышей), она может быть использована для изучения влияния лекарственных средств, повреждения или острой генетический (например, optogenetic) манипуляции.
Ожирение и связанные с ожирением заболевания являются серьезной проблемой, что привело к увеличению срочности для идентификации молекул и нервных путей участие. Накопленные данные свидетельствует о важной роли мозга награду в пищевой цепи жажда, повышенное потребление калорий и веса. Задача PR является ценным инструментом для измерения воздействия нейробиологических, генетических и фармакологических манипуляций на награждение эффект пищи.
Disclosures
Производство и свободный доступ видео-статья спонсируется Med Associates, Inc
Acknowledgments
Этот проект был поддержан грантами от естественных наук и инженерного исследовательского совета Канады (355 881) и Канадского фонда инноваций.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse operant chambers |  Med Associates, Inc. |
ENV-009A | Med Associates Inc. PO Box 319 St. Albans, Vermont 05478, USA Phone: (802) 527-2343 |
| 8 inputs/16 inputs Smart Control Connection Panel | Med Associates, Inc. |
SG-716B | |
| Ultra-light retractable mouse lever | Med Associates, Inc. |
ENV-312 | |
| Pellet Dispenser | Med Associates, Inc. |
ENV-203 | |
| House Light | Med Associates, Inc. |
ENV-215 | |
| Stimulus Light | Med Associates, Inc. |
ENV-221 | |
| Dust-free Precision 20 mg high-fat & high-sugar pellets | Bio-Serv | F-06649 | Bio-Serv One 8th Street, Suite 1 Frenchtown, NJ 08825, USA Phone: (800)-996-9908 |
| Table 1. Specific equipment and material | |||
References
- Fulton, S. Appetite and reward. Front. Neuroendocrinol. 31, 85-103 (2010).
- Zheng, H., Lenard, N. R., Shin, A. C., Berthoud, H. R. Appetite control and energy balance regulation in the modern world: reward-driven brain overrides repletion signals. International journal of Obesity. 33, Suppl 2. S8-S13 (2009).
- Skinner, B. F. The Behavior of Organisms: An Experimental Analysis. , Appelton-Century. (1938).
- Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134, 943-944 (1961).
- Hodos, W., Kalman, G. Effects of increment size and reinforcer volume on progressive ratio performance. J. Exp. Anal. Behav. 6, 387-392 (1963).
- Stafford, D., LeSage, M. G., Glowa, J. R. Progressive-ratio schedules of drug delivery in the analysis of drug self-administration: a review. Psychopharmacology. , 139-169 (1998).
- Glass, M. J., O'Hare, E., Cleary, J. P., Billington, C. J., Levine, A. S. The effect of naloxone on food-motivated behavior in the obese Zucker rat. Psychopharmacology (Berl). 141, 378-384 (1999).
- Brennan, K., Roberts, D. C., Anisman, H., Merali, Z. Individual differences in sucrose consumption in the rat: motivational and neurochemical correlates of hedonia. Psychopharmacology (Berl). 157, 269-276 (2001).
- Vaughan, C., Moore, M., Haskell-Luevano, C., Rowland, N. E. Food motivated behavior of melanocortin-4 receptor knockout mice under a progressive ratio schedule. Peptides. 27, 2829-2835 (2006).
- Haluk, D. M., Wickman, K. Evaluation of study design variables and their impact on food-maintained operant responding in mice. Behav. Brain Res. 207, 394-401 (2010).
- Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J. Neurosci. Methods. 66, 1-11 (1996).
- Jewett, D. C., Cleary, J., Levine, A. S., Schaal, D. W., Thompson, T. Effects of neuropeptide Y, insulin, 2-deoxyglucose, and food deprivation on food-motivated behavior. Psychopharmacology (Berl). 120, 267-271 (1995).
- Fulton, S., Woodside, B., Shizgal, P. Modulation of brain reward circuitry by leptin. Science. 287, 125-128 (2000).
- Figlewicz, D. P., Bennett, J. L., Naleid, A. M., Davis, C., Grimm, J. W. Intraventricular insulin and leptin decrease sucrose self-administration in rats. Physiol. Behav. 89, 611-616 (2006).
