Summary
Nærværende rapport indeholder oplysninger om protokollen benyttes til at måle givende effekter af fedtrig mad i mus ved hjælp af en progressiv forhold operant betingning opgave.
Abstract
Fødevarer, der er rige på fedt og sukker bidrage væsentligt til over-spise og eskalerende satser for fedme. Forbruget af velsmagende fødevarer kan producere en givende effekt, styrker action-resultat foreninger og styrker fremtidig adfærd rettet mod at opnå disse fødevarer. Stigende bevis for at givende virkningerne af energirige fødevarer spiller en dyb rolle i overspisning og udvikling af fedme har øget interesse i at studere de gener, molekyler og neurale kredsløb, som modulerer mad belønning 1,2. Den berigende virkning af forskellige stimuli kan studeres ved at måle vilje til at arbejde for at opnå dem, som i operant betingning opgaver 3. Operant modeller af fødevare belønning foranstaltning erhvervet og frivillige adfærdsmæssige reaktioner, der er rettet mod at skaffe mad. En almindeligt anvendt mål for belønning styrke er en operant procedure kendt som gradvis forholdet (PR) tidsplan for forstærkning. 4,5 I PR tspørger, er emnet forpligtet til at foretage et stigende antal operant svar for hver efterfølgende belønning. Den banebrydende undersøgelse af Hodos (1961) viste, at antallet af besvarelser er foretaget for at opnå den sidste belønning, kaldet breakpoint, fungerer som et indeks af belønning styrke 4. Mens operant procedurer, der måler ændringer i svarprocenten alene ikke kan adskille ændringer i belønning styrke fra ændringer i ydeevne og kapacitet, er pausepunktet stammer fra PR skema et godt valideret mål for de givtige virkningerne af mad. PR-opgave er blevet udbredt til at vurdere belønne virkningerne af narkotika misbrug og mad i rotter (fx 6-8), men i mindre omfang i mus 9. Den øgede anvendelse af genetisk modificerede mus og kost-inducerede overvægtige musemodeller har skærpet kravene til adfærdsmæssige foranstaltninger mad belønning i mus. I denne artikel vil vi detaljeret beskrivelse af de materialer og procedurer, der anvendes til at træne mus til at reagere (arm-tryk) for et højt fedtindholdog højt sukkerindhold foderpiller på PR tidsplan for forstærkning. Vi viser, at breakpoint respons tærskler stige som følge af akut mad afsavn og falde med perifer administration af det anorektiske hormonet leptin og dermed validere brugen af denne mad-operant paradigme i mus.
Protocol
* De fleste vigtige skridt.
1. Udstyr og software
- Træning og test udføres i mus operantkamre udstyret med to Ultralet, tilbagetrækkelige håndtag 1 placeret på hver side af en fødevare beholder (se tabel 1). En stimulus lys er placeret over hver arm, og der er et hus lys ved toppen af buret. En pellet dispenser er placeret uden for kammeret. Hver afdeling har til huse i en lyd-formildende aflukke med ventilation ventilator. Chambers er forbundet til en PC med MedPC IV software via en "Smart Control" grænseflade kabinet.
Bemærk: Når ultralette håndtag er ikke tilgængelige, anbefales det, at næsen sækken anvendes som den operante respons for muse undersøgelser. Men med begge muligheder, vi foreslår udvalg af ultra-lette stænger som en mere pålidelig måling af motivation, da næse-stikker reaktioner kan be udløst af sonderende snuse.
- De MedPC programmer, der anvendes til at køre operant opgaver er skrevet i Medstate notation kode, som en bruger kan lære ved hjælp af programmeringen forudsat manual. Programmering giver fleksibilitet for brugeren at modificere eksisterende regler eller generere unikke eksperimentelle parametre. Visse koder kan fås gratis fra Med Associates "Medstate Notation Repository" http://www.mednr.com . Yderligere koder kan købes hos Med Associates.
2. Mus Akklimatisering og fødevarer begrænsninger
- Ved ankomst mus huses i grupper i mindst 10 dage til at akklimatisere til en revers 12 h lys / mørkecyklus og forsynet med ad libitum adgang til standard foder og vand. I vores tilfælde bruger vi voksne C57BL / 6 mus købt fra Charles River (St. Constant, QC). Alle mus manipulationer og adfærdsmæssige eksperimenter udføres under den mørke cyklus. Alle proprocedurer, der involverer brug af dyr blev godkendt af CRCHUM Animal Care udvalget.
- Mus efterfølgende enkeltvis-huse og føde begrænset (70% af deres daglige fødeindtagelse), indtil de når 90-95% fri fodring kropsvægt for at lette erhvervelsen af håndtag-pressen reagere. Mus blev forudsat at deres daglige kvote af mad i hjemmet bur efter afslutningen af sessionen. Efter at have nået 5-10% vægttab, er den daglige tildelt mad tilpasset til at stabilisere de lavere kropsvægt for den resterende del af praktikperioden. Når mus har opnået erhvervelse kriterier (se nedenfor), at de sættes tilbage på en ad libitum fodring tidsplan. Mus genvinde tabte kropsvægt på omkring 3-4 dage.
- Mus håndteres i testen plads til 3 på hinanden følgende dage før den første træningssession. Dagen før påbegyndelsen af træning 10-15 højt fedtindhold og højt sukkerindhold (HFHS) pellets anbringes i hjemburet at forhindre potentiel betydning af fødevarer neophobia på operant udføres etce. Vi bruger 20 mg HFHS, støvfri og præcision mad pellets (14 mg fås også), der indeholder 48,9% kcal som fedt (Bio Serv, Frenchtown, NJ).
3. Operant Uddannelse
- Musene indledningsvis trænes til at trykke håndtaget på et fast forhold (FR) -1 forstærkning skema hvorved en enkelt arm tryk fremkalder afgivelse af en foderpille til beholderen. Kun et enkelt håndtag er udpeget som "aktiv" (udløsning levering af mad belønning), og tildelingen af højre og venstre håndtag modsvares mellem mus. Det er vigtigt at tilføje mindst en fem sekunder timeout (TO) til FR1 skema (FR1/TO-5), hvor yderligere vægtstang presning ikke resulterer i afgivelse af en foderpille. Dette til periode giver tid til mus til at indtage maden pellet, kan dog længere time-outs bruges, hvis forsøgslederen mener, at det er nødvendigt for deres musemodel. Hver FR træningen varer 1 time, eller når 50 pellets er blevet leveret.
- * Erhvervelse kriterier: </ Strong> De kriterier, der anvendes til at bestemme køb af fødevarer opretholdes operant reagerer omfatter: (1) et minimalt antal af aktive reaktioner og belønninger fortjent, (2) et mål for forskelsbehandling mellem aktive og inaktive håndtag, og (3) mellem-session ydeevne stabilitet. Mus udviser diskrimination af ≥ 3:1 for den aktive versus inaktive håndtaget og opnå ≥ 20 belønninger per besøg i løbet af tre på hinanden følgende sessioner anses for at opnå opkøb kriterier 10. Vi har observeret, at flertallet (~ 75%) af C57BL6 mus kræver omkring 7-10 dages træning for at opnå køb kriterier. Mus, der ikke når erhvervelse kriterier ved denne tid gennemgå efteruddannelse i yderligere 5-7 dage. Vi udelukker mus fra test (~ 5% af tilfældene), når der ikke sker fremskridt med ekstra 5. Træningsdag. Det er vigtigt at huske på, at nedsat operant erhvervelsen kan være et resultat af visse farmakologiske og genetiske indgreb, og bør derfor dokumenteres. </ Li>
- Efter tre på hinanden følgende sessioner for at opnå ≥ 20 piller, er det planen øges til FR5/TO-5 sekunder, hvor 5 aktive håndtag presser udløse levering af maden pellet. Træning på FR5 tidsplanen varer tre dage.
- * Musene derefter uddannet i den progressive forholdet (PR) tidsplan for forstærkning. Svaret Forholdet tidsplan under PR test kan beregnes pr Richardson og Roberts (1996) 11 ved hjælp af følgende formel (afrundet til nærmeste hele tal):
= [5 e (R * 0,2)] - 5
hvor R er lig med antallet af fødevarer belønninger allerede opnået plus 1 (dvs. næste forstærker). Således er antallet af svar, der kræves for at tjene en fødevare belønning følger den rækkefølge: 1, 2, 4, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 32, 40, 50, 62, 77, 95 og så videre. Den endelige afsluttet forhold er breakpoint. - En PR-session varer maksimalt 1 time. Undladelse af at trykke på håndtaget i alle 10 min periode resulterer i afslutning af sessionen. PerformanceMance på PR tidsplan for forstærkning betragtes som stabilt, når antallet af belønninger optjent i en 1-times session afviger ≤ 10% i mindst 3 dage i træk.
4. Progressive Ratio Test og validering
- For at validere fødevarer opretholdes operant reagerer i PR opgaven, kan man vurdere breakpoint reagerer følgende kendte manipulationer til at modulere mad belønning. En relativt let-test til at udføre er mad berøvelse som vil øge motiverende tilstand mus for fødevarer og derved forøge breakpoints. Mus skal først testes i PR opgaven i en periode med ad libitum fodring, indtil stabil, baseline performance opnås. Dagen efter den sidste "basislinie" dag fødevarer fjernes fra hjembur og mus testes derefter i PR opgaven 24 timer efter starten af hurtigt.
- Vi har også undersøgt, om perifer administration af det anorektiske hormonet leptin ville have den modsatte effekt på breakpointtærskler. Leptin (AF Parlow, National Hormone og Peptid Program, NIDDK) blev opløst i sterilt PBS. PR-test blev gennemført efter en IP-injektion af PBS på en dag og derefter efter injektion af leptin (5 mg / kg) den følgende dag. Leptin blev injiceret en time før PR testning. Breakpoints blev sammenlignet under anvendelse af en parret t-test (GraphPad Prism).
5. Repræsentative resultater
Når teste evnen af fødevarer nød til at modulere brudpunkt svare på en PR tidsplan for forstærkning, forventer vi at øge breakpoints som vist i figur 1. I dette eksperiment en 24 h periode med fødevarer nød frembragte en ~ 3,6-fold stigning i brudpunkter i forhold til dem opnået i fri fodring basislinie tilstand hvilket antyder, at fødevaren berøvelse øger givende effekt af fødevarer. I modsætning hertil, perifer indgivelse af det anorektiske hormon leptin (5 mg / kg, IP) en time før tsant bør falde breakpoint reagerer som vist i figur 2.
Figur 1. Faste øger givende virkningerne af mad. En 24 timer hurtig betydeligt brudpunkterne på en progressiv forhold (PR) tidsplan for forstærkning i mus (n = 4). Middelværdi ± SEM, * p <0,05.
Figur 2. Leptin falder mad belønning i mus. Perifer leptin administration (5 mg / kg) faldt PR brudpunkt respons tærskler i mus (n = 4). Middelværdi ± SEM, * p <0,05.
Discussion
Operant betingning opgaver være et effektivt middel til at vurdere ændringer i de motiverende egenskaber mad. De eksperimentelle procedurer, der er beskrevet i denne artikel tilladelse uddannelse mus til håndtaget pressen til fødevarer belønninger og stabilt reagere på en PR tidsplan for forstærkning.
Måling af mængden af forbrugt fødevaren ikke giver den samme udlæsning som indsats-baserede modforanstaltninger, da ikke alle faktorer, der påvirker fødeindtagelse modulere at belønne virkningerne af mad. For eksempel øger nedbryder anvendelige glucose ved perifer 2-deoxyglucose administration i rotter mængden af frit tilgængelig indtaget fødevarer, men undlader at ændre knækpunkter i PR opgave for fødevarer 12. PR breakpoint reagerer kan også afspejle ændringer i kvaliteten af fødevarer belønninger. For eksempel er knækpunkter positivt korreleret med saccharose koncentration viser, at motivation for saccharose stigninger på en måde, således sød smag 8 12-14.
Når du bruger denne protokol er det vigtigt at huske på, at køb af fødevarer opretholdes operant reagere betydeligt forbedret ved regelmæssig træning (hver 1-2 dage) og ved at øge motiverende tilstand af musen ved at implementere en fødevare begrænsning regime. Hertil kommer, at sikre, at mus udviser relativt stabilt svare på en forstærkning tidsplan, før man går videre til mere komplekse skemaer (f.eks FR1 til FR5) er nøglen til at minimere variabel ydeevne under test. På trods af anvendelsen af disse trin er det ikke usædvanligt at opnå en vis variabilitetisær mellem forskellige mus. Af denne grund, er det stærkt anbefales at bruge en indenfor-fag (gentagne målinger) design når det er muligt at fjerne på tværs af individer. Selv inden for individet test ikke er muligt for at undersøge stabile genetiske modifikationer (dvs. knockout versus kontrol mus), den kan bruges til at undersøge påvirkning af narkotika, læsioner eller akutte genetiske (f.eks optogenetic) manipulationer.
Fedme og fedme-relaterede sygdomme er et stigende problem, som har øget det haster med at identificere de molekyler og nervebanerne involveret. Akkumulerende beviser fremhæver den vigtige rolle, hjernen belønning kredsløb i fødevare-trang, øget kalorieindtag og vægtøgning. PR Opgaven er et værdifuldt værktøj til at måle virkningen af neurobiologiske, genetisk eller farmakologiske manipulationer på at belønne virkningerne af mad.
Disclosures
Produktion og fri adgang for denne video-artikel er sponsoreret af Med Associates, Inc.
Acknowledgments
Dette projekt blev støttet af tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (355.881) og den canadiske Institut for Innovation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse operant chambers |  Med Associates, Inc. |
ENV-009A | Med Associates Inc. PO Box 319 St. Albans, Vermont 05478, USA Phone: (802) 527-2343 |
| 8 inputs/16 inputs Smart Control Connection Panel | Med Associates, Inc. |
SG-716B | |
| Ultra-light retractable mouse lever | Med Associates, Inc. |
ENV-312 | |
| Pellet Dispenser | Med Associates, Inc. |
ENV-203 | |
| House Light | Med Associates, Inc. |
ENV-215 | |
| Stimulus Light | Med Associates, Inc. |
ENV-221 | |
| Dust-free Precision 20 mg high-fat & high-sugar pellets | Bio-Serv | F-06649 | Bio-Serv One 8th Street, Suite 1 Frenchtown, NJ 08825, USA Phone: (800)-996-9908 |
| Table 1. Specific equipment and material | |||
References
- Fulton, S. Appetite and reward. Front. Neuroendocrinol. 31, 85-103 (2010).
- Zheng, H., Lenard, N. R., Shin, A. C., Berthoud, H. R. Appetite control and energy balance regulation in the modern world: reward-driven brain overrides repletion signals. International journal of Obesity. 33, Suppl 2. S8-S13 (2009).
- Skinner, B. F. The Behavior of Organisms: An Experimental Analysis. , Appelton-Century. (1938).
- Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134, 943-944 (1961).
- Hodos, W., Kalman, G. Effects of increment size and reinforcer volume on progressive ratio performance. J. Exp. Anal. Behav. 6, 387-392 (1963).
- Stafford, D., LeSage, M. G., Glowa, J. R. Progressive-ratio schedules of drug delivery in the analysis of drug self-administration: a review. Psychopharmacology. , 139-169 (1998).
- Glass, M. J., O'Hare, E., Cleary, J. P., Billington, C. J., Levine, A. S. The effect of naloxone on food-motivated behavior in the obese Zucker rat. Psychopharmacology (Berl). 141, 378-384 (1999).
- Brennan, K., Roberts, D. C., Anisman, H., Merali, Z. Individual differences in sucrose consumption in the rat: motivational and neurochemical correlates of hedonia. Psychopharmacology (Berl). 157, 269-276 (2001).
- Vaughan, C., Moore, M., Haskell-Luevano, C., Rowland, N. E. Food motivated behavior of melanocortin-4 receptor knockout mice under a progressive ratio schedule. Peptides. 27, 2829-2835 (2006).
- Haluk, D. M., Wickman, K. Evaluation of study design variables and their impact on food-maintained operant responding in mice. Behav. Brain Res. 207, 394-401 (2010).
- Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J. Neurosci. Methods. 66, 1-11 (1996).
- Jewett, D. C., Cleary, J., Levine, A. S., Schaal, D. W., Thompson, T. Effects of neuropeptide Y, insulin, 2-deoxyglucose, and food deprivation on food-motivated behavior. Psychopharmacology (Berl). 120, 267-271 (1995).
- Fulton, S., Woodside, B., Shizgal, P. Modulation of brain reward circuitry by leptin. Science. 287, 125-128 (2000).
- Figlewicz, D. P., Bennett, J. L., Naleid, A. M., Davis, C., Grimm, J. W. Intraventricular insulin and leptin decrease sucrose self-administration in rats. Physiol. Behav. 89, 611-616 (2006).
