הכנת עכבר ער להקלטת תגובות עצביות והזרקת קליעים נותבים

Summary

אפיון אלקטרו של תגובות עצביות חשובה להבנת תפקוד המוח ועל המנחה את המיקום של צבעים עבור מסלול העתקה. עם זאת, מחקרים רבים נעשים בבעלי חיים הרדומות. על מנת להבין את תפקוד המוח, ללא הרדמה, פיתחנו שיטה להקליט מאפייני התגובה העצבית ולהזריק צבעים של העכבר ער.

Abstract

זה ידוע היטב כי הרדמה משנה את מאפייני התגובה העצבית באזורים שונים של המוח. ^13. במערכת השמיעה, מאפייני התגובה היסוד של נוירונים גזע המוח כולל סף, לא ספציפית תדירות, ו sidebands מעכבות משתנים באופן משמעותי תחת הרדמה ^1-2. תצפיות אלו הניעו פיזיולוגים לחפש דרכים כדי להקליט נוירונים בודדים ללא תופעות מזהמים של הרדמה. אחת התוצאות היתה הכנה decerebrate, שם גזע המוח היה transected לחלוטין ברמה של המוח התיכון ^4. החסרונות של הכנות זה הם ניתוח קשה, חיסול יורד התחזיות של המוח הקדמי, וחוסר יכולת להשתמש גירוי חושי לבחון מבנים מעל המוח התיכון. אסטרטגיה שונה כבר להשתיל מערכי אלקטרודות כרוני להקליט מתא עצב יחיד ואשכולות multiunit בעוד החיה ער ו / או מתנהג ^5,6 7-9 על העכבר ^10-12. באמצעות שיטה זו, אנו מסוגלים לבצע הקלטות אלקטרו מעל מספר ימים העכבר unanesthetized. בסיום ההקלטות, אנחנו יכולים ואז מזריקים צבע לשחזר עמדות אלקטרודה ואתרי הקלטה או להזריק נותב כך המסלולים וממנה את לוקוסים הקלטה ניתן לקבוע. שיטה זו מאפשרת מבודדים היטב הקלטות נוירון בודד על פני ימים רבים ללא הרדמה שימוש.

Protocol

1. ראש איפוק סקירה כללית

1. להרכיב שהותקן בראש הפוסט, להוסיף 1/16 "נירוסטה גליל פינים בניצב לתוך חור שנקדח 3/32" מוט נירוסטה כדי ליצור צלב. קטע אנכי של הפוסט הראש צריך להיות בערך 20 מ"מ פיסת חוצה אופקי על 15 מ"מ. לחץ קצה אחד של מוט אנכי לקבל בורג # 1-72. (איור 1).
2. במהלך הניתוח הקלטה, ראש שלאחר מאובטח בפליז שהותקן או סרגל אלומיניום גובר עם # 1-72 בורג (איור 2). קטע ארוך של בר הרכבה צריך להיות בערך 90 מ"מ אורך ו 5-10 מ"מ רחב. ראש שלאחר נכנס לתוך חתך לתוך חריץ הרחבה 15 מ"מ מעל הבר הארוך, כי הוא בזווית של 45 מעלות. כדי למנוע סיבוב הראש, קורת הרוחב של הראש שלאחר מקננת לתוך חריץ קטן בחלק התחתון של פס ההרכבה.
3. בר גובר מחובר אז לגוש מחוייט אלומיניום גוברk (איור 3). בלוק גובר הוא כ 30 מ"מ x 30 מ"מ x 25 מ"מ. בלוק זה גובר מחובר micromanipulator כך את המיקום של הראש שלאחר ניתן למקם במדויק לאורך קו האמצע ועל גבחת. בלוק הרכבה עשוי שני חלקים מצויד יחד עם ברגים. לחתוך את בבלוק מאפשר בר גובר להחליק פנימה להיות מאובטח עם הברגים. בר גובר מקביל פני השולחן. במהלך ההקלטה, להבטיח את סרגל במסגרת stereotaxic אישית (איור 4). Stereotax נועד לעגן את סרגל באותה תנוחה כמו בלוק גובר במהלך הניתוח. סידור זה מבטיח את העכבר תמיד יהיה מיושר מסגרת stereotaxic פני פגישות ניסיוניות.
4. גזור מוט טונגסטן (בקוטר .010 ") באורך של כ 5 מ"מ, עם נטייה כ 1 מ"מ ב 45 °. מוט זה משמש סיכה הקרקע (איור 1).

2. Stereotaxic אלignment עבור craniotomy

הערה: כל הנהלים המפורטים להלן פעל בשיטות ניתוח רגילות אספטי אושרו על ידי טיפול סטייט בעלי חיים בוושינגטון הוועדה השימוש בבעלי חיים ועדת האתיקה של לשכת Garvan.

1. להרדים את העכבר על ידי הנחת בתא אינדוקציה עם 5% isoflurane. חוסר התגובה על הזנב ו / או קמצוץ הבוהן מבטיח כי בעל החיים הוא בהרדמה מלאה.
2. מניחים את העכבר בתוך מסגרת מכרסם stereotaxic לבוש עם מתאם העכבר (Stoelting). כדי לכוון את העכבר בצורה נכונה, למקם את השיניים בתוך החור של הבר ביס והדק מהדק את האף ולכן הוא צמוד. מניחים את העכבר וישרים ככל האפשר בשורת ביס ו מהדק את האף. מניחים מסכת פנים עשוי פיסת לטקס כפפה על האף של העכבר, ולשמור isoflurane 5% עד קצב הנשימה של העכבר הוא כ 1 נשימה / sec. הפעל isoflurane ל 1.5-2.0%. להבטיח את הראש באמצעות tהוא אוזניים ברים להיות זהיר כדי לא לנקב את תוף האוזן. ברים צריך להיות הדוק אך לא לחדור עמוק מדי לתוך תעלת האוזן.
3. הניחו כרית חימום מתחת העכבר.
4. החל משחת עיניים כדי למנוע את העיניים מהתייבשות.
5. לגלח את הקרקפת מבין את האוזניים עד העיניים עם מכונת גילוח קטן או קנס נקודה מספריים.
6. יש לנקות ולחטא את עור הקרקפת על ידי מנגב עם chlor-hexidine (או בבטאדין) שיחים ואחריו אלכוהול לשטוף שוב 3 פעמים.
7. כדי להסיר את העור מעל הגולגולת לעשות חתך לאורך קו האמצע מהחלק האחורי של הראש לעיניים.
8. לגרד את periosteum את הקצוות של החתך עם אזמל. אם נדרש (תלוי ביעד ניסיוני), בעיון חוזר בי השרירים בחלק האחורי של הצוואר עם מלקחיים, המאפשר שרירים לקרוע יחד fascicles כדי למזער את הדימום. החל gelfoam מתחת רקמת הקרקפת כדי למזער ולמנוע לחות העור לנוע על פני הגולגולת.
9. לייבש את פני הגולגולת עם המוליך כותנה שקצהו טבולה אלכוהול איזופרופיל כדי לשפר את ההדמיה של ציוני דרך הגולגולת.
10. יישר את הגולגולת לרמת stereotaxic קואורדינטות ^13. הוספת בדיקה עדין טעם בעל אלקטרודה וצרף אותו micromanipulator stereotaxic. מוט מתכת מחודד עובד היטב למטרה זו (איור 5).
11. השתמש נקודת לזהות גבחת (איור 5 א) ו - למבדה (איור 5 ב) על הגולגולת. להזיז את החללית חזרה-and-ושוב בין נקודות אלו, כי בדיקת לתאם לרוחב-המדיאלי עבור כל מיקום שונה של לא יותר מ 50 מיקרומטר. לשנות את מיקום הראש לפי הצורך על ידי בקפידה להתרופפות שנות ברים אוזניים, מעביר את הראש אוזניים ברים רוחבית, ו retightening שנות ברים אוזניים.
12. ודא כי גובה הגחון הגב, על כל מיקום שונה של לא יותר מ 50 מיקרומטר. התאם את גובה מלחציים, האף, אשר סובב סביב ציר הגולגולת של האוזן ברים,כדי לפלס את גובה הצליל של הגולגולת במידת הצורך. הגובה של בר אוזן עשוי גם צריך להיות מותאם.
13. השתמש אטלס ¹³ לזהות את הקואורדינטות של יעד הריבית (איור 5 ג) ביחס גבחת. סמן את הגולגולת מעל היעד (למשל, "X" או להשתמש בדיו כדי נקודה ארבע פינות הריבוע) שבו craniotomy ייעשה (איור 5D).

3. ראש הדואר פין התקנה קרקע

1. שימוש בג'ל לחרוט לנקות הגולגולת. השתמש המוליך לקרצף ולהפיץ ג'ל לחרוט על פני השטח (10 שניות). לשטוף עם מים ולייבש לגמרי. החל פריימר על המלט שיניים אל פני השטח את הגולגולת באמצעות המוליך. מורחים דבק עם המוליך החדש. לרפא דבק עם אקדח אור UV (1 במחזור).
2. בחר מיקום עבור סיכה הקרקע כלומר דיסטלי לאתר היעד. בזהירות נשא חור קטן בגולגולת באמצעות קצה # 65 miniblade אזמל רק רחב מספיק בסופו של דבר קצר p הקרקעכדי להיכנס ולנוח על קרומי המוח את. סיכה הקרקע צריכה להיות מכוונת כך שהוא מצביע הרחק גבחת והעתיד ראש שלאחר (איור 6 א).
3. לאבטח את ראש שלאחר לבר גובר ולחסום ומתחברים micromanipulator. על ידי העברת micromanipulator בשלושה ממדים, למקם את הראש שלאחר מעל גבחת, פשוט נוגע הגולגולת (איור 6 ב). בסיס שלאחר הראש צריך לשכב על הגולגולת.
4. באמצעות בדיקות ניתוח שלאחר המוות, מכניסים כמות קטנה של דבק דנטלי סביב שלאחר בראש סיכה הקרקע (איור 6C). לחץ הבטון למטה על מנת להבטיח קשר טוב עם הגולגולת. הערה: אין להשתמש בטון יותר מדי או שהוא לא להקשיח באופן שווה. לרפא את המלט עם אקדח אור UV (מחזורים 3-4 מזוויות מרובות).
5. החל השלב השני של מלט לבנות את הבסיס סביב שלאחר ראש ולכסות את החריצים של הפוסט הראש (איור בקר 6d).

4. Craniotomy

1. אתר את הפניה craniotomy מארק, אשר יהיה מוסתר חלקית על ידי פריימר. השתמש # 65 אזמל לציון 3 מ"מ x 3 מ"מ מרובע סביב באתר זה ולהחיל ירידה של לידוקאין להפחתת רגישות כדי למזער את הדימום.
2. לעשות עשרות רבות בכל צד של הכיכר (עד 10), נזהרים שלא לחתוך את העצם אל תוך המוח (איור 7 א).
3. לאחר דש העצם הופך רפוי, השתמש קצה אזמל לחלץ אותו, עוזב את דורה מאטר שלמים (איור 7 ב).
4. מכסים בשעווה העצם.

5. לאחר הניתוח

1. בטל גז הרדמה ולהסיר את העכבר מהמסגרת stereotaxic.
2. השתמש המוליך כותנה שקצהו ליישם המשחה לידוקאין סביב עור חשוף כדי להקהות תחושה סביב הפצע. שימוש אחר המוליך כותנה שקצהו ליישם וכוהל על העור החשוף. להזריק ketoprofen (5 מ"ג / ק"ג IM או ה-IP על בסיס העדפה של וטרינרים IACUC בודדים), כמוכאבים שלאחר ניתוח. עכבר יהיה בדרך כלל להיות עד והעברה בתוך דקות של הפסקת הגז.
3. במקום עכבר בכלוב צג חמים עד שהוא מוכן לחזור לדיור בעלי חיים.
4. בעלי חיים יש לבדוק על לפחות פעם ביום לאחר שהוא התאושש מהניתוח. לראות סימנים של אכילה גרועים ו / או שתייה והתנהגות אדיש. אם הכאב על פי החשד, לספק ketoprofen כל 24 שעות (במינון זהה בתום ניתוח שלאחר) עד הקלה. לידוקאין ניתן ליישם באופן מקומי על הפצע אם בעל החיים הוא מגרד או מראה סימני אי נוחות. בעלי חיים בדרך כלל להתאושש מן הניתוח ללא סיבוכים או כאבים.

6. הקלטה דיי הזרקת

1. חכו לפחות יום אחד לאחר ניתוח ראש שלאחר לפני השימוש בעכבר על הקלטות.
2. העכבר במקום במכשיר קצף מניעה יצוק לגוף של העכבר. העכבר כבר מותאמת למכשיר זה, ובכך להפחית את החרדה שלו. הסתגלות היא אופייניתכדי להתמודד עם העכבר כל יום אחרי גמילה ובמשך כשבוע לפני הניתוח וניסויים, הצב את העכבר במכשיר קצף של 1-5 דקות. להשעות את המכשיר במסגרת stereotaxic (איור 4).
3. Secure ראש שלאחר לבר גובר, אשר תוקנה על מסגרת stereotaxic (איור 4).
4. חיבור סיכה הקרקע עם חוט הסתיים עם קצה המחט בוטה 22-מד המזרק.
5. הסרת שעווה על עצם craniotomy. הסר דורה במידת הצורך באמצעות קצה של אזמל miniblade.
6. סע האלקטרודה למקום הנכון stereotaxic ולהתחיל הקלטה (איור 8). רק הקלטות אלקטרו, מגוון של אלקטרודות ניתן להשתמש. הבחירה של האלקטרודה תלוי במיקום ובסוג הקלטות הנדרשים. הבחירה של האלקטרודה עבור ההקלטות עכבר ער יהיה זהה למה החוקר משתמש ב עכבר הרדים. עבור הקלטות אלקטרו בשילוב עםצבע / מעקב זריקות, אלקטרודה micropipette משמש ^10. Micropipette מלא צבע / מעקב של בחירה, כך שהוא יהיה ניתן להזריק iontophoretically בסוף ניסויים אלקטרו. אלקטרודות Multibarrel יכול לשמש גם כדי מניפולציות תרופתי יכול להתבצע. האלקטרודה multibarrel הוא רכוב על micropipette הקלטה אחת (איור 8). טכניקות אלה מקובלים בספרות אינם שונים להקלטות הרדים לעומת ערים.
7. הקלטות יכול להתבצע על 4-5 שעות וימים ברציפות, 3-4.
8. בתום הפגישה ההקלטה, צבע / מעקב יכול להיות מוזרק. כי אין קולטני כאב במוח, הזרקת iontophoretic של צבע או נותב אל המוח אינו צפוי לגרום לחוסר נוחות. עם זאת, פעם אחת את המאפיינים תגובה אלקטרו האזור שבו הזריקה היא להיות מאופיינות, בעלי חיים יכול להיות מורדם עם F isofluraneאו בהזרקה. זה היה מונע את כל תחושות בלתי רצויות פוטנציאליות. בגלל צבע / נותב כבר micropipette, מוביל הפעיל הקרקע ניתן להעביר הקלטה אלקטרו הגדרת לגנרטור הנוכחית iontophoretically מזריקים צבע / מעקב. שימוש בפרוטוקול מתאים צבע / מעקב על האלקטרודה. הסר את החיים מפני ריסון ואיפוק headpost הגוף ולחזור הביתה הכלוב שלה.
9. בסוף הניסוי, בצע את הפרוטוקול המתאים המתת חסד עיבוד רקמות להתאושש ההזרקה וסימון.

7. נציג תוצאות

התקנה מוצלחת של פוסט בראש הניסוי מאפשר להקליט התגובות יחיד multiunit של העכבר, unanesthetized ער במשך ימים רבים. מערכת ריסון מאפשר הקלטות אלקטרו יציבה של נוירונים במוח. בידוד מצוין של יחידות בודדות ותגובות חזקות טיגירויים O יכול להיות מוקלט מתוך מבנה המוח אותו במשך ימים רבים, למשל העכבר colliculus נחות (איור יום 9 א, 1, איור 9 ב, יום 2). עם ההתקנה ראש שלאחר טוב, עכבר זה יהיה מיושר באופן עקבי למנגנון stereotaxic ו stereotaxic העכבר אטלס, ¹³ וכתוצאה מכך לוקליזציה אמין של גרעיני המוח בפרט. זה לוקליזציה אמין מאפשר הזרקה של צבעים ושל תוכניות מעקב למבנים ספציפיים לאחר ימים הקלטה מרובות. לדוגמה, כדי להעריך את תחזיות יורד מן המוח התיכון השמיעה אל המוח השמיעתית, biotinylated dextran אמין (diaminobenzidine באמצעות דמיינו כמו כרומגן) ניתן להזריק לתוך העכבר colliculus נחות (איור 10 א) לאחר electrophysiologically זיהוי מאפייני התגובה העצבית באתר ההזרקה (באיור. 10A, נוירון נרשמה בתדירות הכי טוב של kHz 51), ולאחר עיבוד רקמות,תיוג nterograde בגרעין הנגדי שבלול הגבי יכולים כבר דמיינו ואת זממו (איור 10 ב). Photomicrographs ברזולוציה גבוהה יותר ניתן להשיג להציג אקסונים שכותרתו anterogradely ומסופי (איור 10c).

באיור 1.

איור 2.

איור 3.

באיור 4.

איור 5.

איור 7.

איור 8.

איור 9.

איור 10.

Discussion

היתרון של מערכת הראש שלאחר איפוק לניסויים אלקטרו ו neuroanatomical של העכבר הוא ניתן לבצע ניסויים עם עכברים, unanesthetized ערים, חיסול זיהום בתגובה פוטנציאל בגלל תרופות ההרדמה. בנוסף, הגדרת ניתן להשתמש במשך ימים רבים כדי לאפשר שימוש יעיל יותר בבעלי חיים.

רוב רכיבים עבור שלאחר ראש זמינים מהמדף-. רק ראש שלאחר ומכשירים גובר הם מחוייט, שניהם פשוט יחסית לבנות והן לשימוש חוזר. אם המלאכה אינה זמינה במוסד, חוקר יכול להשתמש סביר http://www.emachineshop.com/ לפברק את הרכיבים הדרושים.

מיומנויות כירורגיות מיומנים נחוצים. המנתחים חייב להיות בקיאים עם טכניקות כירורגיות בסדר, שחלקם נעשים הטוב ביותר מתחת למיקרוסקופ. הניתוח חייב להיעשות בתנאים אספטיים. הסרת דש הגולגולת היא הנקודה העדינה ביותר של ההליך. על ידי בזהירות ובעדינות ביצוע עשרות רבות עם אזמל לאורך 4 צידי המלבן תוך מבט מבעד למיקרוסקופ ההפעלה, דש הגולגולת ניתן "התפגר" עם דימום מינימלי, ומשאיר דורה מאטר ללא פגע. היכרות עם כלי הדם הבסיסי הוא חיוני, כמו ביצוע חתך מעל כלי דם גדול יוצר סיכון של דימום לא רצוי. כי המחקר שלנו מתמקד במערכת השמיעה, אנו נמנעים השימוש מקדחות לביצוע craniotomies כדי לצמצם את הסיכון טראומה עצם שנערך-האוזן הפנימית.

חשוב לקבל את רמת הקדמי, האחורי המטוס בקנה stereotaxic לפני הצמדת הראש שלאחר. אמצעי זהירות זה מבטיח כי בראש יישאר ברמה פני ניסויים ניסויים ומקל את המיקום של לוקוסים המוח באמצעות אטלס המוח.

אוהל "> על ההקלטה, כדאי להתמודד עם העכבר על בסיס יומי במשך כמה ימים לפני הניתוח. פשוט מקבל את העכבר חשופים טיפול בהתקן ריסון קצף מאפשר הקלטה ארוכים יותר עם מצבי לחץ מופחת תנועה רבה של העכבר. המפתח הוא להיות עכבר להתאים בנוחות בתוך כריך קצף. אם בעל החיים יכול לנוע יתר על המידה, הוא נוטה להיאבק ללא הרף. אם העכבר מתחיל להיאבק, עדיף להפסיק את הקלטה ולאסוף שוב הבאה יום. התנועה של העכבר ב תוצאות biopotentials גדולים ההקלטות שאינם שעוררו הגירוי. אלה הם בדרך כלל משרעת גבוהה יותר, כי פוטנציאל פעולה והם לסירוגין. חפצים התנועה יכול גם להיווצר על ידי חוטי הקלטה הנוגעים לבעלי חיים. חשוב על מנת להבטיח כי אין חוטים נוגעים בעלי חיים. בסך הכל, טכניקה זו אפשרה לנו לבצע מחקרים רבים על עיבוד שמיעתי האנטומיה ללא שימוש בהרדמה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etch gel for cleaning skull prior to dental cement	Henry Schein	101-5396	12/pk with 1.2 mL syringes
Primer for dental cement	Kerr Optibond	25881	8 mL bottle
Adhesive for dental cement	Kerr Optibond	25882	8 mL bottle
Applicators for dental cement	Kerr Optibond	24680	200/pk
Dental Cement	Charisma, Heraeus Kulzer	66000085	4gm Syringe Refill
Tungsten Rod (Ground Pin)	A-M Systems	717200	0.010" diameter
Economy UV Curing Light	Henry Schein	CU-80
Head-post	Built in-house
Mounting bar	Built in-house
Mounting block	Built in-house
Stereotaxic Frame	David Kopf Instruments	902
Mouse and Neonatal Rat Adaptor	Stoelting Co.	51625
Deltaphase Isothermal Pad	Braintree Scientific, Inc.	39DP