Summary
Электрофизиологические характеристики нейронов ответы важны для понимания функций мозга и направления размещения красители для отслеживания пути. Тем не менее, многие исследования проводятся под наркозом животным. Чтобы понять функции мозга без наркоза, мы разработали метод для записи свойств нейронов ответ и ввести красители в бодрствования мышь.
Abstract
Хорошо известно, что анестезия изменяет свойства нейронной реакции в различных регионах мозга. 13. В слуховой системе, фундаментальные свойства реакции нейронов мозга в том числе порог частоты специфику, и тормозных боковых меняются существенным образом под наркозом 1-2. Эти наблюдения побудили физиологи искать пути для записи из отдельных нейронов, не загрязняющие эффекты анестезии. Одним из результатов было децеребрационной подготовки, где мозга была полностью пересекаются на уровне среднего мозга 4. Недостатком этого препарата является грозным операции, ликвидации убывания проекции переднего мозга, а также невозможность использования сенсорной стимуляции для изучения структуры выше среднего мозга. Различные стратегии в том, чтобы имплантировать электроды массивов хронически записи из отдельных нейронов и многоквартирных кластеров в то время как животное бодрствует и / или поведения 5,6 7-9 до 10-12 мыши. Используя этот метод, мы можем проводить электрофизиологические записи в течение нескольких дней в ненаркотизированных мыши. В конце записи сессий, мы можем вводить краситель для восстановления расположения электродов и регистрации сайтов или вводить примеси так, что пути и из записи локусов может быть определена. Этот метод позволяет также изолировать одного нейрона записи в течение нескольких дней без использования анестезии.
Protocol
1. Головной сдержанность Обзор
- Для сборки на заказ головой сообщение, вставьте 1/16 "из нержавеющей стали Roll-контактный перпендикулярно в отверстие в 3/32" стержень из нержавеющей стали в форме креста. Вертикальная часть головы сообщение должно быть около 20 мм и горизонтальный крест части около 15 мм. Нажмите один конец вертикального стержня, чтобы принять # 1-72 винты. (Рис. 1).
- Во время операции и записи, голова после закреплен в заказ латунь или алюминий монтаж бар с # 1-72 винты (рис. 2). Длинный кусок монтажной панели должна быть около 90 мм в длину и 5-10 мм. Штаб-сообщение помещается в паз нарезать на 15 мм удлинитель от длинного стержня, который под углом 45 град. Чтобы предотвратить поворот головы, перемычку в голову после расположился в небольшой паз в нижней части монтажной панели.
- Монтаж в панель затем прикрепляется к заказу алюминий монтаж блокаК (рис. 3). Монтажного блока составляет около 30 мм х 30 мм х 25 мм. Это монтажный блок крепится к микроманипулятор так, чтобы положение головы-сообщение может быть точно расположены вдоль средней линии и на темя. Монтажный блок состоит из двух частей установлены вместе с винтами. Вырез в блок позволяет монтаж бар скользить в и закрепляться с помощью винтов. Монтажные панели параллельно поверхности стола. Во время записи, обеспечить бар в пользовательском кадр стереотаксической (рис. 4). Stereotax предназначено для установки панели в том же положении, как и в монтажном блоке во время операции. Такое расположение гарантирует, что мышь всегда будет выровнен по стереотаксической кадров по экспериментальной сессии.
- Вырезать вольфрамовый стержень (диаметром 0,010 ") до примерно 5 мм длиной, примерно 1 мм, изогнутый под углом 45 °. Этот стержень служит заземлением (рис. 1).
2. Стереотаксической Alignment для трепанации черепа
Примечание: Все процедуры, описанные ниже следуют стандартные асептические хирургические методы и были одобрены Университета штата Вашингтон уход животных и Комитета использования и животных Комитет по этике Гарван института.
- Анестезию мыши, помещая в индукционной камере с 5% ИФ. Отсутствие реакции на хвост и / или ноги щепотку гарантирует, что животное полностью под наркозом.
- Наведите в кадре грызунов стереотаксической оснащен адаптером мыши (Stoelting). Чтобы ориентироваться мыши правильно, поместите внутрь зубами отверстие укуса бар и затяните зажим нос так она уютно. Наведите как можно более прямо в баре, перекусить и нос зажим. Поместите маску из куска латекса на носу мыши, и держать изофлуран на 5% до частоты дыхания мыши составляет примерно 1 вдох / сек. Поверните изофлуран до 1,5 - 2,0%. Закрепите головку с помощью тОн ухо-бары будьте осторожны, чтобы не проколоть барабанную перепонку. Бары должно быть уютно, но не проникает слишком глубоко в ухо каналов.
- Поместите грелку под мышкой.
- Применение глазной мази для предотвращения глаз от высыхания.
- Бритье головы от между ушами до самых глаз с маленькой бритвой или тонкой точке ножницами.
- Очистите и стерилизации кожи головы, вытирая с хлор-hexidine (или бетадин) Скраб следует алкоголя полоскания повторяют 3 раза.
- Чтобы снять кожу над верхней частью черепа делают разрез по средней линии от затылка к глазам.
- Очистите надкостницы к краям разреза скальпелем. При необходимости (в зависимости от экспериментальной мишени), тщательно убрать мускулатуру на задней части шеи щипцами, позволяя мышце рвать вдоль пучков чтобы свести к минимуму кровотечение. Применить gelfoam под кожей головы ткань, чтобы минимизировать влаги и предотвращает кожу от перемещения по черепу.
- Сухой поверхности черепа с ватным наконечником аппликатором, смоченной спиртом для повышения визуализации черепа ориентиры.
- Совместите черепа стандартной стереотаксической координатами 13. Вставьте тонкую точка зонда в держатель электрода и приложить его к стереотаксической микроманипулятора. Заостренным металлическим стержнем хорошо подходит для этой цели (рис. 5).
- Использование точки для определения брегмы (рис. 5а) и лямбда (рис. 5б) на черепе. Перемещение зонда назад и вперед между этими точками, проверки того, что боковой медиальной координат для каждого места отличаются не более чем на 50 мкм. Изменение положения головы по мере необходимости тщательно ослабление слуха, бары, перемещение головы и уха-бары по бокам, и повторной затяжки, ухо-бары.
- Убедитесь, что спинной-вентральная высота в каждом месте, отличается не более чем на 50 мкм. Отрегулируйте высоту нос зажим, который будет вращаться черепа вокруг оси ухо-барами,для выравнивания высоты черепа, если необходимо. Высота уха-баре может также должны быть скорректированы.
- Использование атласа от 13 до определения координат цели интерес (рис. 5) по сравнению с темя. Отметить череп выше цели (например, "X" или использовать тушь с точки четырем углам площади), где краниотомии будет (рис. 5).
3. Головной сообщение и установка заземлением
- Используйте травления гель для очистки черепа. С помощью аппликатора, чтобы вымыть и распространение травления гель на поверхность (10 сек). Промойте водой и тщательно высушите их. Примените грунтовки для стоматологического цемента черепа поверхности с помощью аппликатора. Распределите клей с новым аппликатором. Лечение клей с УФ-свете-пушка (1 цикл).
- Выберите место для основного штифта, дистально на целевой сайт. Тщательно родила маленькое отверстие в черепе с помощью иглы № 65 miniblade скальпель только достаточно широким для коротком конце земли с, чтобы войти и отдохнуть на мозговые оболочки. Заземлением должны быть ориентированы так, что он направлен от брегмы и будущий глава-сообщение (рис. 6а).
- Защита головы сообщение на монтажной панели и блокирует и приложить к микроманипулятора. Перемещая микроманипулятор в трех измерениях, положение головы сообщение на темя, просто касаясь черепа (рис. 6Б). База головной пост должен лежать на черепе.
- Использование датчиков вскрытия, нанесите небольшое количество зубной цемент вокруг головы, должность и заземлением (рис. 6). Нажмите на цемент до обеспечения хорошего контакта с черепом. Примечание: Не используйте слишком много цемента или она не будет укрепляться равномерно. Лечение цемента с УФ-свете-пушка (3-4 циклов с разных углов).
- Применение второго этапа цемента и построить базу вокруг головы-сообщение и охватывать пазы головой сообщение (рис. 6).
4. Краниотомия
- Найдите краниотомии отметка, которая будет частично закрыт на грунт. Используйте # 65 скальпель, чтобы отметить 3 мм х 3 мм, квадрат вокруг этого сайта и применять капли лидокаин уменьшить чувствительность и свести к минимуму кровотечение.
- Сделайте несколько баллов на каждой стороне квадрата (целых 10), стараясь не прорезать кости и в мозг (рис. 7а).
- После того, костный лоскут становится свободным, используйте кончик скальпеля, чтобы вырвать ее, оставив нетронутыми твердой мозговой оболочки (рис. 7б).
- Залить кости воска.
5. После операции
- Выключите газ анестезии и удалите мышь от стереотаксической рамы.
- Используйте ватные аппликатор применять лидокаин мазь вокруг открытые участки кожи, чтобы ослабить шумиху вокруг раны. Используйте другой ватные аппликатор применять Neosporin на открытые участки кожи. Вводите кетопрофен (5 мг / кг внутримышечно или IP на основе предпочтений отдельных IACUC ветеринаров), апослеоперационной анальгетик. Мышь как правило, будет и перемещения через несколько минут после прекращения газа.
- Место мыши в теплой клетке и монитора, пока он не готов вернуться к животному жилья.
- Животное должно быть проверено, по крайней мере один раз в день после того, как оправился от операции. Следите за признаками плохой едой и / или питья и вялым поведением. Если боль подозревают, обеспечивают кетопрофен каждые 24 часов (в той же дозе, как в конце после операции) пока смягчены. Лидокаин можно применять локально на рану, если животное царапин или показывает признаки дискомфорта. Животные обычно выздоравливают после операции без осложнений и боли.
6. Запись и краска инъекций
- Подождите, по крайней мере, один день после того, как голова после операции, прежде чем использовать мышь для записи.
- Место мыши в пену сдерживающее устройство формируется в теле мыши. Мышь уже адаптированы к этому устройству, тем самым уменьшая его тревогу. Типичные адаптацииобращаться с мышью каждый день после отъема и в течение примерно одной недели до операции и эксперименты, поместите курсор в пене устройство в течение 1-5 минут. Приостановить устройства в стереотаксической рамы (рис. 4).
- Безопасные головой сообщение для монтажа панели, которая теперь крепится к стереотаксической рамы (рис. 4).
- Подключение к заземление с провода прекращается с тупым 22-калибровочного наконечника иглы подкожно.
- Удалить кости воска по трепанации черепа. Удаление оболочки, при необходимости с помощью иглы miniblade скальпеля.
- Привод электродов надлежащим стереотаксической место и начать запись (рис. 8). Ибо только электрофизиологических записей, различные электроды могут быть использованы. Выбор электродов зависит от местоположения и типа записи требуется. Выбор электродов для записи бодрствования мышь будет таким же, как то, что исследователь использует в анестезии мыши. Для комбинированной электрофизиологических записей скрасителя / трассирующими инъекций, электродов микропипетки используется 10. Микропипетки наполняется красителя / трассирующими выбора, так что он может быть iontophoretically вводят в конце электрофизиологических экспериментов. Multibarrel электроды могут быть использованы, чтобы фармакологические манипуляции могут быть сделаны. Multibarrel электрод устанавливается на одном микропипетки записи (рис. 8). Эти методы являются стандартными в литературе и не отличаются по сравнению с наркозом проснулся записей.
- Запись может быть сделана в течение 4-5 часов в течение 3-4 дней подряд.
- В конце сессии записи, краска / трассирующими могут быть введены. Потому что нет болевых рецепторов в головном мозге, iontophoretic введения красителя или трассирующими в мозг вряд ли вызовет дискомфорт. Однако после того, электрофизиологические свойства ответ области, где инъекция должна быть сделана характерно, животное может быть под наркозом с ИФ еили инъекций. Это позволит устранить любые потенциальные нежелательные ощущения. Поскольку краситель / трассирующими уже микропипетки, активный и землю провода могут быть включены в электрофизиологической записи настройки для текущего генератора iontophoretically придать красителя / индикатора. Используйте соответствующий протокол для красителей / примеси в электроде. Удалить из животного сдержанность headpost и тела сдержанность и вернуться к своим домом клетки.
- В конце эксперимента, следует соответствующий протокол об эвтаназии и тканей обработки для восстановления места инъекции и маркировки.
7. Представитель Результаты
Успешная установка головного сообщение позволяет экспериментатору записывать одно-и многоквартирных ответы ненаркотизированных, проснись мыши в течение нескольких дней. Удерживающая система обеспечивает стабильное электрофизиологических записей отдельных нейронов в головном мозге. Отличная изоляция отдельных единиц и сильный ответ то стимулы могут быть записаны с той же структуры мозга в течение нескольких дней, например, мышь уступает бугорок (рис. 9А, день один, рисунок 9Б, день второй). С хорошей головой после установки, каждая мышь будет последовательно увязаны с стереотаксического аппарата и мышь стереотаксической атлас, 13 в результате надежной локализации частности ядер головного мозга. Эта надежная локализация позволяет введение красителей и индикаторов в конкретных структурах после нескольких дней записи. Например, для оценки убывания проекции слуховой мозга в слуховой мозга, биотинилированный декстран амин (визуализировать использование диаминобензидина как хромоген) может быть введен в мышь уступает бугорок (рис. 10а) после электрофизиологически определения свойств нейронов реагирования на месте инъекции (на рис. 10А, нейрон был записан с лучшими частоте 51 кГц), а после обработки ткани,nterograde маркировки в противоположной спинной кохлеарные ядра можно было визуализировать и построены (рис. 10б). Микрофотографии с более высоким разрешением могут быть получены для просмотра anterogradely помечены аксонов и терминалов (Рис. 10c).
Рисунок 1.
Рисунок 2.
Рисунок 3.
Рисунок 4.
Рисунок 5.
Рисунок 7. 
Рисунок 8. 
Рисунок 9. 
Рисунок 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Преимущество головой после удерживающей системы для электрофизиологических и нейроанатомических эксперимента у мышей является то, что эксперименты могут быть проведены с ненаркотизированных, проснись мышей, устранение возможного загрязнения ответ из-за обезболивающих препаратов. Кроме того, настройки могут быть использованы в течение нескольких дней, чтобы обеспечить более эффективное использование животных.
Большинство компонентов для руководителя-сообщение можно вне-шельфа. Только голова-сообщение и монтаж аппарата находятся на заказ, оба из которых являются относительно простыми для построения и повторного использования. Если машина магазин не доступен в институте, исследователь может, вероятно, использовать http://www.emachineshop.com/ изготовить необходимые компоненты.
Опытный хирургических навыков не требуется. Хирурги должны быть опытными с тонкой хирургической техники, некоторые из которых лучше всего делать под микроскопом. операция должна быть сделана в асептических условиях. Удаление черепа клапан является наиболее тонкий момент процедуры. Тщательно и аккуратно сделать несколько счетов с помощью скальпеля по 4-х сторон прямоугольника, глядя через операционный микроскоп, череп клапан может быть "выталкивается" с минимальным кровотечением, оставляя нетронутыми твердой мозговой оболочки. Знакомство с основными сосудистой имеет важное значение, как сделать на голову выше основных кровеносных сосудов создает риск нежелательного кровотечения. Потому что наши исследования направлены на слуховой системы, мы избежали использования сверла для выполнения трепанации черепа для того, чтобы свести к минимуму возможность костей проводится внутренняя травма уха.
Важно, чтобы получить передне-задней уровне плоскости и в стереотаксической выравнивание до присоединения головной пост. Эта мера предосторожности гарантирует, что голова будет оставаться на уровне всей экспериментальных исследований и облегчает расположение головного мозга локусов помощью мозга атлас.
палатка "> Для записи, это полезно для обработки мыши на ежедневной основе в течение нескольких дней до операции. Только получение мышь подвергается обработке и сдержанность в пене устройство облегчает больше сессий записи с большим уменьшить напряжение и движение мышь. ключ, чтобы мышь плотно в пене бутерброд. Если животное может двигаться чрезмерно, он стремится бороться постоянно. Если мышь начинает бороться, то лучше прервать запись сессии и забрать на следующий день. движение мыши приводит к большим биопотенциалов в записи, не вызванные стимулами. Они, как правило, большую амплитуду, что потенциалы действия и с перерывами. Движение артефакты могут также быть получены путем записи провода касаются животных. важно обеспечить, что нет никаких проводов касаются животных. В целом, этот метод позволил проводить многочисленные исследования по обработке слуховых и анатомии без использования анестезии.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Поддержке гранта NSF 0920060, NIH грант DC004395, NHMRC грант 1009482, NSW Управление по науке и медицинских исследований, а Гарнетт Passe и Родни Уильямс Мемориальный фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Etch gel for cleaning skull prior to dental cement | Henry Schein | 101-5396 | 12/pk with 1.2 mL syringes |
| Primer for dental cement | Kerr Optibond | 25881 | 8 mL bottle |
| Adhesive for dental cement | Kerr Optibond | 25882 | 8 mL bottle |
| Applicators for dental cement | Kerr Optibond | 24680 | 200/pk |
| Dental Cement | Charisma, Heraeus Kulzer | 66000085 | 4gm Syringe Refill |
| Tungsten Rod (Ground Pin) | A-M Systems | 717200 | 0.010" diameter |
| Economy UV Curing Light | Henry Schein | CU-80 | |
| Head-post | Built in-house | ||
| Mounting bar | Built in-house | ||
| Mounting block | Built in-house | ||
| Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | 902 | |
| Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting Co. | 51625 | |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific, Inc. | 39DP |
References
- Evans, E. F., Nelson, P. G. The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state. Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).
- Joris, P. X. Response classes in the dorsal cochlear nucleus and its output tract in the chloralose-anesthetized cat. J. Neurosci. 18, 3955-3966 (1998).
- Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. J. Neurosci. 25, 5903-5914 (2005).
- Young, E. D., Brownell, W. E. Responses to tones and noise of single cells in dorsal cochlear nucleus of unanesthetized cats. J. Neurophysiol. 39, 282-300 (1976).
- Donoghue, J. P. Contrasting properties of neurons in two parts of the primary motor cortex of the awake rat. Brain Res. , 333-3173 (1985).
- Westby, G. W., Wang, H. A floating microwire technique for multichannel chronic neural recording and stimulation in the awake freely moving rat. J. Neurosci. Methods. 76, 123-133 (1997).
- Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. Cortical neurons sensitive to combinations of information-bearing elements of biosonar signals in the mustache bat. Science. 200, 778-781 (1978).
- O'Neill, W. E., Suga, N. Target range-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat. Science. 203, 69-73 (1979).
- Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat. Science. 203, 270-274 (1979).
- Portfors, C. V., Felix, R. A. 2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse. Neuroscience. , 136-1159 (2005).
- Felix, R. A. 2nd, Portfors, C. V. Excitatory, inhibitory and facilitatory frequency response areas in the inferior colliculus of hearing impaired mice. Hear Res. 228, 212-229 (2007).
- Portfors, C. V., Jonson, K. G., Roberts, P. D. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neuroscience. 162, 486-500 (2009).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd edn, Academic Press. NY. (2007).
