Preparación de un ratón para la grabación de Despierta respuestas neuronales y de inyección de trazadores

Summary

Caracterización electrofisiológica de las respuestas neuronales es importante para entender la función del cerebro y para guiar la colocación de los tintes para el rastreo vía. Sin embargo, muchos estudios se realizan en animales anestesiados. Para entender la función del cerebro sin anestesia, hemos desarrollado un método para registrar las propiedades neuronales de respuesta e inyectar tintes en el ratón despierto.

Abstract

Es bien conocido que la anestesia altera las propiedades neuronales de respuesta en diversas regiones del cerebro. ^13. En el sistema auditivo, las propiedades fundamentales de respuesta de las neuronas del tronco cerebral como el umbral, la especificidad de frecuencia, y las bandas laterales inhibidoras se alteran de manera significativa bajo anestesia ^1-2. Estas observaciones se le solicite fisiólogos a buscar formas de grabar a partir de las neuronas individuales, sin los efectos contaminantes de la anestesia. Un resultado fue una preparación descerebración, donde se secciona el tronco cerebral completamente en el nivel del mesencéfalo ^4. Los inconvenientes de esta preparación es una cirugía formidable, la eliminación de bajar las proyecciones del cerebro anterior, y una incapacidad para utilizar la estimulación sensorial para examinar las estructuras por encima del cerebro medio. Una estrategia diferente ha sido la implantación de conjuntos de electrodos crónicamente a grabar a partir de neuronas individuales y grupos de múltiples unidades, mientras el animal está despierto y / o se comporta de ^5,6 7-9 al ratón ^10-12. Usando este método, somos capaces de llevar a cabo registros electrofisiológicos durante varios días en el ratón anestesiado. Al final de las sesiones de grabación, podemos inyectar un colorante de reconstruir posiciones de los electrodos y los sitios de grabación o se inyecta un trazador de manera que las rutas hacia y desde los lugares de grabación se puede determinar. Este método permite también grabaciones aisladas de neuronas individuales durante varios días sin que los anestésicos de uso.

Protocol

1. Reposacabezas Información general

1. Para montar una hecha a la medida de cabeza después, inserte un 1/16 "de acero inoxidable roll-pin perpendicularmente en un agujero perforado en un 3/32" barra de acero inoxidable en forma de cruz. La pieza vertical de la cabeza-mensaje debe ser de aproximadamente 20 mm y la pieza transversal horizontal de aproximadamente 15 mm. Toque un extremo de la varilla vertical para aceptar un tornillo # 1-72. (Fig. 1).
2. Durante la cirugía y la grabación, la cabeza posterior está fijado en un latón hecha a la medida o barra de montaje de aluminio con un 1-72 # tornillo (Fig. 2). La pieza larga de la barra de montaje debe ser de 90 mm de largo y 5.10 mm de ancho. La cabeza post encaja en un surco en una extensión de 15 mm de la barra de tiempo que tiene un ángulo de 45 grados. Para evitar la rotación de la cabeza, el travesaño de los puestos de cabeza está ubicado en una pequeña ranura en la parte inferior de la barra de montaje.
3. La barra de montaje en la continuación, unido a un bloque de aluminio a la medida de montajeK (Fig. 3). El bloque de montaje es de aproximadamente 30 mm x 30 mm x 25 mm. Este bloque de montaje está unido a un micromanipulador de modo que la posición de la cabeza post puede colocarse con precisión a lo largo de la línea media y en Bregma. El bloque de montaje está hecha de dos piezas encajadas con tornillos. Un recorte en el bloque permite la barra de montaje para deslizarse dentro y se asegura con los tornillos. La barra de montaje es paralelo a la superficie de la mesa. Durante la grabación, asegurar la barra en una costumbre marco estereotáxico (fig. 4). El stereotax está diseñado para montar la barra en la misma posición que en el bloque de montaje durante la cirugía. Esta disposición asegura que el ratón siempre estará alineado con el marco estereotáxico en las sesiones experimentales.
4. Cortar una varilla de tungsteno (diámetro .010 ") a aproximadamente 5 mm de longitud, con aproximadamente 1 mm de doblado a 45 °. Esta varilla sirve como el conector de tierra (fig. 1).

2. Al estereotáxicaignment por una craneotomía

Nota: Todos los procedimientos que se describen a continuación siguen las técnicas quirúrgicas asépticas y han sido aprobados por el Cuidado de los Animales de la Universidad del Estado de Washington y el empleo y el Comité de Ética Animal del Instituto Garvan.

1. Se anestesia el ratón mediante la colocación de una cámara de inducción con isoflurano al 5%. La falta de una reacción a la cola y / o pizca dedo se asegura de que el animal esté totalmente anestesiado.
2. Coloque el ratón en un marco estereotáxico roedores equipado con un adaptador de ratón (Stoelting). Para orientar correctamente el ratón, coloca los dientes en el orificio de la barra de bocado y apriete la pinza de nariz, de manera que quede ajustado. Coloque el ratón lo más recta posible en la barra de bocado y la abrazadera de la nariz. Coloque una mascarilla hecha de un trozo de guante de látex sobre la nariz del ratón, y mantener el isoflurano, el 5% hasta que la velocidad del ratón la respiración es de aproximadamente 1 respiración / seg. Gire el isoflurano al 1,5 - 2,0%. Asegure el cabezal con tque los oídos de los bares con cuidado para no romper la membrana del tímpano. Bares debe ser ajustado, pero no penetra muy profundamente en los canales auditivos.
3. Coloque una almohadilla de calefacción debajo del ratón.
4. Aplicar ungüento oftálmico para evitar que los ojos se sequen.
5. Afeitar el cuero cabelludo de entre las orejas hasta los ojos con una pequeña máquina de afeitar o tijeras de punta fina.
6. Limpiar y desinfectar el cuero cabelludo frotando con clorhexidina (o betadine) matorral seguido por el alcohol enjuague repetido 3 veces.
7. Para quitar la piel sobre la parte superior del cráneo hacer una incisión a lo largo de la línea media de la parte posterior de la cabeza a los ojos.
8. Raspe el periostio a los bordes de la incisión con un bisturí. Si es necesario (dependiendo de destino experimental), cuidadosamente retraer la musculatura en la parte posterior del cuello con fórceps, permitiendo que el músculo se rasga a lo largo fascículos para minimizar el sangrado. Aplicar espuma de gel debajo tejido del cuero cabelludo para reducir al mínimo la humedad y evitar que la piel se mueve sobre el cráneo.
9. Seque la superficie del cráneo con un aplicador con punta de algodón humedecido con alcohol isopropílico para mejorar la visualización de puntos de referencia del cráneo.
10. Alinear el cráneo a la norma estereotáxica coordenadas ^13. Inserte una sonda de punta fina en el soporte del electrodo y colóquelo en el micromanipulador estereotáxica. Una barra de metal afilado funciona bien para este fin (fig. 5).
11. Utilizar el punto de identificar Bregma (fig. 5A) y Lambda (fig. 5B) en el cráneo. Mueva la sonda de ida y vuelta entre estos puntos, comprobando que la coordenada lateral-medial para cada ubicación difiere en no más de 50 m. Vuelva a colocar la cabeza, según sea necesario con cuidado aflojando los oídos-bar, cambio de la cabeza y los oídos de las barras laterales, y volviendo a apretar los oídos de las barras.
12. Verificar que la altura dorsal-ventral en cada ubicación difiere por no más de 50 micras. Ajuste la altura de la nariz-abrazadera, que se gire el cráneo alrededor del eje de las orejas bares,para nivelar el terreno de juego del cráneo si es necesario. La altura de la oreja-bar también puede ser necesario ajustar.
13. Utilizar un atlas ¹³ para identificar las coordenadas de la diana de interés (fig. 5C) relativa a Bregma. Marcar el cráneo por encima del objetivo (por ejemplo, una "X" o el uso de puntos de tinta china cuatro esquinas de un cuadrado), donde una craneotomía se hará (Fig. 5D).

3. Head-post y la instalación de tierra Pin

1. El uso de gel de grabado para limpiar el cráneo. Use el aplicador para fregar y la propagación de gel de grabado sobre la superficie (10 seg). Lavar con agua y seque por completo. Aplicar la imprimación para cemento dental a la superficie del cráneo usando un aplicador. Extienda el adhesivo con el nuevo aplicador. Cure el adhesivo con una pistola de luz UV (1 ciclo).
2. Seleccione una ubicación para la terminal de tierra que es distal al sitio de destino. Cuidadosamente un agujero pequeño en el cráneo con la punta de un bisturí # 65 miniblade lo suficientemente ancha como para la parte corta de la tierra ppara entrar y descansar en las meninges. El conector de tierra debe ser orientado de modo que se está apuntando lejos del bregma y el futuro de cabeza posterior (fig. 6A).
3. Asegure la cabeza después de que la barra de montaje, bloquear y adjuntar a la micromanipulador. Al mover el micromanipulador en tres dimensiones, la posición de la cabeza-después de más de Bregma, acaba de tocar el cráneo (Fig. 6B). La base de la cabeza-post deben estar planos sobre el cráneo.
4. Uso de las sondas de disección, aplique una pequeña cantidad de cemento dental alrededor de la cabeza-post y el pin de tierra (Fig. 6C). Presione el cemento hacia abajo para asegurar un buen contacto con el cráneo. Nota: No utilice cemento en exceso o que no se endurece de manera uniforme. Cura el cemento con una pistola de luz ultravioleta (3-4 ciclos desde múltiples ángulos).
5. Aplicar la segunda etapa de cemento y construir la base alrededor de la cabeza post y cubrir las ranuras de la cabeza-posterior (Fig. 6D).

4. Craneotomía

1. Localizar craneotomía marca de referencia, que será parcialmente oscurecido por el cebador. Utilice un bisturí # 65 para marcar un 3 mm x 3 mm cuadrados en torno a este sitio y aplicar una gota de lidocaína para reducir la sensibilidad y reducir al mínimo la hemorragia.
2. Haga varias partituras a cada lado de la plaza (hasta 10), teniendo cuidado de no cortar el hueso y en el cerebro (Fig. 7A).
3. Una vez que el colgajo óseo se afloja, utilice la punta del bisturí para que levante, dejando intacta la duramadre (Fig. 7B).
4. Cubrir con cera de hueso.

5. Después de la cirugía

1. Apague la anestesia con gas y quitar el ratón de marco estereotáxico.
2. Utilice un aplicador con punta de algodón para aplicar el ungüento de lidocaína en torno a la piel expuesta para amortiguar la sensación alrededor de la herida. Utilice otro aplicador con punta de algodón para aplicar Neosporin a la piel expuesta. Inyectar el ketoprofeno (5 mg / kg IM o IP basada en la preferencia de cada uno de los veterinarios del IACUC) comoun analgésico después de la cirugía. Ratón en general, estará listo y se desplazan dentro de minutos de interrupción de gas.
3. Coloque el ratón en una jaula caliente y el monitor hasta que esté listo para volver a albergar a los animales.
4. El animal se debe comprobar en al menos una vez por día después de que se ha recuperado de la cirugía. Esté atento a signos de falta de apetito y / o alcohol y el comportamiento apático. Si el dolor se sospecha, proporcionar ketoprofeno cada 24 horas (misma dosis que al final de post-cirugía) hasta aliviarse. La lidocaína puede ser aplicada localmente en la herida si el animal se rasca o muestra signos de incomodidad. Los animales se recuperan de una cirugía sin complicaciones ni dolor.

6. Grabación y tinte de inyección

1. Espere por lo menos un día después de la cirugía de la cabeza-post antes de usar el ratón para las grabaciones.
2. Coloque el ratón en un dispositivo de espuma moldeada de restricción al cuerpo del ratón. El ratón ya se ha adaptado a este dispositivo, reduciendo así su ansiedad. La adaptación típica espara manejar el ratón cada día después del destete y durante aproximadamente una semana antes de la cirugía y experimentos, colocar el ratón en el dispositivo de espuma durante 1-5 minutos. Suspender dispositivo en el marco estereotáxico (fig. 4).
3. Segura de cabeza posterior a la barra de montaje, que ahora está fijado al bastidor estereotáxico (fig. 4).
4. Conecte el conector de tierra con un cable terminado con un objeto romo de calibre 22 punta de la aguja hipodérmica.
5. Retire la cera ósea a lo largo de la craneotomía. Retire dura si es necesario con la punta de un bisturí miniblade.
6. Drive electrodo a la localización estereotáxica adecuada y comenzar la grabación (fig. 8). Por sólo registros electrofisiológicos, una variedad de electrodos pueden ser utilizados. La elección del electrodo depende de la localización y el tipo de grabaciones requeridas. La elección del electrodo para las grabaciones de ratón despierto será el mismo que lo que un investigador utiliza en un ratón anestesiado. Por combinados con registros electrofisiológicoscolorante / trazador inyecciones, un electrodo micropipeta se utiliza ^10. La micropipeta se llena con el colorante / trazador de elección para que pueda ser inyectado iontoforéticamente al final de los experimentos electrofisiológicos. Electrodos Multibarrel también se puede utilizar de modo que las manipulaciones farmacológicas puede ser hecho. El electrodo multibarrel se monta sobre una micropipeta sola grabación (fig. 8). Estas técnicas son estándar en la literatura y no son diferentes para las grabaciones anestesiados frente despierto.
7. Las grabaciones se pueden realizar durante 4-5 horas en el transcurso de 3-4 días consecutivos.
8. Al final de la sesión de grabación, el colorante / trazador puede ser inyectado. Porque no hay receptores del dolor en el cerebro, la inyección iontoforético del colorante o trazador en el cerebro es poco probable que cause molestias. Sin embargo, una vez que las propiedades de respuesta electrofisiológicos de la región donde la inyección debe ser hecho se caracterizan, el animal puede ser anestesiados con isoflurano fo la inyección. Esto eliminaría las sensaciones no deseados potenciales. Debido a que el colorante / trazador está ya en la micropipeta, los conductores activos y tierra se puede cambiar desde el registro electrofisiológico puesta a punto para el generador de corriente para inyectar el colorante iontoforéticamente / trazador. Utilizar protocolo adecuado para el tinte / trazador en el electrodo. Retire el animal de la moderación y la contención headpost cuerpo y volver a su jaula.
9. Al final del experimento, seguir el protocolo apropiado para la eutanasia y el procesamiento del tejido para recuperar sitio de la inyección y el etiquetado.

7. Los resultados representativos

La instalación correcta de la cabeza-puesto permite al experimentador para registrar las respuestas individuales y de unidades múltiples de un ratón anestesiado, despierto durante varios días. El sistema de sujeción permite la estabilidad de los registros electrofisiológicos de las neuronas individuales en el cerebro. Excelente aislamiento de las unidades individuales y las respuestas fuertes testímulos o puede ser grabado desde la estructura del cerebro mismo durante varios días, por ejemplo en el ratón colículo inferior (Fig. 9A días, un; Figura 9B, dos días). Con una buena cabeza posterior a la instalación, cada ratón será siempre alineado con el aparato estereotáxico y el ratón estereotáxica atlas, ¹³ que resulta en la localización fiable de los núcleos del cerebro en particular. Esta localización fiable permite la inyección de colorantes y trazadores en las estructuras específicas después de varios días de grabación. Por ejemplo, para evaluar descendiendo proyecciones del mesencéfalo auditivo en el tronco cerebral auditivo, biotinilado dextrano amina (diaminobencidina visualizaron utilizando como cromógeno) puede ser inyectado en el ratón colículo inferior (fig. 10A) después electrofisiológicamente identificar propiedades neuronales de respuesta en el sitio de inyección (en la fig. 10A, una neurona se registró con un mejor frecuencia de 51 kHz), y después de la elaboración de tejidos, unetiquetado nterograde en el núcleo coclear dorsal contralateral se ha visualizado y se traza (Fig. 10B). Fotomicrografías de mayor resolución también puede obtenerse a ver los axones anterógradamente etiquetados y terminales (Fig. 10C).

Figura 1.

Figura 2.

Figura 3.

Figura 4.

Figura 5.

Figura 7.

Figura 8.

Figura 9.

Figura 10.

Discussion

La ventaja del sistema de sujeción de cabeza después de experimentos electrofisiológicos y neuroanatómicos en el ratón es que los experimentos pueden llevarse a cabo con ratones anestesiados, despierta, la eliminación de la contaminación potencial de respuesta debido a las drogas anestésicas. Además, la puesta en marcha se puede utilizar en varios días para permitir el uso de animales más eficiente.

La mayoría de los componentes de la cabeza-post están disponibles fuera de la plataforma. Sólo la cabeza-post y el aparato de montaje son por encargo, los cuales son relativamente fáciles de construir y son reutilizables. Si una tienda de máquina no está disponible en una institución, el investigador puede utilizar probable http://www.emachineshop.com/ para la fabricación de los componentes necesarios.

Competentes habilidades quirúrgicas son necesarias. Los cirujanos deben ser competentes con finas técnicas quirúrgicas, algunas de las cuales se hacen mejor por debajo de un microscopio. La la cirugía debe realizarse en condiciones asépticas. Quitar la tapa del cráneo es el punto más delicado del procedimiento. Mediante una cuidadosa y suavemente haciendo varias partituras con un bisturí a lo largo de los 4 lados del rectángulo, mientras que mirando a través de un microscopio quirúrgico, el colgajo de cráneo puede ser "se desprendió", con sangrado mínimo, dejando intacta la duramadre. La familiaridad con el sistema vascular subyacente es esencial, como haciendo un corte por encima de un vaso sanguíneo principal que crea un riesgo de sangrado no deseado. Debido a que nuestra investigación se centra en el sistema auditivo, hemos evitado el uso de taladros para la realización de craneotomías con el fin de minimizar el potencial de los huesos a cabo el trauma del oído interno.

Es importante para obtener el nivel plano antero-posterior y en la alineación estereotáxica antes de colocar la cabeza a posteriori. Esta precaución se asegura de que la cabeza se mantendrá el nivel en todos los ensayos experimentales y facilita la ubicación de los loci del cerebro utilizando un atlas del cerebro.

tienda "> Para la grabación, es útil para manejar el ratón sobre una base diaria durante unos pocos días antes de la cirugía. El simple hecho de el ratón expuestos a la manipulación y la moderación en el dispositivo de espuma facilita más las sesiones de grabación con el estrés mucho menor y el movimiento de la ratón. La clave es tener el ratón encajar cómodamente en el sándwich de espuma. Si el animal puede moverse demasiado, tiende a luchar de forma continua. Si el ratón comienza a luchar, lo mejor es poner fin a la sesión de grabación y un nuevo repunte de la próxima día. Movimiento de los resultados de ratón en biopotenciales grandes en las grabaciones que no están provocadas por los estímulos. Estos son generalmente mayor amplitud que los potenciales de acción y son intermitentes. artefactos de movimiento también pueden ser generados por los cables de grabación tocando el animal. Es importante para asegurarse de que no hay cables que tocan el animal. En general, esta técnica nos ha permitido llevar a cabo múltiples estudios sobre el procesamiento auditivo y la anatomía, sin el uso de anestésicos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etch gel for cleaning skull prior to dental cement	Henry Schein	101-5396	12/pk with 1.2 mL syringes
Primer for dental cement	Kerr Optibond	25881	8 mL bottle
Adhesive for dental cement	Kerr Optibond	25882	8 mL bottle
Applicators for dental cement	Kerr Optibond	24680	200/pk
Dental Cement	Charisma, Heraeus Kulzer	66000085	4gm Syringe Refill
Tungsten Rod (Ground Pin)	A-M Systems	717200	0.010" diameter
Economy UV Curing Light	Henry Schein	CU-80
Head-post	Built in-house
Mounting bar	Built in-house
Mounting block	Built in-house
Stereotaxic Frame	David Kopf Instruments	902
Mouse and Neonatal Rat Adaptor	Stoelting Co.	51625
Deltaphase Isothermal Pad	Braintree Scientific, Inc.	39DP