Preparazione di un mouse Awake per la registrazione di risposte neurali e iniezione Tracers

Summary

Caratterizzazione elettrofisiologica delle risposte neuronali è importante per comprendere le funzioni cerebrali e per guidare il posizionamento dei coloranti per via tracing. Tuttavia, molti studi sono effettuati in animali anestetizzati. Per capire la funzione del cervello senza anestesia, abbiamo sviluppato un metodo per registrare le proprietà di risposta dei neuroni e iniettare coloranti nel topo sveglio.

Abstract

È ben noto che l'anestesia altera proprietà di risposta neurali in diverse regioni del cervello. ^13. Nel sistema uditivo, le proprietà fondamentali di risposta dei neuroni del tronco encefalico compresa una soglia, la specificità frequenza e bande laterali inibitorie sono alterate in modo significativo sotto anestesia ^1-2. Queste osservazioni richiesto fisiologi a cercare modi per registrare da singoli neuroni senza gli effetti contaminanti di anestesia. Un risultato era una preparazione decerebrate, dove il tronco è stato completamente recisi a livello del mesencefalo ^4. Gli svantaggi di questa preparazione sono un formidabile intervento chirurgico, l'eliminazione di scendere proiezioni del prosencefalo, e l'incapacità di utilizzare la stimolazione sensoriale per esaminare le strutture al di sopra del mesencefalo. Una strategia diversa è stata quella di impiantare cronicamente schiere di elettrodi per registrare da singoli neuroni e cluster multipla mentre l'animale è sveglio e / o si comporta ^5,6 7-9 al mouse ^10-12. Utilizzando questo metodo, siamo in grado di effettuare registrazioni elettrofisiologiche per diversi giorni nel topo non anestetizzato. Al termine delle sessioni di registrazione, si può iniettare un colorante per ricostruire posizioni elettrodi e siti di registrazione o iniettare un tracciante in modo che i percorsi da e verso i loci di registrazione può essere determinato. Questo metodo permette di ben isolate registrazioni singolo neurone per più giorni, senza l'uso degli anestetici.

Protocol

1. Poggiatesta Panoramica

1. Per assemblare una custom-built testa-post, inserire un 1/16 "in acciaio inox roll-pin perpendicolarmente in un foro praticato in un 3/32" tondino di acciaio inox in modo da formare una croce. Il pezzo verticale della testa post dovrebbe essere circa 20 mm e il pezzo trasversale orizzontale di circa 15 mm. Toccare un'estremità dello stelo verticale ad accettare un # 1-72 vite. (Fig. 1).
2. Durante l'intervento chirurgico e la registrazione, il capo-post è fissato in un custom-built in ottone o barra di alluminio di montaggio con un # 1-72 vite (Fig. 2). Il pezzo lungo la barra di montaggio dovrebbero essere circa 90 mm di lunghezza e 5-10 mm di larghezza. Il capo-post si inserisce in un taglio in una scanalatura di estensione 15 millimetri fuori dal lungo bancone che è inclinata a 45 gradi. Per evitare la rotazione della testa, la traversa di testa post incastonato in una piccola scanalatura sulla parte inferiore della barra di montaggio.
3. La barra di montaggio in poi attaccato ad una misura blocco di montaggio in alluminiok (Fig. 3). Il blocco di montaggio è di circa 30 mm x 30 mm x 25 mm. Questo blocco di montaggio è fissata ad un micromanipolatore modo che la posizione della testa-post può essere accuratamente posizionato lungo la linea mediana e Bregma. Il blocco di montaggio è formata da due pezzi fissati insieme con viti. Un cut-out nel blocco permette la barra di montaggio a scorrere in ed essere fissato con le viti. La barra di montaggio è parallela al piano del tavolo. Durante la registrazione, fissare la barra in una cornice personalizzata stereotassico (Fig. 4). Il stereotax è progettato per montare la barra nella stessa posizione nel blocco di montaggio durante l'intervento chirurgico. Questa disposizione assicura che il mouse sarà sempre allineato al telaio stereotassico tra le sessioni sperimentali.
4. Tagliare un'asta di tungsteno (diametro .010 ") a circa 5 mm di lunghezza, con circa 1 millimetro piegato a 45 °. Questa canna funge da perno di terra (Fig. 1).

2. Al stereotassicaneamento per Craniotomia

Nota: Tutte le procedure descritte di seguito sono tecniche standard di asepsi chirurgiche e sono stati approvati dalla Washington State Animal Care University e del Comitato d'uso e l'animale Comitato Etico dell'Istituto Garvan.

1. Anestetizzare il mouse mettendo in una camera di induzione con il 5% isoflurano. La mancanza di una reazione a coda e / o presa punta assicura che l'animale è anestetizzato completamente.
2. Posizionare il mouse in una cornice stereotassico roditore dotato di un adattatore per mouse (Stoelting). Per orientare il mouse in modo corretto, posizionare i denti all'interno del foro della barra morso e stringere la fascetta naso in modo che sia aderente. Posizionate il mouse il più diritto possibile nella barra morso e pinza il naso. Posizionare una maschera fatta da un pezzo di guanto di lattice sul naso del mouse, e mantenere la isoflurano al 5% fino al tasso di respirazione del mouse è di circa 1 respiro / sec. Ruotare il isoflurano a 1,5 - 2,0%. Fissare la testa con tha orecchie-bar facendo attenzione a non forare il timpano. Bar deve essere aderente ma non penetra troppo in profondità nel canale uditivo.
3. Posizionare una piastra elettrica sotto il mouse.
4. Applicare una pomata oftalmica per evitare che gli occhi si asciughi.
5. Shave il cuoio capelluto dalle tra le orecchie fino agli occhi con un piccolo rasoio o forbici a punta fine.
6. Pulire e disinfettare il cuoio capelluto strofinando con cloro-hexidine (o Betadine) scrub seguito da alcol risciacquo ripetuto per 3 volte.
7. Per rimuovere la pelle sopra la parte superiore del cranio praticare un'incisione lungo la linea mediana dalla parte posteriore della testa per gli occhi.
8. Raschiare periostio ai bordi della incisione con un bisturi. Se necessario (a seconda del bersaglio sperimentale), accuratamente ritrarre la muscolatura sul retro del collo con una pinza, permettendo al muscolo di strappare lungo fascicoli per minimizzare sanguinamento. Applicare Gelfoam sotto il tessuto del cuoio capelluto per ridurre al minimo l'umidità ed evitare la pelle si muova sopra il cranio.
9. Asciugare la superficie del cranio con un cotton-punta applicatore inumidito con alcool isopropilico per migliorare la visualizzazione dei punti di riferimento del cranio.
10. Allineare il cranio allo standard stereotassico coordinate ^13. Inserire un fine-point sonda nel portaelettrodo e allegarlo al micromanipolatore stereotassica. Una barra di metallo affilata funziona bene per questo scopo (Fig. 5).
11. Usare il punto per identificare Bregma (Fig. 5A) e Lambda (Fig. 5B) sul cranio. Spostare la sonda avanti e indietro tra questi punti, controllando che la laterale-mediale coordinate per ogni posizione differisce da non più di 50 micron. Riposizionare la testa in base alle esigenze allentando i bar orecchio, spostando la testa e auricolari bar lateralmente, e stringere le barre dell'orecchio.
12. Verificare che il dorso-ventrale altezza in ogni posizione differisce da non più di 50 micron. L'altezza del naso-clamp, che ruoterà il cranio attorno all'asse delle barre auricolari,per livellare il passo del cranio, se necessario. L'altezza dell'orecchio-bar potrebbe anche bisogno di essere regolati.
13. Utilizzare un atlante ¹³ per identificare le coordinate del bersaglio di interesse (Fig. 5C) rispetto al Bregma. Segna il teschio sopra il target (ad esempio, una "X" oppure utilizzare inchiostro di china per dot quattro angoli di un quadrato), dove una craniotomia verrà effettuato (Fig. 5D).

3. Head-post e Pin installazione a terra

1. Utilizzare gel etch per pulire cranio. Usare l'applicatore e la diffusione a macchia gel etch su tutta la superficie (10 sec). Lavare con acqua e asciugare completamente. Applicare il primer per cemento dentale alla superficie cranio con applicatore. Stendere l'adesivo con nuovo applicatore. Curare l'adesivo con una luce UV-gun (1 ciclo).
2. Scegliete una posizione per il perno di terra che è distale al sito di destinazione. Con attenzione portava un piccolo foro nel cranio con la punta di un bisturi miniblade # 65 ampio abbastanza per la fine del breve p terraper entrare e riposare sulle meningi. Il pin di terra deve essere orientata in modo che punta lontano dalla Bregma e futuro testa post (Fig. 6A).
3. Fissare la testa-post alla barra di montaggio e bloccare e fissare al micromanipolatore. Spostando il micromanipolatore in tre dimensioni, posizione della testa-post sul Bregma, sfiora il cranio (Fig. 6B). La base del testa-post deve essere ben disteso sul cranio.
4. Utilizzando sonde dissezione, applicare una piccola quantità di cemento dentale intorno alla testa-post e pin di terra (Fig. 6C). Premere il cemento verso il basso per assicurare un buon contatto con il cranio. Nota: non utilizzare il cemento troppo o non si indurisce in modo uniforme. Curare il cemento con un UV light-gun (3-4 cicli da più angolazioni).
5. Applicare la seconda fase di cemento e costruire la base intorno alla testa post e coprono le scanalature della testa post (Fig. 6D).

4. Craniotomia

1. Individuare la craniotomia tacca di riferimento, che sarà parzialmente oscurata dal primer. Utilizzare un bisturi # 65 a segnare da 3 mm x 3 mm quadrati intorno a questo sito e applicare una goccia di lidocaina per ridurre la sensibilità e ridurre al minimo il sanguinamento.
2. Fai punteggi più su ogni lato del quadrato (fino a 10), facendo attenzione a non tagliare l'osso e nel cervello (Fig. 7A).
3. Una volta che il lembo osseo si allenta, utilizzare la punta del bisturi per sollevare in su, lasciando intatta la dura madre (Fig. 7B).
4. Coprire con cera ossea.

5. Post-operatorio

1. Spegnere l'anestesia gas e togliere il mouse dal telaio stereotassico.
2. Usare un applicatore con punta di cotone per applicare una pomata lidocaina intorno pelle esposta per attutire la sensazione intorno ferita. Utilizzare un altro cotone punta applicatore per applicare Neosporin sulla pelle esposta. Iniettare ketoprofene (5 mg / kg IM o IP in base alle preferenze dei singoli veterinari IACUC) comeun post-chirurgico analgesico. Mouse sarà generalmente alto e che si spostano all'interno minuti di cessazione gas.
3. Posizionare il mouse in una gabbia caldo e il monitor fino a quando non è pronto a tornare alla casa degli animali.
4. L'animale deve essere controllata almeno una volta al giorno dopo ha recuperato da un intervento chirurgico. Attenzione ai segni di mangiare poveri e / o bere e il comportamento apatico. Se il dolore si sospetta, fornire ketoprofene ogni 24 ore (stessa dose alla fine della post-chirurgico) fino alleviata. Lidocaina possono essere applicati localmente sulla ferita se l'animale si gratta o mostra segni di disagio. Gli animali in genere riprendersi da un intervento chirurgico senza complicazioni o dolore.

6. Registrazione e Dye iniezione

1. Attendere almeno un giorno dopo la testa-post intervento chirurgico prima di usare il mouse per le registrazioni.
2. Posizionare il mouse in una schiuma di ritenuta del dispositivo modellato al corpo del mouse. Il mouse è già stato adattato per questo dispositivo, riducendo così la sua ansia. Tipico è l'adattamentoper gestire il mouse ogni giorno dopo lo svezzamento e per circa una settimana prima dell'intervento e esperimenti, posizionare il mouse nel dispositivo schiuma per 1-5 minuti. Sospendere dispositivo nel telaio stereotassico (Fig. 4).
3. Sicura testa posta a barra di montaggio, che è ora fissato al telaio stereotassico (Fig. 4).
4. Collegare al pin terra con un filo terminato con un blunt 22-gauge punta dell'ago ipodermico.
5. Rimuovere cera ossea sopra il craniotomia. Rimuovere dura, se necessario, con la punta di un bisturi miniblade.
6. Guidare elettrodo alla corretta posizione stereotassica e iniziare la registrazione (Fig. 8). Per solo registrazioni elettrofisiologiche, una serie di elettrodi può essere utilizzata. La scelta di elettrodo dipende dalla posizione e il tipo di registrazioni richieste. La scelta di elettrodo per le registrazioni del mouse veglia sarà lo stesso di quello ricercatore utilizza in un mouse anestetizzato. Per combinati con le registrazioni elettrofisiologichecolorante / tracciante iniezioni, un elettrodo micropipetta viene utilizzato ^10. La micropipetta è riempito con il colorante / tracciante di scelta in modo che possa essere iontophoretically iniettato alla fine degli esperimenti elettrofisiologici. Multibarrel elettrodi possono anche essere utilizzati in modo che manipolazioni farmacologiche possono essere fatte. L'elettrodo multibarrel è montato su una micropipetta singola registrazione (Fig. 8). Queste tecniche sono standard in letteratura e non sono diversi per le registrazioni anestetizzati rispetto sveglio.
7. Le registrazioni possono essere effettuate per 4-5 ore per 3-4 giorni consecutivi.
8. Al termine della sessione di registrazione, il colorante / tracciante può essere iniettato. Poiché non ci sono recettori del dolore nel cervello, l'iniezione iontoforetico del colorante o tracciante nel cervello è improbabile da causare fastidio. Tuttavia, una volta che le proprietà elettrofisiologiche di risposta della regione dove l'iniezione è da effettuare sono caratterizzati, l'animale può essere anestetizzato con f isofluranoo l'iniezione. Questo eliminerebbe i potenziali sensazioni indesiderate. Poiché il colorante / tracciante è già in micropipetta, i conduttori attivi e terra può essere commutato dalla registrazione elettrofisiologica set-up al generatore di corrente per iniettare iontophoretically il colorante / tracciante. Utilizzare protocollo appropriato per il colorante / tracciante in dell'elettrodo. Rimuovere l'animale dal vincolo headpost e moderazione del corpo e ritornare alla sua gabbia a casa.
9. Alla fine dell'esperimento, seguite protocollo appropriato per eutanasia e lavorazione dei tessuti per recuperare sito di iniezione e di etichettatura.

7. Risultati rappresentativi

Corretta installazione della testa-post consente lo sperimentatore per registrare le risposte singole e multipla da una non anestetizzato, mouse sveglio più giorni. Il sistema di ritenuta consente stabili registrazioni elettrofisiologiche di singoli neuroni nel cervello. Eccellente isolamento delle singole unità e risposte forti tstimoli o possono essere registrati dalla struttura stessa del cervello più giorni, per esempio nel topo collicolo inferiore (Fig. 9A, giorno uno; Figura 9B, secondo giorno). Con un buon capo-post installazione, ogni mouse verrà costantemente allineato l'apparato stereotassico e il mouse atlante stereotassico, ¹³ con conseguente localizzazione affidabile di nuclei particolare cervello. Questa localizzazione permette affidabile per l'iniezione di coloranti e traccianti in strutture specifiche, dopo giorni di registrazione multipli. Ad esempio, per valutare proiezioni discendenti dal mesencefalo uditivo al tronco cerebrale uditivo, biotinilato destrano ammina (diaminobenzidina visualizzato utilizzando come cromogeno) può essere iniettato nel topo collicolo inferiore (Fig. 10A) dopo elettrofisiologicamente identificare proprietà di risposta neuronali nel sito di iniezione (in fig. 10A, un neurone è stato registrato con un miglior frequenza di 51 kHz), e dopo la lavorazione del tessuto, unoetichettatura nterograde nel controlaterale nucleo cocleare dorsale può stati visualizzati e stampati (Fig. 10B). Microfotografie a più alta risoluzione può essere ottenuto anche per visualizzare assoni anterogradely etichettati e terminali (Fig. 10C).

Figura 1.

Figura 2.

Figura 3.

Figura 4.

Figura 5.

Figura 7.

Figura 8.

Figura 9.

Figura 10.

Discussion

Il vantaggio del capo-post sistema di ritenuta per esperimenti elettrofisiologici e neuroanatomici in mouse è che gli esperimenti possono essere condotti con sveglio non anestetizzati, topi, eliminando una potenziale contaminazione risposta dovuta ai farmaci anestetici. Inoltre, l'allestimento può essere utilizzato per più giorni per consentire l'uso animale più efficiente.

La maggior parte dei componenti per la testa-post sono disponibili off-the-shelf. Soltanto il capo-post ed apparecchi montaggio sono su misura, di cui tutt'e due sono relativamente facili da costruire e sono riutilizzabili. Se un negozio di macchina non è disponibile presso un ente, il ricercatore può utilizzare probabile http://www.emachineshop.com/ per fabbricare i componenti necessari.

Proficient competenze chirurgiche sono necessarie. Il chirurgo deve avere dimestichezza con sottili tecniche chirurgiche, alcune delle quali sono più fatte sotto un microscopio. Il l'intervento chirurgico deve essere fatta in condizioni asettiche. Rimozione del lembo cranio è il punto più delicato della procedura. Con attenzione e delicatezza rendendo più spartiti con un bisturi lungo i 4 lati del rettangolo mentre guardando attraverso un microscopio operatorio, il lembo cranio può essere "spuntato fuori" con sanguinamento minimo, lasciando intatta la dura madre. La familiarità con il sistema vascolare sottostante è essenziale, come fare un taglio di sopra di un vaso sanguigno principale crea un rischio di sanguinamento indesiderato. Perché la nostra ricerca si concentra sul sistema uditivo, abbiamo evitato l'uso delle punte per l'esecuzione di craniotomie al fine di minimizzare il rischio di osso-condotto trauma dell'orecchio interno.

È importante per ottenere il livello antero-posteriore e in allineamento piano stereotassico prima di fissare la testa post. Questa precauzione garantisce che la testa rimane comunque a livello attraverso prove sperimentali e facilita la posizione di loci cerebrali utilizzando un atlante del cervello.

tenda "> Per la registrazione, è utile per gestire il mouse su una base quotidiana per alcuni giorni prima dell'intervento. Basta ottenere il mouse esposto alla gestione e moderazione nel dispositivo schiuma facilita le sessioni di registrazione più lunghi con molta riduzione dello stress e il movimento del mouse. La chiave è di avere il mouse si adattano perfettamente nel panino schiuma. Se l'animale può muoversi eccessivamente, tende a combattere senza soste. Se il mouse comincia a lottare, è meglio terminare la sessione di registrazione e riprendere il prossimo giorni. movimento dei risultati mouse in biopotenziali grandi le registrazioni che non vengono evocati da stimoli. Questi sono generalmente maggiore ampiezza che potenziali d'azione e sono intermittenti. artefatti movimento possono anche essere generati dai fili di registrazione toccano l'animale. È importante per garantire che non ci sono fili che toccano l'animale. Nel complesso, questa tecnica ci ha permesso di condurre studi più sul trattamento uditivo e l'anatomia senza l'uso di anestetici.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etch gel for cleaning skull prior to dental cement	Henry Schein	101-5396	12/pk with 1.2 mL syringes
Primer for dental cement	Kerr Optibond	25881	8 mL bottle
Adhesive for dental cement	Kerr Optibond	25882	8 mL bottle
Applicators for dental cement	Kerr Optibond	24680	200/pk
Dental Cement	Charisma, Heraeus Kulzer	66000085	4gm Syringe Refill
Tungsten Rod (Ground Pin)	A-M Systems	717200	0.010" diameter
Economy UV Curing Light	Henry Schein	CU-80
Head-post	Built in-house
Mounting bar	Built in-house
Mounting block	Built in-house
Stereotaxic Frame	David Kopf Instruments	902
Mouse and Neonatal Rat Adaptor	Stoelting Co.	51625
Deltaphase Isothermal Pad	Braintree Scientific, Inc.	39DP