Summary
מדידת לחץ חדר שמאל (LV) בעכברים עובריים בילוד מתואר. הלחץ נמדד על ידי החדרת מחט מחוברת מתמר מלא נוזלים לתוך LV בהנחיית אולטרסאונד. יש להקפיד לשמור על תפקוד הלב תקין במהלך פרוטוקול הניסוי.
Abstract
לחץ הדם עולה באופן משמעותי במהלך ההתפתחות העוברית ואחרי לידה אצל בעלי חיים בעלי חוליות. בשנת העכבר, זרימת הדם ניתן לזהות 1 סביב יום עובריים (E) 8.5 1. סיסטולי שמאל (LV) החדר הוא 2 מ"מ כספית על E9.5 ו 11 מ"מ כספית על E14.5 2. על אלה באמצע בשלבים עובריים, LV נראה בבירור דרך בית החזה למדידות לחץ פולשניים, כי הצלעות ועור לא מפותחת. בין E14.5 ולידה (כ E21) שיטות הדמיה יש להשתמש כדי להציג LV. לאחר הלידה, כלומר עליית לחץ הדם של 30 - 70 מ"מ כספית מיום הלידה (P) 2-35 3. מעבר P20, לחץ הדם ניתן למדוד עם מצב מוצק צנתרים (כלומר מילר או Scisense). לפני P20, צנתרים אלו גדולים מדי לפיתוח עורקי של העכבר או לחץ הדם יש למדוד את משך מותאם אישית קטטר פלסטיק המחוברים מלאות נוזל מתמרים לחץ 3 או זכוכית micropipettes עו"דכאב כדי סרוו מתמרים לחץ ריק 4.
העבודה האחרונה שלנו הראו כי העלייה הגבוהה ביותר בלחץ הדם מתרחשת במהלך העוברי המאוחרות ועד לתקופה שלאחר הלידה המוקדמת בעכברים 5-7. זו עלייה גדולה בלחץ הדם עשויה להשפיע על השריר החלק הנייד (SMC) פנוטיפ בעורקים מתפתחות להפעיל אירועים mechanotransduction חשובים. המחלה האנושית, שבו תכונות מכניות של עורקים המתפתחות נמצאים בסכנה בשל פגמים חלבונים תאי מטריקס (תסמונת כלומר של מרפאן 8 ו היצרות מסתם אאורטלי Supravalvular 9) שינויים מהירים בלחץ הדם בתקופה זו עשויים לתרום פנוטיפ המחלה וחומרת באמצעות שינויים mechanotransduction אותות. לכן, חשוב להיות מסוגל למדוד את לחץ הדם משתנה במהלך עובריים בסוף שנות ותקופות היילודים בעכברי מודל למחלה האנושית.
אנו מתארים שיטה לחץ LV מדידה בסוףהעוברית (E18) ו המוקדמות לאחר הלידה (P1 - 20) עכברים. המחט מחוברת מתמר מלא נוזלים בלחץ מוכנס לתוך LV בהנחיית אולטרסאונד. הטיפול נלקח כדי לשמור על תפקוד הלב תקין במהלך פרוטוקול הניסוי, במיוחד עבור עכברים עובריים. הנתונים מייצגים מוצגים ואת המגבלות של פרוטוקול הם דנו.
Protocol
1. אולטראסאונד מערכת הלחץ
- להפעיל את מערכת אולטרסאונד על פי הוראות היצרן (770 Vevo, Visualsonics). למלא את החללית המתאימה (גיל E18 - P7 = מודל 708, גיל> = P7 דגם 707B) עם מים מזוקקים להתחבר למערכת אולטרסאונד. מניחים את החללית בדוכן מתכווננת על הכיוון המשוער הדרוש כדי להשיג ראייה ארוכת ציר LV על העכבר רכוב על פלטפורמת הדמיה כך איפקס LV הוא הצביע על הזרוע ההזרקה.
- מערכת הלחץ מורכב מתמר מלא נוזלים בלחץ, מגבר גשר, מערכת נתונים הרכישה ההקלטה נתונים התוכנה (LabChart). חיבורים אלה כוללים 3-way והברזים למיניהם, צינורות, מנעולים luer ו קרסים צינור. מזרק 20 מ"ל מלא מלוחים heparinized 10% שטיפה בקצה אחד. הקצה השני מתחבר מחט וגוף מזרק 3 מ"ל משתנה לשמש מעטפת להחזיק צינורות המחט בזרוע הזרקה (איור 1).
- הר צינורות המחט מעטפת בזרוע הזריקה של מערכת אולטרסאונד. הצמד מתמר הלחץ עמדה טבעת בגובה משוער של פלטפורמת הדמיה. צרף מחט מתאימה לעידן של העכבר (גיל E18 - P3 =, 30G גיל> P3 = 25 גרם) כדי צינורות המחט. מחטים קטנים יותר לקבל סמיך יותר, קשה יותר להתקדם דרך בית החזה, ויש לי זמן תגובה איטי יותר. לפיכך, גודל המחט הגדולה ביותר שמתאים לומן LV משמש בגיל זה.
- מניחים תלולית של ג'ל אולטרסאונד על פלטפורמת הדמיה בזהירות בשורה בדיקה באמצעות מעמד מתכוונן כך את המחט ניתן מתקדמים ישירות תחת במרכז בדיקה הדמיה (איור 2) לתוך הג'ל. המחט צריכה להיות מספיק רחוק מתחת בדיקה לא לנקב את מכסה בדיקה, אבל מספיק קרוב כדי להיות בתוך עומק בדיקה מרחק. במידת הצורך, המחט עשוי להיות כפוף ביד כך שהוא נשאר הדואר המטוס הנכון לאורך כל הנסיעה שלו.
- שמירה על יישור, לחזור בו מחט ולהעלות את החללית הדמיה למקם העכבר על פלטפורמת הדמיה. לשטוף את המחט כדי למנוע כל ג'ל שאולי נכנס עצה.
2. עכבר הכנה
- כל השיטות המוצגות פרוטוקול זה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדי ועדת שימוש. להרדים בהריון בעיתוי (E18) או עכבר בילוד (P1 - 20) על ידי שאיפה מתמדת של 1.5% isoflurane. צינורות שניתן להוסיף חרוט אף תקן כדי להכיל את ראש קטן של עכבר בילוד מוקדם (P1 - 15).
- להבטיח את העכבר על פלטפורמת הדמיה של מערכת אולטרסאונד במצב משכוב הגב עם איפקס LV מצביע לעבר הזרוע ההזרקה. עבור נשים הרות, החל ג'ל אולטרסאונד לנטר את קצב הלב עם גלאי אק"ג המצורף ולהכניס את המדחום בפי הטבעת עבור משוב של טמפרטורת הגוף. עכברים היילודים הם F קטן מדיאו גלאים אלו, ולכן קצב הלב מנוטר במהלך מדידות לחץ וטמפרטורה הגוף נשמר עם מנורת חום חיצוני.
- הסרת שיער מהבטן של האם בהריון או החזה של העכבר צעיר עם קרם מקריח. עכברים היילודים (P1 - 10) לא דורש שום להסרת שיער.
- עבור נשים הרות, לחתוך לפתוח את הבטן באמצעות מספריים הניתוח, מלקחיים מעוגלים. להחצין קרן אחת במקום הרחם ועל גזה טבולה תמיסת מלח חמים. לתמרן בזהירות עובר למצב הנכון לקבל תצוגה parasternal ציר זמן של LV באמצעות בדיקה אולטרסאונד. למדוד את הלחץ עוברים את כל זה בצד לפני להחצין קרן הרחם השני. הרחק את כל העוברים ואת הבטן של האם לחות בתוספת תקופתית של מי מלח חמימים.
3. מדידת לחץ
- מקום prewarmed, ג'ל אולטרסאונד degassed על העכבר עובריים או הילוד. עכברים ילודים שלא היו דepilated צריך כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד שפשף על החזה שלהם לפני ג'ל אולטרסאונד שנותר הוא ליישם כדי לשפר את הצימוד. מנמיכים את החללית הדמיה ולהתאים את זווית פלטפורמת הדמיה לקבל תצוגה אופטימלית parasternal LV ציר זמן. לא לשנות את הזווית של החללית כי יישור מחט יאבדו.
- תוך מעקב אחר תמונה LV על המסך אולטרסאונד, לאט לקדם את המחט עד שהוא קרוב לתחתית של החללית. לשנות את מיקום המחט בדיקה, אם יש צורך בכך, כדי לתקן משמרות יישור. לשטוף בעדינות את המחט עם מי מלח. הפעל לחץ הנתונים הקלטה ואפס מתמר לחץ עם תוכנת LabChart. מתמר נסחף עם טמפרטורה עמדה, ולכן חשוב לאפס אותו לפני מדידת לחץ כל עכבר.
- לאט לאט לקדם את המחט עד שניתן לראות בקצה התמונה אולטרסאונד, אך עדיין לא LV. לשנות את מיקום המחט, במידת הצורך, כדי להזין את LV באיפקס. לשנות את מיקום החללית, במקרה הצורך, כדי לשמור על תמונה ברורה של המחט. לקדם את המחט לתוך לומן LV (איור 3), בעת הקלטת נתונים בלחץ וניטור מיקום המחט על תמונת אולטרסאונד. תחילת ההקלטות pulsatile מ מתמר לחץ מאשרת את המיקום בתוך לומן LV (איור 4).
- אם המחט נראה ב לומן LV, אבל הקלטות הלחץ לא pulsatile, סומק עם ברז אור על הבוכנה במזרק, רק עד להגביר את הלחץ מזוהה (כ 5-10 בנפח μL). זה אמור לנקות את כל כפכפים שניתן למנוע קריאה מדויקת. אם קריאות הלחץ עדיין לא pulsatile, המחט עשוי להיות מעל או מתחת למישור הנכון ולא להיות מוכנס לתוך לומן LV. חוזר בי את המחט, לשטוף עם מי מלח, ו מראש שוב. אם קריאות pulsatile עדיין לא השיג, לעבור העכבר הבא. השתמש מחט חדשה כל עכבר.
- קריאות לחץ מוצלחים ניתן לקבל 75%עכברים עובריים בילוד ניסו. קריאות צריך לקחת 5 - 10 דקות כל אחד והנתונים לחץ על העכבר אין לכלול אם קצב הלב שונים משמעותית מהצפוי (5 א 'איור). קצב לב יש השפעה משמעותית על צעדים לב וכלי דם קצב הלב שינו מעידים על מצוקה של הלב. מצוקה עוברית מתרחשת בדרך כלל 1 - 1.5 שעות לאחר החצנה הראשונה של הרחם, ולכן המהירות חשובה למדידת הלחצים המלטה שלמה.
4. נציג תוצאות
כל התוצאות המוצגות הן עבור עכברים C57BL6J. הדימוי של המחט לומן LV על העכבר P1 ב שמוצג באיור 3. מחט יש צורך לנקב את דופן בית החזה ולהשיג גישה קטן LV לומן, אבל זה מגביר באופן משמעותי את זמן התגובה של המערכת בלחץ. כאשר עלייה לשלב משוער בלחץ מוחל באופן ידני למערכת, זמן להגיע 67% מהלחץ המקסימלי הוא 0.067 SEג עם צינור בלבד (רוב מעיד סביר של זמן אמיתי ליישם את הצעד לחץ), 0.105 שניות עם מחט 25 G ו - 0.529 שניות עם מחט 30 G. עיכוב להגיע הלחץ המרבי ניתן לראות את עקבות שלמים המוצגים 4A הדמות 4C. למרות זמן התגובה הוא איטי יותר עם מחט 30G, צורת הגל נתפס טוב יותר בשלבים עובריים בילוד מוקדם, כי קצב הלב עולה עם הגיל בעכברים 5. למרות מגבלה זו, לחץ סיסטולי ניתן לחשב בהנחה נכון LV הלחץ הדיאסטולי (מינימום) הוא אפס, ואת הלחץ (מרבי) סיסטולי LV פי שניים בלחץ הממוצע LV נקבע מתוך קריאה על מצב יציב (איור 4 ב ו - 4D ) 6. מקובל להניח כי LV הסיסטולי ולחצים העורקים שווים. הלחצים נמדד קצב הלב ומחושב LV עבור הגילאים השונים בין E18 ו P14 מוצגות באיור 5.
באיור 1. תמונה של מתמר לחץ עם 3 כיווני והברזים למיניהם מצורפים, זכר (M) ונקבה (ו) חיבורי luer לנעול, קרסים צינור, צינורות, מזרקים, מחטים.
איור 2. תמונה של הקים כדי ליישר את המחט עם בדיקה הדמיה (א '). פלטפורמת הדמיה הוא הסתובב כך איפקס LV של העכבר עומד בפני הזרוע ההזרקה. החללית הוא רכוב על דוכן מתכוונן על הכיוון המשוער הדרוש כדי להשיג תמונה רב ציר LV. מעטפת צינורות מחט הוא רכוב בזרוע הזריקה. מחט הוא התקדם לתוך תלולית של ג'ל אולטרסאונד על פלטפורמת ההדמיה כדי לקבוע את הזווית הנכונה למצב אנכי ואופקי ביחס בדיקה הדמיה (ב ').
איור 3. תמונה של המחט (N) התקדם דרך בית החזה (CW) ולתוך לומן LV ב העכבר P1. סרגל קנה מידה = 0.1 מ"מ.
איור 4. Pulsatile דוגמה לחץ קריאות כמו מחט נכנס LV של E18 (א) ו - P14 (C) העכבר. יש עיכוב להגיע למצב יציב בשל זמן התגובה של המערכת עם המחט מחוברת. צפיות זום של קריאות על מצב יציב מוצגים ב 'הערה ד' כי המינימום E18 לחצים LV הם כמעט לאפס, אבל צורת גל מלא מאפס הלחץ המקסימלי לא ניתן להקליט את קצב הלב גבוה יותר של p14 בעכברים. הלחצים מתכוון נמדדות על פי הקריאות המצב היציב ואת ההנחה היא כי LV הלחץ הסיסטולי = 2 x נמדד הלחץ אומר.
איור 5 קצב הלב נמדד (א) ומחושב סיסטולי לחצים LV (ב) - E18. P14 עכברים. N = 7 עבור E18, 5 עבור P1, P3 על 22, 23 ו 16 של P7 על P14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה למדידת לחץ LV ב עובריים בסוף שנות ועכברים בילוד מוקדם. המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה הוא הפתרון הזמני של המערכת לחץ. אותות הלחץ דיכא כפי שהוא נוסע מ LV באמצעות מחט כדי מתמר, ורק אומר ערכי לחץ ניתן להקליט. דעיכת ניתן למזער באמצעות מחט הגדול ביותר האפשרי, אבל המחט חייב להתאים לומן LV על עכברים בגיל שונים. בגלל הלחץ הדיאסטולי ניתן מקורב כמו אפס, LV ואת הלחץ הסיסטולי עורקים וכתוצאה מכך ניתן לחשב את המידות מתכוון LV לחץ. אף על פי משתנים נוספים העורקים יהיה אידיאלי (כלומר לחץ הדופק), הלחץ הסיסטולי מספק מידע רב ערך על הכוחות המופעלים על מערכת לב וכלי דם במהלך התפתחות העכבר. היתרונות של פרוטוקול זה הם, קלות מהירות הדירות של המדידות עבור throughpu גבוהההשוואה לא של גנוטיפים שונים או עכבר פרוטוקולי הטיפול. על ידי מדידת לחץ סיסטולי בשלבים התפתחותיים קריטיים, אנחנו יכולים להתחיל להבין את יחסי הגומלין בין כוחות מכניים ואת המבנה לב וכלי דם וכתוצאה מכך תפקוד המחלה האנושית.
מצב מוצק צנתרים נחשבים תקן הזהב עבור מדידות לחץ ויש להם פתרון זמני מעולים לעומת מלאות נוזל מתמרים. הגדלים הסטנדרטיים של מצב מוצק צנתרים עכבר הם 1.0F (0.33 מ"מ, מילר), 1.2F (0.4 מ"מ, Scisense) או 1.4F (0.47 מ"מ, מילר). נקבל טובים קריאות לחץ הדם בעכברים מעל P21 עם קטטר Scisense 1.2F ו p30 בעכברים עם קטטר 1.4F מילר. ניסינו את הקטטר 1.0F מילר ב p14 בעכברים, אך לא קיבל עקביות קריאות לחץ הדם. ב p21 בעכברים, השווינו מדידות לחץ סיסטולי שלנו LV עם לחצים עורקיים של קטטר Scisense 1.2F. מחושב הדם הסיסטולי LVלחץ (67 ± 5 מ"מ כספית) עבור כל העכברים היה באופן עקבי נמוך יותר מאשר הלחץ הסיסטולי בעורקים (87 ± 9 מ"מ כספית) והיה קרוב מאוד בלחץ העורקי הממוצע (65 ± 8 מ"מ כספית) נמדד עם קטטר מצב מוצק, אבל שני צנתרים זוהו הבדלים משמעותיים בין גנוטיפים 5. מסיבה זו, מומלץ בשיטה המתוארת LV הלחץ רק E18 ל P20 עכברים. משך פלסטיק צנתרים יכול להיות מצורף מלאות נוזל מתמרים לחץ והתקדם דרך עורק הצוואר להשיג מדידות לחץ הדם 3. אולם, מערכת זו עדיין רק רשומות אומר מדידות הלחץ בידינו היה זמן רב יותר היה שיעור כישלון גבוה יותר מאשר מדידות לחץ LV המוצג כאן. סרוו-null מערכות לחץ (מכשירי העולם דיוק) יש רזולוציה גבוהה יותר למדידת לחצים קטנים יש פתרון זמני טוב יותר 4. עם זאת, שרת-null מערכות דורשים micropipettes מוליכים, בדרך כלל glהתחת, על הכניסה לאתר מדידה שלא ניתן לקדם את בית החזה של עכברים מבוגרים.
השפעת הרדמה יש לקחת בחשבון כאשר חיוץ אלה מדידות לחץ לעכברים ערים. הוכח כי isoflurane היא הבחירה הטובה ביותר עבור מזעור תופעות קרדיו 10 ואם כל העכברים נמצאים בהרדמה עם אותה שיטה, השוואות בין קבוצות שונות תהיה תקפה. העכברים עובריים בילוד הם קטנים מדי אק"ג רגיל בדיקות הטמפרטורה על פלטפורמת הדמיה. קצב הלב צריך להיות פיקוח על ההקלטות לחץ ועל ידי הדמיה של LV להכות על המסך אולטרסאונד. כל העכברים המראים קצב הלב איטי מאוד יכול להיות במצוקה לב שאין לכלול בניתוח את הלחץ. העכברים יש לשמור על חם עכברים עובריים יש לשמור על לחות לאורך כל פרוטוקול הניסוי. חוקרים אחרים עיצבו שיטות להשקיע את עוברים Salin פיזיולוגי חםדואר לאורך כל התקופה הדמיה 11, אבל מצאנו כי מנורת חום יישום קבוע של מי מלח חמים יש בהם כדי לשמור על עוברים בריאים עם קצב הלב הצפויים בתקופת זמן קצרה הניסוי. כל עוד זמן החשיפה נשמר עד שעה 1 בערך, אנחנו לא נצפתה שונות משמעותית בין העובר הראשונה והאחרונה למדוד, אבל את המדידות יש לבצע במהירות כדי לאסוף נתונים על החול כולו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה, בין השאר, על ידי NIH מענקים HL087653 ו HL105314. כמה שיטות פותחו במעבדה של ד"ר רוברט Mecham באוניברסיטת וושינגטון בית הספר לרפואה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High resolution ultrasound system | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | Or other appropriate ultrasound system |
| High frequency ultrasound probes | VisualSonics, inc. | 708 and 707B | |
| Imaging platform and injection arm | VisualSonics, inc. | Imaging Station 2 | With ECG and temperature feedback control of platform |
| Pressure transducer | ADInstruments | MLT 844 | |
| Bridge amplifier | ADInstruments | ML221 | |
| Data acquisition system | ADInstruments | ML866 | |
| Data recording software | ADInstruments | LabChart | |
| Ring stand and clamp | Various | To hold pressure transducer during measurements | |
| 3-way stopcocks with luer connections, male lock | Cole-Parmer | 30600-02 | |
| 1/16" ID Tygon Tubing | Cole-Parmer | 06408 | |
| Male and female luers w/ 1/16" hose barb | Cole-Parmer | 45510-50 45510-00 | |
| 24" tubing with male and female luer at each end | Cole-Parmer | 30600-60 | |
| 3 and 10 mL syringes | BD Biosciences | ||
| 30 and 25G needles | BD Biosciences | 1.5 inches in length | |
| Big Ben manometer | Riester | 1456-100 | |
| Saline | Various | ||
| Heparin | Various | ||
| Ultrasound gel | Parker Hannifin Corporation | Aquasonic 100 | |
| Hair remover lotion | Nair |
References
- Ji, R. P. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ. Res. 92 (2), 133-135 (2003).
- Ishiwata, T., Nakazawa, M., Pu, W. T., Tevosian, S. G., Izumo, S. Developmental changes in ventricular diastolic function correlate with changes in ventricular myoarchitecture in normal mouse embryos. Circ. Res. 93 (9), 857-865 (2003).
- Huang, Y., Guo, X., Kassab, G. S. Axial nonuniformity of geometric and mechanical properties of mouse aorta is increased during postnatal growth. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 290 (2), H657-H664 (2006).
- Ishii, T., Kuwaki, T., Masuda, Y., Fukuda, Y. Postnatal development of blood pressure and baroreflex in mice. Auton. Neurosci. 94 (1-2), 34-41 (2001).
- Le, V. P., Knutsen, R. H., Mecham, R. P., Wagenseil, J. E. Decreased aortic diameter and compliance precedes blood pressure increases in postnatal development of elastin-insufficient mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2011).
- Wagenseil, J. E. Reduced vessel elasticity alters cardiovascular structure and function in newborn mice. Circ. Res. 104 (10), 1217-1224 (2009).
- Wagenseil, J. E. The importance of elastin to aortic development in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (2), H257-H264 (2010).
- Ramirez, F., Sakai, L. Y., Rifkin, D. B., Dietz, H. C. Extracellular microfibrils in development and disease. Cell. Mol. Life Sci. 64 (18), 2437-2446 (2007).
- Li, D. Y. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum. Mol. Genet. 6 (7), 1021-1028 (1997).
- Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. Jr Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282 (6), H2134-H2140 (2002).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60 (1), 14-21 (2006).
