Summary
الأسلوب يحدد الاجراءات التي من الحبار قصير الذيل هاواي،
Abstract
تم العثور على بكتيريا محددة بالتعاون مع الأنسجة الحيوانية 1-5. هذه المضيفة للبكتيريا الجمعيات (symbioses) يمكن أن يكون ضارا (الممرضة)، ليس لديهم نتيجة للياقة البدنية (commensal)، أو أن تكون مفيدة (المنفعة المتبادلة). بينما تم إيلاء اهتمام كبير للتفاعلات المسببة للأمراض، ولا يعرف سوى القليل عن العمليات التي تملي اكتساب استنساخه من المفيد / commensal البكتيريا من البيئة. وتبادل المنافع والمصالح للضوء الجهاز بين هذه البكتيريا سالبة الجرام البحرية V. fischeri وهاواي قصير الذيل الحبار، E. scolopes، يمثل التفاعل محددة للغاية في أي واحد مضيف (E. scolopes) يؤسس علاقة تكافلية مع واحد فقط الأنواع البكتيرية (ف. fischeri) طوال فترة من عمر البطارية 6،7. تلألؤ بيولوجي التي تنتجها V. fischeri خلال هذا التفاعل يعطي فائدة لمكافحة المفترسة إلى E. scolopes خلال الأنشطة الليلية 8،9، في حينالنسيج المضيف الغنية بالمغذيات ويوفر V. fischeri مع مكانة المحمية 10. خلال كل جيل المضيفة، وخصت هذه العلاقة، ويمثل بالتالي عملية يمكن التنبؤ بها والتي يمكن تقييمها بالتفصيل في مراحل مختلفة من التنمية التكافلية. في المختبر، والحبار الأحداث يفقس aposymbiotically (uncolonized)، وإذا تم جمعها في غضون الدقائق ال 30-60 الأولى، ونقل إلى المتكافل خالية من المياه، لا يمكن إلا من قبل المستعمر اللقاح التجريبي 6. هذا التفاعل يوفر بالتالي نظام نموذجا مفيدا في أي لتقييم الخطوات الفردية التي تؤدي إلى اكتساب المحددة لميكروب التكافلية من البيئة 11،12.
نحن هنا وصفا لطريقة لتقييم درجة من الاستعمار الذي يحدث عندما فقست حديثا E. aposymbiotic ويتعرض scolopes إلى (الاصطناعي) التي تحتوي على مياه البحر V. fischeri. هذا الفحص بسيط يصف التلقيح، العدوى الطبيعية، والانتعاشمن المتكافل البكتيرية من الجهاز ضوء الوليدة من E. يؤخذ scolopes. العناية لتوفير بيئة متناسقة لهذه الحيوانات خلال تطوير التكافلية، وخاصة فيما يتعلق بنوعية المياه والعظة ضوء. أساليب لتحديد خصائص السكان التكافلية صفها وتشمل (1) قياس التألق الحيوي جرثوميا المشتقة، و (2) مستعمرة مباشرة عد من المتكافلة استردادها.
Protocol
1. إعداد قائح البكتيرية
- اليوم 0
قبل يومين من التلقيح الحبار، لوحة سلالات بكتيرية ذات الصلة على LBS 13 أجار. - احتضان البكتيريا في 25-28 درجة مئوية خلال الليل.
- اليوم 1
تطعيم 3 رطل مل المتوسطة في كوب أنبوب الثقافة مع واحد من كل مستعمرة V. fischeri سلالة للعدوى. إعداد تكرار مثل أنابيب احتياطية. - اليوم 2
(تنسيق الخطوات البكتيرية 1،4-1،6 مع خطوات الحبار 3،7-3،10)
1 ساعة قبل التلقيح، والبكتيريا ثقافة فرعية 1:80 (37.5 ميكرولتر) إلى LBS مل 3 في أنبوب من الزجاج والثقافة، وتنمو لمدة 1 ساعة مع التهوية. - قياس OD 600 من العينة قبل التلقيح. قياسات نموذجية وفقا 0،3-0،6 على السلالة.
- للحصول على اللقاح الهدف من 3-5 × 10 3 كفو / مل حساب حجم اللقاح على النحو التالي: حجم اللقاح (ميكرولتر) = 1.25 / OD 600 (على سبيل المثال، للحصول على التطوير التنظيمي 600 = 0.5، وحجم اللقاح محسوب = 1.25/0.5 = 2.5 ميكرولتر). يضاف هذا المبلغ مباشرة إلى مياه البحر التي تحتوي على الحبار في الخطوة 4.1. قد يكون هذا الحساب يجب أن يتم تعديلها لسلالات مختلفة من V. fischeri أو للتلقيح عند مستويات أدنى أو أعلى من تلك المحددة هنا.
2. إعداد لوحات أجار للتعداد قائح
- لكل معاملة، والتسمية LBS لوحات (2 في العلاج) إلى لوحة عينات من اللقاح في الخطوة 4.1.
- إضافة 5 حبات تصفيح معقم لكل لوحة.
3. مجموعة من الأحداث الحبار
- قياس ملوحة المحيط فورية باستخدام مقياس الإنكسار وضبط إلى 35 ‰.
- تصفية 1 لتر من المحيط فورية باستخدام وحدة الترشيح وجود خط فراغ المرفقة أو مضخة فراغ، لتوليد فلتر تعقيم فورية المحيط (FSIO). الأوكسجين في المياه قبل يحوم بقوة إلى كل صرفها. اليمكن إعادة استخدامها ه مرشح وحدة لمدة 2 ايام.
- قسامة 40-50 مل من FSIO في كل من اثنين (2) السلطانيات عينة يمكن التخلص منها. ملصق واحد كما earlies واحد كما timelies.
- يعد وجود فائض من الماصات نقل من البلاستيك للحصول على الحبار الأحداث من خلال خفض ماصة ما يقرب من 1 سم من الحافة، وفوق التلال أدنى (انظر الشكل 3). هذا يسهل مساحة أوسع من خلالها الحبار يمكن أن تمر على جمع. تجاهل أي الماصات نقل التي يوجد فيها سطح خشن عرضة للخطر.
- باستخدام الماصة نقل معدة سلفا، وجمع E. scolopes التي تحاك بين عشية وضحاها، ونقل إلى وعاء من earlies FSIO. وكانت سلحفاة صغيرة في وقت مبكر من نظام البيض لأكثر من 1 ساعة وتكون عرضة للتلوث من قبل الاستعمار V. fischeri في نظام البيض. لا تستخدم earlies للتجارب الاستعمار الحساسة.
- تحقق الدبابات بيضة كل دقيقة 30-45 لسلحفاة صغيرة جديدة. ضمان أن يتم مسح جميع سلحفاة صغيرة خلال كل جهيك. سلحفاة صغيرة مع إزالة ماصة، ونقل وديعة في وعاء من timelies FSIO. الحيوانات التي تم جمعها في الوقت المناسب غير متوفرة للتجارب الاستعمار.
- عندما انتهى جمع (~ 45 دقيقة بعد غروب الشمس)، ونقل الحبار إلى المختبر الرئيسي. تجريبيا فإنه من المفيد لاستعمار الحيوانات تحت ظروف الإضاءة دون انقطاع المخبرية اللازمة للتحصين ح 3.
- لكل معاملة، وإعداد وعاء مع FSIO مل 40. إضافة إلى الحبار الطاسات لفحص (الحد الأقصى ن = 40 في وعاء).
- إعداد وعاء إضافية كعنصر تحكم (السلبية) aposymbiotic.
- إعداد ماصة مخصصة لنقل كل معاملة.
- الموت ببطء الحبار اضافية في الإيثانول بنسبة 2٪.
4. الحبار الاستعمار
- اليوم 2 - استخدام Pipetman P10، صرف قسامة محسوب من البكتيريا (الخطوة 1.5) في كل وعاء الحبار (الخطوة 3.8) عن كل معاملة. بدء الموقت H 3 على الفور بعدمن التلقيح الأول.
- لكل معاملة، وخلق "دوامة" في وعاء مع ماصة نقل مخصصة عن طريق وضع ماصة بالقرب من حافة وعاء وpipetting صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط المياه والحبار لحوالي 10 ثانية. خلط شامل أمر بالغ الأهمية.
- لوحة 50 ميكرولتر من كل وعاء على طبق آجار رطل من الخطوة 2.2 (لأسباب تقنية مكررات، لوحة لوحات كل منهما 50 ميكرولتر لكل معاملة). احتضان في 25-28 درجة مئوية خلال الليل.
- إعداد الأطباق غسيل (100 مل FSIO / EA) عن كل معاملة.
- تعد ذبابة الفاكهة قارورة (4 مل FSIO / EA) لكل الحبار.
- بعد 3 ساعات بالضبط، ونقل إلى الحبار غسيل الاطباق ومنها (كامل لكافة أنواع المعاملة). هذا يتوقف على التلقيح.
- والمضي قدما لنقل كل فرد الحبار إلى قارورة فيها ذبابة الفاكهة الخاصة مع FSIO. استخدم ماصة مخصصة لنقل كل معاملة.
- نقل الصواني من قوارير ذبابة الفاكهة إلى مرفق الحبار للعودة الى يوم / ندورة ضوء ight شهدت هذه الحيوانات خلال مرحلة التطور الجنيني.
- يوم 3 - إعداد ذبابة الفاكهة قارورة (4 مل FSIO / EA) لكل الحبار.
- قبل الغسق في 22-24 ساعة تلقيح ما بعد، نقل كل الحبار إلى قارورة ذبابة الفاكهة الجديدة. استخدم ماصة مخصصة لنقل كل معاملة.
- إعداد وصفت 1،5 أنابيب microcentrifuge مل (1/squid) - يوم 4.
- قبل الغسق في 46-48 ح التدبير، في مرحلة ما بعد التلقيح وتسجيل كل من التألق الحبار في قارورة ذبابة الفاكهة (مجموعة luminometer للتكامل 6 ق، وعلى إغلاق غطاء السيارات للقراءة).
- كوسيلة لمراقبة سلبية على خلفية التألق، وقياس قارورة مع FSIO التي لا تحتوي على أي الحبار.
- نقل كل الحبار في وبلغ حجم التداول نحو 700 ميكروليتر إلى أنبوب مل microcentrifuge 1،5 من 4،12 الخطوة. الانتقال إلى مربع المجمد من الورق المقوى. مرة واحدة يتم وضع غطاء على مربع، لا إزالته كما اشارات ضوء لطرد البكتيريا ليست أهلا وسهلاL-مفهومة.
- تجمد أنابيب microcentrifuge في -80 درجة مئوية خلال الليل.
5. تحديد مستويات الاستعمار
- لكل والحبار، وإعداد اثنين من أنابيب microcentrifuge (2)، ولكل منها 475 FSIO ميكروليتر (أو تعقم المحيط الفوري 70٪).
- إعداد المدقات باستخدام لأول مرة Kimwipe لتنظيف مدقة وإزالة الأنقاض الإجمالي و / أو الأنسجة.
- مكان المدقات تلميح إلى أسفل في دورق 50 مل يحتوي على الايثانول بنسبة 95٪. ينبغي أن يضاف إلى الإيثانول على ارتفاع ما يقرب من 3 سم.
- لكل مدقة، وإزالة من الدورق وامسح رأس مع Kimwipe.
- تراجع المدقه مرة أخرى في حمام الايثانول، لإزالة وإدراج (نصيحة متابعة) الى microcentrifuge رف أنبوب، والسماح للتعبير جاف تماما لحوالي 15 دقيقة.
- الحبار ذوبان في microcentrifuge رف أنبوب (الحد الأقصى ن = 8).
- إذا كان ذلك ضروريا، ضبط حجم الصوت إلى 700 ميكروليتر.
- استخدام مدقة من الخطوة 5.5، تعطيل أنسجة الحيوانات حتى الحبر كيس روبتوريس (الماء سوف يتحول لون رمادي مظلم).
- إزالة مدقة، وضمان جميع الأنسجة يبقى في الأنبوب.
- دوامة لفترة وجيزة الأنسجة لبالضبط 10 ثانية (استخدام جهاز توقيت).
- السماح للنسيج للراحة لمدة 10 دقيقة. وسوف تستقر في الأنسجة، والبكتيريا والحبر تبقى في حل. للحسابات التي تتبع، والبكتيريا / حل الحبر هو [A] تخفيف (أي ضوء scolopes E. جناسة الجهاز في 700 ميكرولتر). التخفيفات 1:20 مسلسل ([B]، [C]) وصفها أدناه.
- لتخفيف [B]، أضف 25 ميكرولتر [A] إلى واحدة من أنابيب microcentrifuge أعدت في الخطوة 5.1. دوامة.
- لتخفيف [C]، أضف 25 ميكرولتر [B] إلى واحدة من أنابيب microcentrifuge أعدت في الخطوة 5.1. دوامة.
- لوحة 50 ميكرولتر من كل تخفيف على أجار LBS، 2 مكررات لكل معاملة.
- احتضان لوحات في 25-28 درجة مئوية خلال الليل.
6. تحليل البيانات
- لحساب CFU / الجهاز ضوء (LO)، اشعرتي المستعمرات على لوحة لكل معاملة في المستعمرات التي 10-400 موجودة، واستخدام الصيغة المناسبة:
CFU / LO = (المستعمرات في لوحة [A]) × 14؛ أو
CFU / LO = (المستعمرات في لوحة [B]) × 280، أو
CFU / LO = (المستعمرات في لوحة [C]) × 5600. - رسم نقاط البيانات الفردية والوساطات على مقياس لوغاريتمي.
- غالبا ما تكون البيانات التي لم يتم توزيعها بشكل طبيعي، مع تباينات مختلفة، والقيم المتطرفة قد تحتوي على معلومات ذات معنى من الناحية البيولوجية. لذلك، غير بارامترية الاختبارات توفر طريقة مفيدة لتحديد ما إذا كانت العلاجات تختلف اختلافا كبيرا.
- استخدام البرمجيات GraphPad بريزم للتحليل الإحصائي. لاثنين من العلاجات، واستخدام المبلغ رتبة اختبار يلكوكسون. لإجراء مقارنات بين أكثر من اثنين من العلاجات، واستخدام اختبار كروسكال واليس، مع مناسبة الاختبارات اللاحقة.
7. ممثل النتائج
وأظهرت نتائج فحص عينة من الاستعمار في الشكل 4. سلالتين من
الرسم البياني رقم 1 التدفق. الإجراء الاستعمار. ويتم حصاد البكتيريا والحبار على حدة، ثم يخلط في اللقاح المحدد. تغسل الحبار، ثم نقل إلى مياه جديدة في 3 ساعات، 24 ساعة، و 4 8 تطعيم آخر ساعة. بعد 48 ساعة يتم قياس التألق ويتم تجميد هذه الحيوانات، والذي يعمل على سطح تعقيم الحيوانات. استعمرت الخفيف الجهاز البكتيريا لا تزال قابلة للحياة على -80 درجة مئوية من خلال واحدة ذوبان (أي إضافية تجميد ذوبان دورات).
الرسم البياني رقم 2 التدفق. يوضح التجانس وتصفيح التخفيف من البكتيريا. مسلسل 20 ضعفا التخفيفات تقديم مجموعة مناسبة حيوية لتعداد الجراثيم المستعمرة.
الشكل 3. نقل ماصات مع تفتق رمح ضيق مناسب لتتحمل ضيق (A) التي من شأنها أن تضر الحبار الأحداث. المعالجة عن طريق قطع أضيق الباب مع مقص أو شفرة حلاقة ينتج أداة مناسبة (B) لنقل الأحداث الحبار.
s/ftp_upload/3758/3758fig4.jpg "/>
الشكل 4. بيانات عينة لفحص الاستعمار. (أ) مستويات من البكتيريا الموجودة في الأوعية اللقاح. (ب) التلألؤ من الحبار الفردية. (ج) من مستعمرة تهم الحبار الفردية. (د) التألق محددة من الحبار الفردية. APO، Aposymbiotic (uncolonized سيطرة سلبية).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الفحص الاستعمار صفها يسمح لتحليل عملية تكافلية الطبيعية في بيئة مختبر للرقابة. على هذا النحو، يمكن استخدامه لتقييم من قبل الاستعمار سلالات متحولة، من عزلة طبيعية مختلفة، وتحت مختلف النظم الكيماوية. ويشيع استخدام الاختلافات في التجارب المذكورة لتقييم مختلف جوانب التعايش. ويمكن قياس حركية من الاستعمار عن طريق فحص التألق خلال 24 ساعة الأولى، والتي يمكن الكشف عنها تلقائيا في عداد التلألؤ الذي تمت إزالة للكشف عن صدفة. وعلاوة على ذلك، يمكن قياس قدرة الاستعمار النسبية للسلالة واحدة بالنسبة لآخر عن طريق فحص الاستعمار تنافسية، والتي يتم تطبيع نسبة الناتج من سلالتين في مجموعة من الحيوانات الى نسبة المدخلات (اكتشاف الفرق من قبل المقاومة للمضادات الحيوية المتميزة، مضان ، أو مولد اللون [LacZ / Xgal] علامات). أخيرا، يمكن تصويرها مباشرة من قبل الاستعمار ميكر مبائرoscopy.
من الأهمية بمكان استخدام الحبار الأحداث صحية للتجارب. المؤشرات السلوكية للصحة الحبار الفقراء وتشمل السباحة في دوائر (الموت ببطء والحيوانية)، أو الحيوانات التي لا تزال بيضاء ولا تغير chromatophores لهم لتحويل براون على سطح الظلام (استخدام مع الرعاية). كما يوجد تفاوت في السكان المضيفين، وهو أكبر عدد من التجارب تكرار مع عدد أقل من الحيوانات غالبا ما تكون أكثر قيمة من عدد أقل من تكرار تجارب على عينات كبيرة الحجم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
المؤلفان بالشكر ماتياس Gyllborg للحصول على دعم مرفق الحبار وللتعليقات على هذه المخطوطة، مايكل هادفيلد ومختبر البحرية Kewalo للحصول على المساعدة خلال الجمع الميداني، وأعضاء في مختبر روبي ومكفال نجاي، لما قدمته من مساهمات في هذا البروتوكول. ويدعم العمل في مختبر ماندل بواسطة جبهة الخلاص الوطني 0843633-IOS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR international | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher Scientific | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega Corp. | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega Corp. | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster & Smith | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith | CD-16881 | Prepare at 35 ≥ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalge Nunc international | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼", lower diameter 2 ¼", height 3". Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR international | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
- Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
- Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
- Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
- Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , PACON International. Honolulu, Hawaii. (2001).
- Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
- Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
- Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).
