Summary
Il metodo descrive la procedura con cui il calamaro hawaiano bobtail,
Abstract
Batteri specifici sono presenti in associazione con tessuti animali 1-5. Tali host-batteriche associazioni (simbiosi), può essere dannoso (patogeno), non hanno alcuna conseguenza fitness (commensale), o essere di beneficio (mutualità). Mentre molta attenzione è stata data alle interazioni patogeni, si sa poco sui processi che determinano l'acquisizione riproducibile di benefici / commensale batteri dall'ambiente. La luce-organo mutualismo tra la marina batterio Gram-negativo V. fischeri e la Hawaiian Bobtail calamari, E. scolopes, rappresenta una interazione altamente specifica in cui un host (E. scolopes) stabilisce un rapporto simbiotico con una sola specie batteriche (V. fischeri) nel corso della sua vita 6,7. Bioluminescenza prodotta da V. fischeri durante questa interazione fornisce un anti-predatorio beneficio E. scolopes durante le attività notturne 8,9, mentreil tessuto ricco di nutrienti host fornisce V. fischeri con una nicchia protetta 10. Durante ogni generazione host, questo rapporto si riassume, rappresentando così un processo prevedibile che può essere valutata in dettaglio vari stadi di sviluppo simbiotico. In laboratorio, del minore calamari sportello aposymbiotically (colonizzati), e, se raccolti entro i primi 30-60 minuti e trasferito al simbionte priva di acqua, non possono essere colonizzati se non lo sperimentale inoculo 6. Questa interazione fornisce pertanto un sistema utile modello in cui per valutare i singoli passaggi che portano alla acquisizione specifico di un microbo simbiotico dall'ambiente 11,12.
Qui si descrive un metodo per valutare il grado di colonizzazione che si verifica quando appena schiusi aposymbiotic E. scolopes sono esposti a (artificiale) contenenti acqua di mare V. fischeri. Questo saggio descrive semplice inoculazione, l'infezione naturale, e il recuperodel simbionte batterico dall'organo luce nascente E. scolopes. cura è presa per fornire un ambiente coerente per gli animali durante lo sviluppo simbiotico, con particolare riguardo alla qualità dell'acqua e segnali luminosi. Metodi per caratterizzare la popolazione simbiotica descritta includono (1) misura della bioluminescenza batteri-derivati, e (2) colonia diretta conteggio di simbionti recuperati.
Protocol
1. Preparazione di inoculi batterica
- Giorno 0
Due giorni prima calamari inoculazione, la piastra dei ceppi batterici rilevanti su LBS 13 agar. - Incubare batteri a 25-28 ° C durante la notte.
- Giorno 1
Inoculare 3 LBS ml di media cultura in un tubo di vetro con una colonia di ogni V. ceppo fischeri per l'infezione. Preparare duplicare i tubi come backup. - Giorno 2
(Coordinate passi batteriche 1,4-1,6 con passo calamari 3.7-3.10)
1 h prima dell'inoculo, batteri subcultura 1:80 (37,5 pl) in 3 ml LBS in una provetta di vetro e crescere per 1 h con aerazione. - Misurare la OD 600 del campione prima dell'inoculo. Misurazioni tipiche sono 0,3-0,6 seconda del ceppo.
- Per un inoculo bersaglio di 3-5 x 10 3 UFC / ml calcolare il volume di inoculo come segue: volume di inoculo (pl) = 1,25 / 60 OD0 (ad esempio, per OD 600 = 0.5, il volume di inoculo calcolato = 1.25/0.5 = 2,5 microlitri). Tale importo è aggiunto direttamente l'acqua di mare contenenti calamari al punto 4.1. Questo calcolo può essere necessario regolare per diversi ceppi di V. fischeri o per l'inoculazione a livelli inferiori o superiori a quelli indicati qui.
2. Preparazione di piastre di agar per il conteggio del inoculi
- Per ogni trattamento, LBS etichette piastre (2 per il trattamento) a campioni piastra del inoculo nel passaggio 4.1.
- Aggiungere 5 perline placcatura sterili per piastra.
3. Raccolta dei minori Squid
- Misurare la salinità dell'Oceano istantanea con il rifrattometro e regolare a 35 ‰.
- Filtrare 1 L di Ocean istantaneo utilizzando l'unità di filtrazione e una linea a vuoto allegato o pompa del vuoto, per generare filtro sterilizzato istantanea Ocean (UFAS). Ossigenare l'acqua agitando vigorosamente prima di ogni erogazione. The unità di filtro può essere riutilizzato per 2 giorni.
- Aliquotare 40-50 ml di UFAS in ciascuno di due (2) ciotole campione usa e getta. Etichetta uno come Earlies e una come timelies.
- Preparare un eccesso di pipette di trasferimento in plastica per acquisire calamari giovanile tagliando la pipetta circa 1 cm dalla punta, sopra le creste più bassi (vedi Figura 3). Questo facilita una zona più ampia attraverso la quale il calamaro può passare al momento della raccolta. Eliminare le pipette di trasferimento in cui vi è una superficie ruvida esposta.
- Utilizzo di pipette di trasferimento preparati, raccogliere E. scolopes che nati durante la notte e trasferire alla ciotola Earlies di UFAS. Hatchlings I primi sono stati nel sistema di uova per oltre 1 ora e sono suscettibili di colonizzazione da parte di contaminanti V. fischeri nel sistema uovo. Non utilizzare per gli esperimenti di colonizzazione Earlies sensibili.
- Controllare i serbatoi d'uovo ogni 30-45 min per hatchlings nuovi. Assicurarsi che tutti i neonati vengono eliminati nel corso di ogni check. Rimuovere hatchlings con una pipetta di trasferimento, e il deposito nella ciotola timelies di UFAS. Gli animali raccolti in modo tempestivo sono disponibili per gli esperimenti di colonizzazione.
- Quando la raccolta è terminata (~ 45 min dopo il tramonto), trasferire il calamaro al laboratorio principale. Empiricamente è vantaggioso a colonizzare gli animali in condizioni di luce ininterrotta di laboratorio per 3 vaccinazioni h.
- Per ogni trattamento, preparare una ciotola con 40 ml UFAS. Aggiungi Squid per le ciotole per il saggio (massimo n = 40 per ciotola).
- Preparare una ciotola aggiuntiva come aposymbiotic controllo (negativo).
- Preparare una pipetta di trasferimento dedicato per ciascun trattamento.
- Euthanize calamari extra in 2% di etanolo.
4. Squid Colonization
- Giorno 2 - Utilizzando una Pipetman P10, dispensare l'aliquota calcolata di batteri (Step 1.5) in ogni ciotola calamari (Step 3.8) per ogni trattamento. Avviare un timer 3 ore subito dopola prima inoculazione.
- Per ogni trattamento, creare un "vortice" nel contenitore con la pipetta di trasferimento dedicato posizionando la pipetta vicino al bordo della tazza e pipettando su e giù ripetutamente per miscelare l'acqua e calamari per circa 10 sec. Accurata miscelazione è fondamentale.
- Tavola 50 microlitri da ogni ciotola su una piastra di agar LBS dal punto 2.2 (per il tecnico replica, due piastre 50 piastre pl per ogni trattamento). Incubare a 25-28 ° C durante la notte.
- Preparare catino (100 ml UFAS / bis) per ogni trattamento.
- Preparare fiale Drosophila (4 ml UFAS / bis) per ogni calamari.
- Dopo esattamente 3 ore, trasferire i calamari ai loro rispettivi catino (completa per tutti i trattamenti). Ciò arresta l'inoculazione.
- Procedere al trasferimento di ogni singolo calamari al suo flacone con il proprio Drosophila UFAS. Utilizzare una pipetta di trasferimento designato per ogni trattamento.
- Spostare vassoi di fiale Drosophila alla struttura calamari per tornare al giorno / night ciclo di luce gli animali sperimentato durante l'embriogenesi.
- Giorno 3 - Prepare fiale Drosophila (4 ml UFAS / bis) per ogni calamari.
- Prima del tramonto a 22-24 ore dopo l'inoculazione, trasferire ogni calamari in un nuovo flacone Drosophila. Utilizzare una pipetta di trasferimento designato per ogni trattamento.
- Giorno 4 - Preparare microcentrifuga etichettata provette da 1,5 ml (1/squid).
- Prima del tramonto a 46-48 ore dopo l'inoculazione, misurare e registrare la luminescenza di ogni calamari nel flaconcino Drosophila (set luminometro 6 s per l'integrazione e l'auto-lettura in chiusura del coperchio).
- Come controllo negativo per luminescenza sfondo, misurare un flaconcino con UFAS che non contiene alcun calamari.
- Trasferire ciascun calamari in un volume di circa 700 pl di una provetta per microcentrifuga 1,5 ml dalla Fase 4,12. Spostarsi in una scatola di cartone freezer. Una volta che il coperchio è posto sulla scatola, non rimuoverlo, come i segnali di luce per l'espulsione i batteri non sono well-compreso.
- Congelare provette da microcentrifuga a -80 ° C per una notte.
5. Determinazione dei livelli di colonizzazione
- Per ogni calamari, preparare due (2) microprovette, ognuna con 475 microlitri UFAS (o in autoclave 70% Instant Ocean).
- Preparare pestelli in primo luogo utilizzando un Kimwipe per pulire il pestello e rimuovere i detriti lordo e / o tessuto.
- Luogo pestelli tip-down in un bicchiere da 50 ml contenente etanolo al 95%. Etanolo deve essere aggiunto ad una altezza di circa 3 cm.
- Per ogni pestello, togliere dal bicchiere e pulire la punta con un Kimwipe.
- Immergere pestello di nuovo nel bagno di etanolo, rimuovere e inserire (punta verso l'alto) in un rack provetta e lasciare asciugare completamente per circa 15 minuti.
- Scongelare calamari in un portaprovette microcentrifuga (massimo n = 8).
- Se necessario, regolare il volume a 700 microlitri.
- Utilizzo di un pestello dal punto 5.5, a distruggere il tessuto animale finché l'inchiostro sac RUPTures (l'acqua diventa torbida un colore grigio).
- Rimuovere il pestello e garantire tutti tessuto rimane nel tubo.
- Vortex brevemente il tessuto per esattamente 10 secondi utilizzare un timer).
- Lasciare il tessuto riposare per 10 min. Il tessuto si sistemerà ed i batteri e l'inchiostro rimane in soluzione. Per i calcoli che seguono, i batteri o la soluzione di inchiostro è la [A] diluizione (cioè la luce E. scolopes omogenato organo in 700 pl). Diluizioni seriali 1:20 ([B], [C]) sono descritti di seguito.
- Per la [B] diluizione, aggiungere 25 pl [A] alla uno dei tubi da microcentrifuga preparata al punto 5.1. Vortex.
- Per la [C] diluizione, aggiungere 25 pl [B] a uno dei tubi da microcentrifuga preparata al punto 5.1. Vortex.
- Tavola 50 microlitri di ciascuna diluizione su agar LBS, 2 repliche per trattamento.
- Incubare le piastre a 25-28 ° C per una notte.
6. Analisi dei dati
- Per calcolare il CFU / organo luce (LO), i paesit colonie sulla piastra per ogni trattamento, in cui 10-400 colonie sono presenti, e usare la seguente formula:
CFU / LO = (colonie su [A] piastra) x 14;
CFU / LO = (colonie su [B] piastra) x 280, oppure
CFU / LO = (colonie su [C] piastra) x 5600. - Tracciare i singoli punti dati e le mediane su una scala logaritmica.
- I dati spesso non sono normalmente distribuiti, con diverse varianze, e gli outliers possono contenere informazioni biologicamente significativo. Pertanto, non parametrici fornire un metodo utile per determinare se i trattamenti differiscono in modo significativo.
- Utilizzare software Prism GraphPad per l'analisi statistica. Per i due trattamenti, utilizzare il Wilcoxon rank test Sum. Per i confronti tra più di due trattamenti, utilizzare il Kruskal-Wallis test con appropriato post-test.
7. Risultati rappresentativi
I risultati di un saggio di colonizzazione campione sono mostrati nella Figura 4. Due ceppi di
Figura 1. Diagramma di flusso della procedura di colonizzazione. Batteri e calamari vengono raccolte separatamente, poi mixato presso l'inoculo specificato. Squid vengono lavate, poi trasferito acqueo a 3 ore, 24 ore, e 4 8 h dopo l'inoculazione. Al 48 h la luminescenza è misurata e gli animali vengono congelati, che serve a superficie sterilizzare gli animali. Light-organo colonizzato i batteri rimangono vitali a -80 ° C attraverso un disgelo (senza ulteriori cicli gelo-disgelo).
Figura 2. Diagramma di flusso illustrante omogeneizzazione e placcatura diluizione dei batteri. Seriali 20-diluizioni fornire la gamma dinamica adeguata per il conteggio dei batteri colonizzati.
Figura 3. Trasferire pipette con un cono albero opportunamente stretto un foro stretto (A) che danneggerebbero calamari giovanile. Pretrattamento, tagliando parte più stretta con le forbici o una lametta si ottiene uno strumento adeguato (B) per il trasferimento di calamari giovanile.
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Figura 4. I dati di esempio per un test di colonizzazione. (A) i livelli di batteri nelle ciotole inoculo. (B) Luminescence di calamari individuale. (C) il conteggio delle colonie di calamari individuale. (D) luminescenza specifico di calamari individuale. Apo, Aposymbiotic (non colonizzata controllo negativo).
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Discussion
Il dosaggio colonizzazione descritto permette l'analisi di un processo naturale simbiotico in un ambiente di laboratorio controllato. Come tale, può essere utilizzato per valutare colonizzazione da ceppi mutanti mediante diversi isolati naturali, e sotto regimi chimici differenti. Variazioni su gli esperimenti descritti sono comunemente usati per valutare diversi aspetti della simbiosi. La cinetica di colonizzazione può essere misurata esaminando luminescenza durante le prime 24 ore, che può essere rilevata automaticamente in un contatore a scintillazione in cui il rivelatore coincidenza è stato rimosso. Inoltre, la capacità colonizzazione relativa di un ceppo relativo ad un altro può essere misurata mediante un saggio competitivo colonizzazione, in cui il rapporto di uscita dei due ceppi in un insieme di animali sono normalizzati per il rapporto di ingresso (rivelazione differenziale da distinti resistenza agli antibiotici, fluorescenza , o cromogeni [LacZ / Xgal] marcatori). Infine, la colonizzazione può essere ripreso direttamente da micr confocaleoscopy.
E 'fondamentale utilizzare sana calamari giovanile per gli esperimenti. Indicatori comportamentali di cattiva salute calamari sono il nuoto nei circoli (eutanasia l'animale), o gli animali che rimangono bianche e non alterano le loro cromatofori a diventare marrone su una superficie scura (da usare con cura). Poiché esiste variazione nelle popolazioni ospiti, un maggior numero di esperimenti replicati con un numero inferiore di animali è spesso più prezioso di un minor numero di esperimenti replicati con campioni di grandi dimensioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano per il supporto Mattias Gyllborg impianto di calamari e dei commenti a questo manoscritto, Michael Hadfield e il Laboratorio Kewalo Marine per l'assistenza durante la raccolta campo, ei membri del Laboratorio di Ruby e McFall-Ngai per i contributi a questo protocollo. Il lavoro nel laboratorio di Mandel è supportato da NSF IOS-0843633.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR international | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher Scientific | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega Corp. | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega Corp. | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster & Smith | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith | CD-16881 | Prepare at 35 ≥ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalge Nunc international | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼", lower diameter 2 ¼", height 3". Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR international | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
References
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