Summary
El método describe el procedimiento mediante el cual el hawaiano calamar bobtail,
Abstract
Bacterias específicas se encuentran en asociación con el tejido animal 1-5. Estas bacterias de acogida las asociaciones (simbiosis) pueden ser perjudiciales (patógeno), no tienen ninguna consecuencia de fitness (comensales), o ser beneficiosa (mutualismo). Si bien se ha prestado mucha atención a las interacciones patógenas, poco se sabe acerca de los procesos que determinan la adquisición reproducible de beneficio / comensal bacterias del medio ambiente. El mutualismo de luz de órganos entre la marina bacteria Gram negativa V. fischeri y el calamar hawaiano bobtail, E. scolopes, representa una interacción muy específico en el que un único equipo (E. scolopes) establece una relación simbiótica con una sola especie bacteriana (V. fischeri) a lo largo de su ciclo de vida 6,7. La bioluminiscencia producida por V. fischeri durante esta interacción proporciona un beneficio anti-depredadores a E. scolopes durante las actividades nocturnas, mientras que 8,9el tejido del huésped, rica en nutrientes proporciona V. fischeri con un nicho protegido 10. En cada generación de acogida, esta relación se resume, por lo que representa un proceso predecible que puede ser evaluado en detalle en las distintas etapas de desarrollo simbiótico. En el laboratorio, el menor calamar escotilla aposymbiotically (uncolonized), y, si se recogen dentro de los primeros 30-60 minutos y se transfiere a simbionte agua libre, no puede ser colonizado excepto por el inóculo experimental 6. Esta interacción proporciona así un sistema modelo útil en la cual evaluar los pasos individuales que conducen a la adquisición específica de un microbio simbiótica desde el entorno de 11,12.
Aquí se describe un método para evaluar el grado de colonización que se produce cuando recién nacidas aposymbiotic E. scolopes están expuestos a (artificial) de agua de mar que contienen V. fischeri. Este ensayo simple describe la inoculación, la infección natural, y la recuperaciónde bacterias simbiontes del órgano de luz naciente de la E. scolopes. Hay que tener cuidado para proporcionar un entorno uniforme para los animales durante el desarrollo simbiótico, especialmente con respecto a la calidad del agua y las señales de luz. Métodos para caracterizar la población simbiótica descritos incluyen (1) la medición de bioluminiscencia por bacterias derivados, y (2) directo de las colonias el recuento de los simbiontes recuperados.
Protocol
1. Preparación de inóculos bacterianos
- Día 0
Dos días antes de la inoculación de calamar, la placa de las cepas bacterianas pertinentes sobre LBS 13 de agar. - Incubar las bacterias a 25-28 ° C durante la noche.
- Día 1
Inocular 3 ml de medio de LBS en un tubo de cultivo de vidrio con una colonia de cada uno de V. fischeri cepa de infección. Preparar los tubos duplicados como copia de seguridad. - Día 2
(Coordinar medidas bacterianas 1.4-1.6 con los pasos de calamar 3.7-3.10)
1 h antes de la inoculación, las bacterias subcultivo 1:80 (37,5 l) en 3 ml FTCM en un tubo de cultivo de vidrio y crecer durante 1 hora con aireación. - Medir el diámetro exterior 600 de la muestra antes de la inoculación. Las mediciones típicas son 0.3-0.6 dependiendo de la cepa.
- Para un inóculo de destino de 3-5 x 10 3 UFC / ml de calcular el volumen del inóculo de la siguiente manera: El volumen de inóculo (l) = 1,25 / OD 600 (por ejemplo, para OD 600 = 0,5, el volumen del inóculo calculado = 1.25/0.5 = 2,5 l). Esta cantidad se añade directamente al agua de mar que contienen calamar en el Paso 4,1. Este cálculo puede ser necesario ajustar para diferentes cepas de V. fischeri o para la inoculación en los niveles inferiores o superiores a los especificados aquí.
2. Preparación de placas de agar para el recuento de los inóculos
- Para cada tratamiento, LBS etiqueta placas (2 por tratamiento) a las muestras de la placa del inóculo en el Paso 4,1.
- Agregar 5 gotas de enchapado estériles por placa.
3. Colección de los menores de calamar
- Medir la salinidad del Océano instantánea utilizando el refractómetro y ajustar a 35 ‰.
- Filtro 1 L de Instant Ocean utilizando la unidad de filtración y una línea de vacío adjunto o bomba de vacío, para generar esterilizada por filtración, Instant Ocean (FSIO). Oxigenar el agua por agitación vigorosamente antes de cada dispensación. The la unidad de filtro se puede reutilizar durante 2 días.
- Alícuota 40-50 ml de FSIO en cada uno de dos (2) cuencos de muestra desechables. Etiqueta de uno como Earlies y uno como timelies.
- Preparar un exceso de pipetas de plástico para la adquisición de los calamares juveniles mediante la reducción de la pipeta aproximadamente 1 cm de la punta, por encima de las crestas más bajas (ver Figura 3). Esto facilita un área más amplia a través del cual el calamar puede pasar en el ordeño. Desechar cualquier pipetas de transferencia en los que existe una superficie rugosa expuesta.
- Utilizando pipetas de transferencia preparados, recoger E. scolopes que eclosionaron durante la noche y transferir de un tazón de earlies FSIO. Crías iniciales han sido en el sistema de huevo durante más de 1 h, y son susceptibles a la colonización por contaminar V. fischeri en el sistema de huevo. No utilice earlies para los experimentos de colonización sensibles.
- Comprobar que los tanques de huevo cada minuto 30-45 para las crías nuevas. Asegúrese de que todas las crías se borran en cada cdiablos. Retire las crías con una pipeta de transferencia, y el depósito en el recipiente de timelies FSIO. Los animales recogidos en el momento oportuno se encuentran disponibles para los experimentos de colonización.
- Cuando la colección se ha terminado (~ 45 minutos después del atardecer), la transferencia del calamar al laboratorio principal. Empíricamente, es ventajoso para colonizar los animales bajo condiciones de laboratorio ininterrumpidas de luz para inoculaciones 3 h.
- Para cada tratamiento, preparar un recipiente con 40 ml FSIO. Añadir los calamares a los tazones de fuente para el ensayo (máximo n = 40 por plato).
- Preparar un recipiente adicional como aposymbiotic control (negativo).
- Preparar una pipeta de transferencia específico para cada tratamiento.
- La eutanasia calamares extra en 2% de etanol.
4. Squid Colonización
- Día 2 - El uso de un Pipetman P10, prescindir de la alícuota calculada de las bacterias (Paso 1.5) en cada tazón calamar (Paso 3.8) para cada tratamiento. Iniciar un temporizador de 3 h inmediatamente después dela primera inoculación.
- Para cada tratamiento, crear un "vórtice" en el recipiente con la pipeta de transferencia dedicado mediante la colocación de la pipeta cerca del borde de la taza y pipeteando arriba y abajo varias veces para mezclar el agua y el calamar durante aproximadamente 10 segundos. La mezcla completa es crítico.
- Placa de 50 l de cada plato en una placa de agar LBS desde el Paso 2.2 (para técnicos repeticiones, dos placas de 50 placas de l por tratamiento). Incubar a 25-28 ° C durante la noche.
- Preparar cuencos de lavado (100 ml FSIO / EA) para cada tratamiento.
- Preparar los viales de Drosophila (4 ml FSIO / EA) para cada calamar.
- Después de exactamente 3 horas, traslado al calamar a sus respectivos lavabos (completo para todo el tratamiento). Esto evita que la inoculación.
- Proceda a la transferencia de cada calamar individuo a su propio vial de Drosophila con FSIO. Utilizar una pipeta de transferencia designada para cada tratamiento.
- Mueva bandejas de frascos de Drosophila a la facilidad de calamar para volver a la día / nDERECHO ciclo de luz de los animales experimentaron durante la embriogénesis.
- Día 3 - Preparar los viales de Drosophila (4 ml FSIO / EA) para cada calamar.
- Antes de atardecer a 22-24 h después de la inoculación, transferir cada calamar de un nuevo vial de Drosophila. Utilizar una pipeta de transferencia designada para cada tratamiento.
- Día 4 - Preparar la etiqueta tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (1/squid).
- Antes de atardecer en 46-48 h después de la inoculación, medir y registrar la luminiscencia de cada calamar en el vial de Drosophila (conjunto luminómetro para la integración 6 s, y de auto-lectura sobre el cierre de la tapa).
- Como control negativo para la luminiscencia de fondo, medir un vial con FSIO que no contiene ningún calamar.
- Transferir cada calamar en un volumen de aproximadamente 700 l de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de la Etapa 4,12. Mover a una caja de cartón del congelador. Una vez que la tapa se coloca en la caja, no lo saque como las señales de luz para la expulsión bacterias no son well-entendido.
- Congelar tubos de microcentrífuga a -80 ° C durante la noche.
5. Determinación de los niveles de colonización
- Para cada calamar, preparar dos (2) tubos de microcentrífuga, cada uno con 475 l FSIO (o autoclave 70% Instant Ocean).
- Preparar morteros, en primer lugar con un Kimwipe para limpiar la mano del mortero y eliminar los desechos brutos y / o tejidos.
- Colocar morteros punta hacia abajo en un vaso de precipitados de 50 ml que contiene 95% de etanol. El etanol se añade a una altura de aproximadamente 3 cm.
- Por cada mano de mortero, retire del vaso y limpiar la punta con un Kimwipe.
- Sumerja la mano del mortero de nuevo en el baño de etanol, extraer e insertar (punta hacia arriba) en un bastidor de tubo de microcentrífuga y deje que se seque completamente durante aproximadamente 15 minutos.
- Descongele los calamares en un estante de tubo de microcentrífuga (máximo = n = 8).
- Si es necesario, ajustar el volumen a 700 l.
- El uso de un mortero desde el Paso 5.5, alterar el tejido de los animales hasta que el saco de la tinta rupturaras (el agua se torne de un color gris oscuro).
- Retire la mano del mortero y asegurar todo el tejido queda en el tubo.
- Vortex brevemente el tejido durante exactamente 10 segundos (usar un cronómetro).
- Permitir el tejido para descansar durante 10 minutos. El tejido se asienta y las bacterias y la tinta permanece en solución. Para los cálculos que siguen, las bacterias o solución de tinta es la [A] de dilución (es decir, la luz de E. scolopes homogeneizado de órganos en 700 l). Diluciones seriadas 1:20 ([B], [C]) se describen a continuación.
- Para el [B] dilución, se añaden 25 l [A] para uno de los tubos de microcentrífuga preparados en el paso 5,1. Vortex.
- Para la [C] dilución, se añaden 25 l [B] para uno de los tubos de microcentrífuga preparados en el paso 5,1. Vortex.
- Placa de 50 l de cada dilución en agar LBS, 2 repeticiones por tratamiento.
- Incubar las placas a 25-28 ° C durante la noche.
6. Análisis de Datos
- Para calcular el UFC / órgano de luz (LO), los paísest colonias en la placa para cada tratamiento en el cual 10-400 colonias están presentes, y utilizar la fórmula adecuada:
UFC / LO = (colonias en [A] Placa) x 14, o
UFC / LO = (colonias en [B] placa) x 280, o
UFC / LO = (colonias en [C] placa) x 5600. - Trazar puntos de datos individuales y medianas en una escala logarítmica.
- Los datos a menudo no se distribuyen normalmente, con diferentes variaciones y los valores extremos puede contener biológicamente significativa de la información. Por lo tanto, no paramétricos pruebas proporcionan un método útil para determinar si los tratamientos difieren significativamente.
- Utilice el software GraphPad Prism para el análisis estadístico. Para ambos tratamientos, el uso del test de Wilcoxon. Para las comparaciones entre más de dos tratamientos, el uso de la prueba de Kruskal-Wallis con el post-tests apropiados.
7. Los resultados representativos
Los resultados de un ensayo de colonización de la muestra se muestran en la Figura 4. Dos cepas de
Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento de colonización. Las bacterias y los calamares se recogen por separado, luego se mezcla en el inóculo se especifica. Calamar se lavan, se transfiere entonces al agua nueva a las 3 h, 24 h, y 4 8 horas después de la inoculación. A las 48 h, la luminiscencia se midió y los animales se congelan, que sirve para esterilizar la superficie de los animales. Luz de órganos colonizados bacterias permanecen viables a -80 ° C a través de un deshielo (no se necesita ciclos hielo-deshielo).
Figura 2. Diagrama de flujo que ilustra la homogeneización y dilución en placas de las bacterias. Serie de 20 diluciones proporcionar la gama dinámica apropiada para la enumeración de las bacterias colonizadas.
Figura 3. Transferencia pipetas con una conicidad eje apropiadamente a un agujero estrecho estrecho (A) que dañarían calamar menores. El tratamiento previo al cortar la sección más estrecha con unas tijeras o una hoja de afeitar se obtiene una herramienta apropiada (B) para la transferencia de los calamares juveniles.
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Figura 4. Datos de ejemplo para un ensayo de colonización. (A) Los niveles de las bacterias en los tazones de fuente de inóculo. (B) La luminiscencia de los calamares individual. (C) recuentos de colonias de calamares individual. (D) luminosidad específica de calamar individual. Apo, Aposymbiotic (colonizada control negativo).
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Discussion
El ensayo se describe la colonización permite el análisis de un proceso de simbiosis natural en un entorno controlado de laboratorio. Como tal, se puede utilizar para evaluar la colonización por cepas mutantes, por parte de diferentes aislamientos naturales, y bajo regímenes químicas diferentes. Las variaciones en los experimentos descritos se utilizan comúnmente para evaluar diferentes aspectos de la simbiosis. La cinética de colonización puede ser medida mediante el examen de luminiscencia durante las primeras 24 horas, que puede ser detectada de forma automática en un contador de centelleo en la que se ha eliminado el detector de coincidencia. Además, la capacidad de colonización relativa de una cepa con relación a otro puede ser medida por un ensayo de colonización competitivo, en el que la relación de salida de las dos cepas en un conjunto de animales se normalizan a la relación de entrada (detección diferencial por resistencia a los antibióticos distinta, la fluorescencia , o cromogénicos [LacZ / Xgal Los marcadores). Por último, la colonización puede ser captado directamente por micr confocaloscopy.
Es muy importante utilizar los calamares juveniles saludable para los experimentos. Los indicadores del comportamiento de la mala salud incluyen calamares nadando en círculos (la eutanasia del animal), o de los animales que permanecen blancas y no alteran sus cromatóforos a tomar color sobre una superficie oscura (usar con cuidado). Como no existe variación en las poblaciones de acogida, un mayor número de replicar los experimentos con menor número de animales es a menudo más valioso que un menor número de replicar los experimentos con muestras de gran tamaño.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen el apoyo Mattias Gyllborg instalación calamares y los comentarios sobre este manuscrito, Michael Hadfield y el Laboratorio Marino Kewalo para la asistencia durante la recolección de campo, y los miembros del Laboratorio de Ruby y McFall Ngai-por sus contribuciones a este protocolo. Trabajo en el Laboratorio de Mandel es apoyado por la NSF IOS-0843633.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR international | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher Scientific | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega Corp. | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega Corp. | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster & Smith | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith | CD-16881 | Prepare at 35 ≥ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalge Nunc international | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼", lower diameter 2 ¼", height 3". Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR international | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
References
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