Summary
現在の研究では、ヒト胚性幹細胞の膵臓の分化誘導の指示分化のアプローチについて説明します。大きな意義のインスリン発現する細胞に膵臓の前駆細胞由来のヒト胚性幹細胞の発見、その内皮細胞の共培養を仲介する成熟である。
Abstract
胚性幹細胞（ESC）は、2つの主な特徴を持っている：彼らはいつまでもこのように複数の系統に分化する可能性を有する未分化の状態でin vitroで増殖させ、彼らが多能性であることができます。このような性質は、細胞ベースの治療と再生治療のアプリケーション1のESCのは非常に魅力的です。しかし、実現するための最大限の可能性のために細胞は骨の折れる作業である成熟した機能的な表現型に分化する必要があります。細胞分化を誘導するのに有望なアプローチは密接にin vitroでの設定で器官形成のパスを模倣することである。膵臓の開発は、肝臓や膵臓など、いくつかの臓器に開発することができます内胚葉から始まる、特定のステージ2で発生することが知られています。内胚葉誘導は4月7日 、いくつかの成長因子との組み合わせで3アクチビンの添加によりリンパ節転移経路の変調によって達成することができる8の添加によってin vitroで達成することができますソニック·ザ·ヘッジホッグ阻害の阻害による膵のコミットメントを受けています。膵臓の成熟は、ノッチシグナル伝達の阻害を含むいくつかの並列イベントによって媒介される、3次元のクラスタに膵臓の前駆細胞の凝集、血管新生の誘導、いくつかの名前を指定する。これまで最も成功したESC由来の膵臓前駆細胞の体外成熟によってDAPT補充9でNotchシグナル伝達の阻害を介して達成されている。成功したものの、減少している機能を持つ成熟した表現型の低収率でこの結果。以下の研究領域は、ますます、生体内の膵島成熟10,11の重要な要因として評価されている膵臓の成熟にシグナリング内皮細胞の効果である。
現在の研究では、endothelのような効果を探るIAL細胞は膵島様細胞をインスリン産生にヒトESC由来の膵臓前駆細胞の成熟にシグナル伝達。我々は、ヒトESCが最初にPI3K経路を阻害するとともに、アクチビンによって内胚葉に向かって誘導される多段階の指示分化プロトコルを報告する。内胚葉細胞の膵臓の仕様は、レチノイン酸を添加することによりレチノイド誘導とともに、シクロパミンによってソニック·ザ·ヘッジホッグシグナル伝達の阻害によって達成されます。成熟の最終段階は、共培養の構成によって達成さ内皮細胞のシグナル伝達によって誘導される。いくつかの内皮細胞の共培養でテストされているが、ここに我々は、主に分析を容易にするために、ラット心臓微小血管内皮細胞（RHMVEC）で我々のデータを提示します。
Protocol
1。細胞維持
- メディアは毎日変更でのH1 hESCの（WiCell）は、mTeSR1媒体でhESCの資格をマトリゲル被覆ウェル上で維持した。 F12：ウェルズは、DMEM 25 mlにhESCのマトリゲルの300μlを添加して調製希釈マトリゲルソリューションによって被覆されていた。このマトリゲル溶液1mlは、6ウェルプレートの各ウェルに添加し、または400μlを12ウェルプレートの各ウェルに添加し、室温で1時間コートさせた。細胞は機械的に彼らが1の間で、直径1.5ミリメートルに達した後、コロニーを掻き取ることにより、1:4の分割比で継代した。
- RHMVEC（VEC技術）が一日おきに変更するメディアとMCDB-131培地中で維持されていた。 80％の合流が1:3の分割比で到達した後、細胞をトリプシン処理によって分割された。通路3と7の間の内皮細胞は、この研究のために使用された。
2。ストック溶液の調製
- アクチビンは、滅菌Pの濃度50μg/ mLで再構成したBSは、アルブミン0.1％ウシ血清を含む。溶液は-20℃で小分けして保存されていた
- EGFは、無菌の10mM酢酸で500μg/ mlで再構成した。溶液は-20℃で小分けして保存されていた
- インスリンは10mlの水に0.1ミリリットルの氷酢酸を添加することによって調製した酸性化し、H 2 O（pHが≤2）を追加して10 mg / mlで再構成した。
- DAPTは、18 mg / mlをDMSOに再構成した。 F12は、分注して-20℃で保存し：それはさらにDMEMで300μMの濃度に希釈した
- KAAD-シクロパミンは5mg/mlでDMSOに再構成した。 F12は、分注して-20℃で保存し：それはさらにDMEMで2μMの濃度に希釈した
- オールトランスレチノイン酸は、95％エタノールで2.7 mg / mlを再構成した。 、F12注し、-80℃で保存し：それはさらにDMEMで2mMの濃度に希釈した
3。胚体内胚葉（DE）と膵臓前駆（PP）の誘導
- H回直径1〜1.5ミリメートルに達したESCコロニー、DE誘導をDMEMを加えることによって行った：F12はB27を補充し、0.2％BSA、100 ng / mlのアクチビンのメディアと、4日間のために1μMのウォルトマニン（0日目·4日目）毎日変更します。
- DEの誘導が完了した後、膵臓の前駆細胞の誘導は、DMEMにメディアを変更することにより誘発された：F12は、24時間0.2μM濃度（4日目 - 5日）でB27、0.2％BSAとKAAD-シクロパミンを添加した。
- 24時間後、メディアはDMEMに変更されました：F12は、補充したB27、0.2％BSA、メディアは毎日変更と3日間0.2μMの濃度2μMの濃度で全トランスレチノイン酸（5日·8日目）でKAAD-シクロパミン。
4。膵臓の成熟
- PPの誘導の後、すべてのグループをDMEMから成る成熟メディアに変更されました：F12、2 dのB27、0.2％BSA、10mMのニコチンアミド、25μg/ mlのインスリン、30nMでのNa 2 SEO 3〜50μg/ mlのトランスフェリンを添加したメディアとAYSは（8日·10日）毎日変更します。
- 成熟培地中の2日後、最終的な成熟のステップは、並列比較のために、いくつかの異なる条件を使用して行われます。 （i）の制御などの内皮細胞がなく、唯一の共培養メディアを使用すると、（iii）RHMVEC細胞と接触共培養を用いたノッチ阻害剤DAPT（II）を使用して：分化は、以下の条件の下で誘導された。細胞は、メディアは毎日変更で（10日·17日目）週間DAPTまたは共培養培地中で維持した。
- DAPTメディアは30μMのDAPTと成熟メディアを補完することにより調製した。このグループ内の細胞を6日間（11日·17日目）の最初の24時間MCDB131を完了するために露出し、その後DAPTメディアに暴露した。
- 共培養培地は、B27とMCDB-131メディア、0.2％BSA、10mMのニコチンアミド、10 ng / mlのEGF、1μg/ mlのヒドロコルチゾン、10 mgのEndoGro、90μg/ mlのヘパリンを補完することにより調製した。メディアコントロール条件では分化細胞が露出したメディアが6日（11日目 - 17日目）（NO内皮細胞）の共培養培地に変更された後、24時間MCDB-131完全培地（10日·11日）まで。
- 接触共培養条件については、100万RHMVECは、添付ファイルを許可するように24時間完全MCDB-131培地中の分化細胞（VEC技術）（10日·11日目）に添加した。 24時間後、メディアはメディアが毎日変更で6日間（11日·17日目）の共培養培地に変更されました。
5。定量RT-PCR解析
- 分化の各段階（;膵臓前駆細胞、内胚葉の成熟膵島）の終わりに溶解し、RNAは、製造元の指示に従って、NucleoSpin RNA II抽出キットを用いて抽出した。
- RNA品質はSmartSpecプラス分光光度計を用いてRNAの定量に続いて、260 nmと280 nmでのRNAの吸光度をチェックして分析した。
- 逆転写ImProm II逆転写kを用いて行ったそれは製造元の指示に従って。すべての反応は、RNA 100ngので行われた。
- 定量RT-PCRは、製造元の指示に従ってMx3005P QPCRシステム（アジレント）とブリリアントIIのSYBR Green QPCRマスターミックスを用いて行った。用いたプライマーは表1に記載されています。初期化ステップを95に続いて2分間50°C°Cで10分間で行われた。 50増幅サイクルは、次のように行った：95℃30秒C、54°、30秒と1分間72℃のC。
- 未分化細胞上の標的mRNA発現の倍数変化は、次の式を用いてCT値から算出した。
ΔCT（マーカーI）= CT（マーカーI） - CT（GAPDH）
ΔΔCT（マーカーI）=ΔCT（マーカi）から（サンプル） - ΔCT（マーカi）から（未分化細胞）
相対式（マーカーI）= 2-ΔΔCT（マーカーI）
6。免疫細胞化学
- 分化の各段階（;膵臓前駆細胞、内胚葉の成熟膵島）の終了時に細胞は、室温で15分間、4％ホルムアルデヒドで固定した。
- 固定した細胞を15分間トリトンX-100（TX）0.25％を使用して浸透させた。
- 非特異的染色を30分間TXを0.05％、10％ロバ血清中でインキュベートすることによりブロックされました。
- 一次抗体のインキュベーションを4℃で一晩実施した、推奨抗体希釈（表1を参照）をブロッキングバッファーで°C。
- 細胞を5分間0.05パーセントTXで3回洗浄した。
- 二次抗体のインキュベーションは、ブロッキング緩衝液で希釈し、適切な抗体を用いて暗所に室温で1時間行った。
- 細胞を5分間0.05パーセントTXで3回洗浄した。
- 核染色は、PBSで1:1000に希釈した染色Hoeschtとのインキュベーションを行ったPBSで3回洗浄し、続いて5分間。
- 固定および染色した細胞はオリンパスIX81倒立顕微鏡およびMetaMorphイメージングソフトウェアを使用して撮像した。
7。代表的な結果
DEマーカーSOX17、CXCR4、およびFoxa2のために定量RT-PCR分析により確認し、 図2に示すように、SOX17のために免疫染色としてアクチビンの追加は、4日間のために未分化hESCのに増感剤は、胚体内胚葉を誘導する。シクロパミンとレチノイン酸の添加後、膵臓前駆細胞への分化は、膵臓前駆細胞のマーカーと、図3に示すように、PDX1の免疫染色の定量RT-PCRにより確認した。
分化の最終段階で、強くhESCの派生した膵臓の前駆細胞でのインスリン発現のアップレギュレーションを誘導RHMVEC細胞と共培養にお問い合わせください。共培養による分化の効率が共同で分析したDAPTを使用して、コントロール条件でmparing。それが現在膵臓の成熟を達成するために最も広く使用されている方法の一つですので、DAPTは、ポジティブコントロールとして使用されていました。共培養は、内皮細胞の支持要因によって補わ変更されたメディアで行われたので、追加のコントロールは、分化のメディアの効果を確認する内皮細胞の不在下でメディアを用いて行った。この分析の詳細については、図4に示されています。
図1インスリンを発現する細胞にhESCの分化のための多段階のプロトコルです。
図2：ヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉誘導。とウォルトマニン4日間アクチビンにさらさhESCの細胞の代表的なDEマーカーのA）定量RT-PCR解析。その結果、AR eは未分化hESCのに関して正規化。 B）SOX17染色（緑）およびDAPI（青）SOX17の核発現を示しています。スケールバー：50μmである。
内胚葉細胞由来の胚性幹細胞の図3。膵臓前駆細胞の誘導。 DE誘導後4日間シクロパミンとレチノイン酸にさらされるのhESC由来の内胚葉細胞の早期膵臓マーカーのA）定量RT-PCR解析。結果は、未分化hESCのに関して正規化。 B）PDX1染色（紫）およびDAPI（青）PDX1の核発現を示しています。スケールバー：50μmである。
図4膵臓成熟段階）定量RT-PCR hESCの膵ホルモンの分析DAPTを使用して、膵臓の成熟した後、共培養または共培養培地（コントロール）に連絡してください。結果は、未分化hESCのに関して正規化。 p値はStudentのt-検定によって得られた。 B）RHMVEC（赤）標識ディル-AC-LDLとの共培養は、空のスペースは（上）がある場合は、ECSはプレートに取り付け、他のRHMVECが差別ESC（下）に直接接触して見つけることができる領域を示しています。共培養法を用いて分化した細胞のC）C-ペプチド（緑）染色。スケールバー：12.5ミクロン（上）と50μm（下）D）RHMVECの免疫染色では、RHMVECにはインスリンの発現を示していません。
| マーカー | Primer1（5 'から3'）</ TD> | Primer2（5 'から3'） | 参照 |
| SOX17 | CTCTGCCTCCTCCACGAA | CAGAATCCAGACCTGCACAA | 12 |
| CXCR4 | CACCGCATCTGGAGAACCA | GCCCATTTCCTCGGTGTAGTT | 4 |
| FOXA2 | GGAGCGGTGAAGATGGAA | TACGTGTTCATGCCGTTCAT | 12 |
| PDX1 | AAGTCTACCAAAGCTCACGCG | GTAGGCGCCGCCTGC | 4 |
| PTF1 | CATAGAGAACGAAACCACCCTTTGAG | GCACGGAGTTTCCTGGACAGAGTTC | 12 |
| HLXB9 | CACCGCGGGCATGATC | ACTTCCCCAGGAGGTTCGA | 4 |
| HNF6 | TGTGGAAGTGGCTGCAGGA | TGTGAAGACCAACCTGGGCT | 5 |
| PAX6 | CGAATTCTGCAGGTGTCCAA | ACAGACCCCCTCGGACAGTAAT | 5 |
| NKX6.1 | AGACCCACTTTTTCCGGACA | CCAACGAATAGGCCAAACGA | 5 |
| ISL1 | GATCTATGTCACCTCGCAAGG | TACAACCACCATTTCACTG | 12 |
| グルカゴン | AGGCAGACCCACTCAGTGA | AACAATGGCGACCTCTTCTG | 4 |
| インスリン | AAGAGGCCATCAAGCAGATCA | CAGGAGGCGCATCCACA | 12 |
表1。定量PCR反応に用いたプライマー。
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Discussion
膵臓の開発中に、差別膵臓細胞では、大動脈からの内皮細胞と近接している。さらに、膵島は、血糖と膵島ホルモンの迅速な交換を促進するために密に血管があります。これらの事実を考えれば、内皮細胞が膵臓器官形成の過程において重要な役割を果たしていることは驚くべきことではない。膵臓の開発中の血管内皮細胞の重要性はますます高く評価されている間、胚細胞のin vitro分化におけるその役割はあまり検討されている。私たちの以前の報告では、マウス胚性幹細胞13の膵臓の成熟における内皮細胞の積極的な役割を確立した。現在の研究ではヒト胚性幹細胞の分化に内皮細胞シグナリングの効果を調べる。
複数の内皮細胞は、このプロトコルで使用されていた、そのうちのすべては、同様の全体的な効果althouの結果分化の効率の変化とGH。現在のレポートでは、ラット心臓微小血管内皮細胞（RHMVEC）との共培養のhESC由来の膵臓前駆細胞の効果を提示します。内皮細胞は内皮細胞に特異的であるAC-LDL染色によって、便利に可視化することができる。あらかじめ染色された内皮細胞との差別化ESCの共培養は、内皮細胞のほとんどが長期間培養に生存していた一方で、RHMEVが徐々に4日後に消え、もはや成熟の6日後に検出されなかったことを示した。 RHMVECの不在は、したがって、共培養プロトコルの最適化のために選ばれた、ソートの必要性を排除することによって分析を簡素化します。
本研究では明らかに膵臓の成熟を誘導する内皮細胞の正の効果を示すが、このような誘導の正確なメカニズムはまだ不明であり、現在我々の研究室で検討されている。 FEワットもっともらしいメカニズムは、（i）可能性があり、細胞分泌分子ノッチシグナリング（iii）の内皮細胞から分泌される細胞外マトリックスの役割（II）血管内皮細胞媒介性阻害の効果。最初のカテゴリは、細胞 - 細胞接触を必要としませんが、そのような接触は2番目と3番目のカテゴリは必須です。したがって、私たちは別の共培養の構成を使用していくつかの予備的分析を行った：（i）の接触共培養（II）トランスウェル共培養及び（iii）培地の培養。ウェル共培養に続く;培地の培養は、インスリンの発現（データは図示せず）上に最小限の効果をもたらしながら、それが接触共培養では、最大の差別化の結果としてインスリンの発現によって判断することが観察された。これらの分析は、細胞間接触が重要である一方で、同様に重要ないくつかの短命の分泌分子があるかもしれないことを示しています。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は116520 DP2 NIHの新しいイノベーター賞とORAUラルフポウジュニア教員強化賞からのサポートを認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 (with supplement) | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 11330-032 | |
| MCDB-131 | Invitrogen | 10372019 | |
| MCDB-131 (Complete) | VEC Technologies | MCDB-131 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | 100ng/ml |
| Wortmannin | Invitrogen | W3144 | 1μM |
| KAAD-Cyclopamie | Sigma-Aldrich | C4116 | 0.2μM |
| All-Trans Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | 2μM |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | 30μM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | 25 μg/ml |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | 50 μg/ml |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | 10ng/ml |
| EndoGro | VEC Technologies | ENDOGRO | 10mg |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 90μg/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1μg/ml |
| NucleoSpin RNA II | Macherey-Nagel | 740955 | |
| ImProm II reverse transcription System | Promega Corp. | A3800 | |
| Brilliant II SYBR Green QPCR master mix | Stratagene, Agilent Technologies | 600548 | |
| Sox17 goat polyclonal IgG | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-17355 | 1/500 |
| PDX1 goat polyclonal IgG | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-14662 | 1/500 |
| C-Peptide Rabbit polyclonal | Cell Signaling Technology | 4593 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-21447 | 1/1000 |
| Table 2. Reagents and Kits | |||
References
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