Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

TransFLP - שיטה גנטית לשינוי Published: October 8, 2012 doi: 10.3791/3761
Automatic Translation
1
1Global Health Institute, School of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

שיטה מהירה כדי לשנות את הגנום של

Abstract

מספר שיטות זמינות כדי לתפעל כרומוזומים חיידקים 1-3. רוב הפרוטוקולים הללו מסתמכים על ההחדרה של פלסמידים replicative מותנה (למשל חסת replicons תלוי-PIR או רגיש לטמפרטורת 1,2). פלסמידים אלה משולבים לתוך הכרומוזומים חיידקים המבוססים על רקומבינציה הומולוגיה בתיווך. מוטנטים insertional כאלה לעתים קרובות להשתמש ישירות בהגדרות ניסיוניות. לחלופין, בחירה לכריתת פלסמיד ואחרי ההפסד שלה ניתן לבצע, אשר לחיידקים גראם שליליים, לעתים קרובות מסתמכת על אנזים sucrase נגד בחירת levan מקודד על ידי גן sacB 4. הכריתה יכולה לשחזר את הגנוטיפ טרום כניסה או תוצאה בחילופים בין כרומוזום והעתק פלסמיד המקודד של הגן השונה. חסרון בשיטה זו הוא שזה זמן רב. פלסמיד יש המשובט ראשון, זה דורש העברה אופקית לV. cholerae (ביותר n otably ידי הזדווגות עם E. זן חיידק תורם) או שינוי מלאכותי של האחרון, והכריתה של פלסמיד הוא אקראי וגם תוכל לשחזר את הגנוטיפ הראשוני או ליצור שינוי הרצוי, אם אין ברירה חיובית הוא הפעיל. כאן, אנו מציגים שיטה למניפולציה מהירה של V. כרומוזום cholerae (הים) 5 (איור 1). שיטת TransFLP זה מבוסס על האינדוקציה גילתה לאחרונה כיטין בתיווך של כישורים טבעיים באורגניזם 6 והשני נציג זה של Vibrio הסוג כמו V. 7 fischeri. יכולת הטבעית מאפשרת את הספיגה של דנ"א בחינם כולל שברי DNA PCR שנוצר. ברגע שמתחיל לעלות ומשלב מחדש את ה-DNA בכרומוזום נתון הנוכחות מינימאלית של 250-500 נקודתי בסיס של איגוף האזור 8 הומולוגיים. כולל סמן בחירה שבין אזורי איגוף אלה מאפשר זיהוי קל של transformants לעתים קרובות המתרחש.

t "> שיטה זו יכולה לשמש למניפולציות גנטיות שונות של V. cholerae וחיידקים באופן טבעי מוסמכים פוטנציאלי גם אחרים. אנו מספקים שלוש דוגמאות רומן על מה שניתן להשיג בשיטה זו בנוסף למחקר שלנו שפורסם בעבר על מחיקות גן יחידות ו תוספת של רצפי זיקת תג 5. צעדי ייעול כמה נוגעים לפרוטוקול הראשוני של שינוי כיטין המושרה טבעי 6 תשולבנה בפרוטוקול TransFLP זה. אלה כוללים בין השאיר את ההחלפה של רסיסי פגז סרטנים ידי כיטין פתיתים זמינות מסחרי 8, התרומה של ה-PCR דנ"א המופק כהפיכת חומר 9, ותוספת של אתרי יעד FLP-רקומבינציה (FRT) 5. אתרי FRT לאפשר כריתת אתר ביים של סמן הבחירה מתווך על ידי FLP recombinase 10.

Protocol

שיטת TransFLP (איור 1) באה לידי ביטוי בשלוש גישות שונות: אני) את המחיקה של שני גנים סמוכים מקודדים גורמים ארסיים של V. cholerae (למשל, ΔctxAB); השני) הסרת אי פתוגניות (למשל, ΔVPI-1), ושלישי) שילוב של רצף T7 RNA פולימראז תלוי מקדם מכירות במעלה זרם של גנים של אינטרס, אשר לאחר מכן מאפשר לו ביטוי מלאכותי ברקע המתח המתאים (למשל, T7-tfoX) (איור 2).

1. הכנת פתיתי כיטין

  1. 50-80 מ"ג המשקל של פתיתי כיטין בצינור פלסטיק סטנדרטי 1.5 מ"ל. זה יכול להיות מוכן בכמויות גדולות. פתיתי כיטין זמינות מסחרי מסיגמא (מספר קט C9213).
  2. חיטוי את הפתיתים שומרות את המכסים של הצינורות פתוחים.
  3. מייד לסגור את המכסים לאחר החיטוי התקרר.
  4. חנות autoclaved פתיתי כיטיןבטמפרטורת חדר.

2. אופציונלי: שינוי מלאכותי של ו ' cholerae עם FLP recombinase קידוד פלסמיד

  1. הכן electrocompetent V. תאי cholerae באמצעות שיטות סטנדרטיות 11. אחסן aliquots של תאים מוסמכים ב-80 ° C.
  2. הוסף 1-2 μl של מיני הכנה רגילה של פלסמיד PBR-FLP 5 עד electrocompetent V. תאים וcholerae להעביר את התערובת לתוך electroporation קובט (0.2 רוחב פער סנטימטרים).
  3. החל דופק ב1.6 קילו וולט.
  4. הוסף 0.9 מיליליטר מדיום SOC, בעדינות להעביר לתא צינור מ"ל סטנדרטי 14. דגירה הלא מרגשת עבור 2.5-3 שעות ליום 30 ° C.
  5. 100 μl פלייט ו300 μl על צלחות המכילות LB 100 מיקרוגרם / המ"ל אמפיצילין ולדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  6. לטהר שיבוט אחת וחנות כמניית גליצרול לניסויי TransFLP עתידיים.

3. עיצוב oligonucleotide ושרשרת פולימראז

  1. לפחות שישה oligonucleotides נדרש להגביר אזור הדנ"א (הים) של עניין, כמו גם FRT-המוקף קלטת האנטיביוטיקה באמצעות PCR (איור 3). מומלץ לכלול גם זוג יחול oligonucleotides מחוץ לבר PCR המוכנס. זה מאפשר את הבדיקה לשילוב וכריתה נכונה של קלטת עמידות לאנטיביוטיקת FRT מוקף-(לדוגמה מתוארת כפריימרים 'CHK מטה' למעלה CHK 'ובתרשימי 3 עד 5).
  2. עצב את oligonucleotides # 2, # 3, # 4, ו# 5 עם טיפול. הם צריכים להיות מסוגלים מספיק כדי לחשל (למשל ~ 28 נ"ב) ל-DNA התבנית. ה-DNA היא תבנית הדנ"א הגנומי (gDNA) לפריימרים # 2 ו # 5 וFRT קאן-FRT המכיל DNA פלסמיד כגון pROD17 12 ו PBR-FRT קאן-FRT (מחקר זה) לפריימרים # 3 ו # 4 ( איור 3 א).
  3. עצב את פריימרים # 2 # 5 מאפשרים לבסיס שיוך נרחב בקצה 5'בין # 2 / # 3 ו # 4 / # 5, בהתאמה (האיור 3A
  4. בצע 3 תגובות עצמאיות PCR כמו סיבוב 1 st של ה-PCR. הראשון יהיה להגביר את האזור במעלה הזרם של הגן / DNA-אזור של אינטרס בסיוע oligonucleotides # 1 ומס '2. PCR צריך לגרום שבר של לפחות 500 נ"ב באורך המאפשרים הומולוגי רקומבינציה בתוך התאים. ברים קצרים יותר (~ 250 נ"ב) יכולים להיות 8 מספיק אבל לא מומלצים.
  5. במקביל לבצע PCR השני, אשר מגביר את קלטת אנטיביוטיקת FRT המוקף-. לדוגמות שניתן כאן אנחנו בעיקר משמשים APH (קאן R). oligonucleotides שימוש # 3 ומס '4 לתגובה זו (איור 3 א).
  6. במקביל, מגביר את אזור מורד DNA באמצעות PCR (מדגם שלישי). בר PCR צריך להיות גם לפחות 500 נ"ב באורך. לבצע PCR עם gDNA כתבנית וoligonucleotides # ​​5 ו # 6 (איור 3 א).
  7. לאחר טיהור של כל השלושה PCRברים, לבצע סיבוב 2 nd של ה-PCR. השתמש בתערובת שווה של כל שלושת שהברים שהושגו בסיבוב הראשון כתבנית. ההגברה מזורזת על ידי oligonucleotides # 1 # 6. בר PCR שהתקבל (איור 3 ב ') משמש כהפיכת ה-DNA בניסוי השינוי הטבעי (איור 1).

4. שינוי טבעי כיטין מושרה

  1. לגדול V. תאי cholerae האירובי במדיום עשיר ב30 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים צפיפות אופטית ב 600 ננומטר של כ -0.5.
  2. לקצור את החיידקים על ידי צנטריפוגה. שטוף את הכדור פעם אחת במצע מלאכותי מוגדר (6 DASW) לפני resuspending התאים ב2 כרכים של DASW. הוסף 1 מ"ל של תרבות ל50-80 מ"ג פתיתי כיטין סטרילי (הסביר בנקודת 1). אם חיידקי הנמל פלסמיד PBR-FLP (נקודה 2 אופציונליים), תוספת אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) לתרבות. לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות ללא תנועה.
  3. הוסף & Gדואר; 200 ננוגרם של 2 nd הבר בסיבוב PCR-derived (הסביר בנקודה 3). מערבב בזהירות בלי להרים את החיידקים בהרחבה ממשטחי כיטין. לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ללא תנועה.
  4. מערבולת התרבות נרחבת ל≥ 30 שניות. מורח 100-300 μl על צלחות בינוניות LB סלקטיבית (צלחות LB גנטמיצין המכיל למשל kanamycin או לדוגמאות המסופקות כאן). השתמש בצלחות כפולות סלקטיבית אם חיידק נמל PBR-FLP פלסמיד ידי הוספת אמפיצילין במקביל לאנטיביוטיקה האחרת. דגירת צלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות או עד מושבות גלויות.
  5. מבודד transformants הבודד מצלחות סלקטיבית. transformants כאלה החליף את לוקוס הכרומוזומים המקורי על ידי בר PCR בשל אירוע מוצלב כפול. זנים אלה יכולים לשמש ישירות לניסויים נוספים במקרה של הסרת קלטת האנטיביוטיקה אינה הכרחית.

5. הסרת קלטת סלקטיבי (הים) על ידי FLP-רקומבינציה

  1. מלאכותי להפוך transformants עם PBR-FLP פלסמיד כאמור בשלב 2, אם לא עשה לפני assay השינוי הטבעי.
  2. לגדל את החיידקים על צלחות אגרו LB המכילים אמפיצילין על 37 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות. אפשרויות: לשנות את הטמפרטורה בין 2-3 שעות לעד 40 מעלות צלזיוס כביטוי של FLP מפלסמיד PBR-FLP הוא דה מודחקת-5,10 בטמפרטורות הגבוהה; חיידקי העברה לצלחות רעננים אחרי כ. 8 שעות של דגירה.
  3. מבחן לרגישות לאנטיביוטיקה (הדגים כאן לkanamycin; איור 1) על ידי restreaking את השיבוטים במקביל על צלחות אגרו המכילות אנטיביוטיקה ואנטיביוטיקה חופשיות. מבודד מושבות רגישות בודדות. הקפא שיבוט אמפיצילין עמיד כמניית גליצרול אם אתה מתכוון לשנות את המאמץ במחיקה / הכנסה באמצעות TransFLP אחרות נוסף.

6. אשפרה פלסמיד

  1. לגדול תרבות לילה בתנאים אירוביים ויום 30 ° C. השתמש במדיום עשיר ללא תוספת של כל אנטיביוטיקה.
  2. אופציונלי: לגדול תרבות טריה עבור 3-6 שעות על ידי דילול 1:100 תרבות הלילה במדיום טרי אנטיביוטיקה חופשיה.
  3. דילול צלחת או פס (הים) של תרבות על צלחת אגר LB הרגילה (הים) ו דגירה של 30 ° C עבור 8-16 שעות (עד מושבות גלויות).
  4. מבחן לאמפיצילין רגישות של השיבוטים ידי restreaking את השיבוטים במקביל על צלחות אגרו המכילות אנטיביוטיקה ואנטיביוטיקה חופשיות (איור 1). הקפא מתח אמפיצילין רגיש כמניית גליצרול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות מייצגות של השלוש הדוגמות מוצגות באיורים 4 עד 6. הגישה הראשונה שמטרתו למחוק את הגנים השכנים ctxA וctxB. יחד הם לקודד גורם הארסיות המרכזית של ו ' cholerae, רעל כולרה. אנו מעוצבים oligonucleotides לשיטת TransFLP כפי שתואר לעיל ובהתאם לאיור 3. הלחץ של ההורים, מתח ביניים מחסה קלטת עמידות לאנטיביוטיקת FRT מוקף-במוקד המקורי DNA של ctxAB והמתח הסופי נמחק לctxAB ושחרר את הקלטת של ההתנגדות היה כל נבדק לגנוטיפ (איור 4). שיטת הבחירה הייתה PCR כל התאים. אנחנו השתמשנו פריימרים שלא anneal לקטע הפיכת PCR אבל רק ל-DNA כרומוזומלית (איור 3). זה אפשר לנו לאמת את המטבע הספציפי לאתר של בר PCR עם הומולוגי האזור של כרומוזום (Figure 4A). שברי PCR היו מופרדים על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose הסטנדרטי כדי לקבוע את הגודל שלהם (איור 4 ב). אסטרטגיה זו יכולה לשמש כדי לבדוק את מתח ביניים ולאשר את מבנה המתח הסופי (הים).

לדוגמה השנייה, הסרת האי גנומי שלם, בחרה פתוגניות Vibrio 1 האי (VPI-1) כיעד 13. הליך TransFLP הסטנדרטי שתואר לעיל הייתה לא מוצלח במקרה זה. זה היה ידוע ממחקרים קודמים כי אזור הדנ"א כה גדול ניתן להחליף באזור ה-DNA בגודל דומה באמצעות שינוי כיטין מושרה טבעי 9. השערתנו, אפוא, כי ההבדל בגודל בין אזור ליימחק והקטע הקצר למדי הפיכת PCR (<3.5 ק"ג) עשוי להיות גורם המגביל. לכן החלטנו להשתמש בשיטת TransFLP בשני שלבים: אנו משולבים 1 APH הגן (קאן R) קדם אחת FRאתר T בתחילת VPI-1 (שמודגם באיור 5A). לאחר מכן בצענו סיבוב שני של שינוי טבעי, אשר אפשר לנו להכניס את קלטת נוספת אנטיביוטיקת התנגדות (GM R, המקנה התנגדות גנטמיצין) ואחריו אתר FRT 2 בסוף אי פתוגניות (5A איור). הזן המתאים כפול העמיד היה electroporated להכניס PBR-FLP פלסמיד ושיטת TransFLP נמשכה כמתואר לעיל. המתח וכתוצאה חסר כל VPI-1, כפי שאומת באמצעות PCR של מטוהר הדנ"א הגנומי (5B איור).

לדוגמה השלישית אנו משולבים רצף T7 רנ"א פולימרז תלוי אמרגן במעלה זרם של גנים של אינטרס, במקרה שלנו גן מקודד הווסת העיקרי לשינוי טבעי 6 tfoX. הדבר נעשה תוך שימוש בשיטת TransFLP עם שינויים קלים מהפרוטוקול הסטנדרטי: אנו כללנו עמ התלוי T7-RNAרצף romoter קונסנסוס לפי מס. 14 כמסוכך לתוך oligonucleotides # ​​4 ו 5. עם אסטרטגיה זו רצף T7 רנ"א פולימרז התלוי האמרגן נשמר על כרומוזום גם לאחר קלטת עמידות לאנטיביוטיקה הייתה ניכרת (איור 6). אנו משולבים במבנה V. cholerae מתח ADVCH-T7POL, שמטפח את גן פולימראז T7 RNA מונע על ידי אמרגן lacUV5 (Blokesch, לא פורסם). כדי לבדוק את הפונקציונליות של המבנה, כלומר ביטוי T7 רנ"א פולימרז התלוי של tfoX, בצעו מבחני שינוי טבעיים במדיום LB. הלחץ של ההורים הוא לא טבעי transformable בתנאים אלה עקב חוסר שעתוק tfoX במדיום עשיר ובהעדר של כיטין inducer הטבעי (איור 6). פנוטיפ זה היה תלוי בשאלה אם RNA פולימראז T7 היה מושרה באופן מלאכותי על ידי IPTG או לא (איור 6, נתיבי 1 ו 2, respectively). עם זאת, המתח שנוצר TransFLP ADVCH-T7POL-T7-tfoX :: FRT, המכיל את אמרגן T7 רנ"א פולימרז התלוי במעלה זרם של כשירות הגן tfoX, היה באופן טבעי transformable אכן במדיום עשיר (6 איור, נתיבים 3 ו 4) . בשל הדליפה של lacUV5 האמרגן במדיום LB 15 פולימראז T7 RNA הופק tfoX כבר תומלל מפולימראז תלוי אמרגן T7 RNA ללא אינדוקציה. זו יכולת יזמה טבעית והפיכה המאשרת את הפונקציונליות של הרצף המשולב T7 רנ"א פולימרז תלוי האמרגן (6 איור, 3 מסלולים). פנוטיפ זה היה משופר באופן משמעותי על ידי אינדוקציה מלאה של RNA פולימראז T7 בשל תוספת של inducer של lacUV5 האמרגן, IPTG (6 איור, 4 מסלולים).

איור 1
איור 1.תרשים זרימה של שיטת TransFLP. שש הנקודות שתוארו בפרוטוקול זה מנוסח:..;: שינוי מלאכותי של ו '1) הכנת פתיתי כיטין 2) אופציונלי cholerae עם FLP recombinase קידוד פלסמיד;. 3) עיצוב oligonucleotide ותגובת שרשרת פולימרז;. 4) שינוי כיטין מושרה טבעי; 5) להסרה של קלטת סלקטיבית (הים) על ידי FLP-רקומבינציה;... 6) ריפוי פלסמיד לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2
איור 2. ייצוג סכמטי של שלוש אפשרויות יישום לשיטת TransFLP. אני) 1458 בר BP-DNA, המכיל רעלן הכולרה קידוד גני ctxA וctxB, נמחק כפי שצוין על ידי Δ. השנייה) ~ 40 KB Vibrio פתוגניות האי 1 (VPI-1 13)נמחק מהזן פראי הסוג. III) רצף T7 רנ"א פולימרז תלוי אמרגן (28 נ"ב) שולב במעלה זרם של גן tfoX. המלבן האדום מציין שמאל מאחורי רצף נוקליאוטידים קצר של אתר היחיד FRT 10. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3
איור 3. הסבר לעיצוב פריימר וביצועים של ה-PCR מבוסס על המחיקה של ctxAB. לוח: לסיבוב 1 st של ה-DNA PCR גנומי (gDNA) ופלסמידים pROD17 12 ו PBR-FRT קאן-FRT, בהתאמה, שמש כתבניות. את oligonucleotides הדרוש הוא # 1 עד # 6. פריימר # 2 / # 3 ו # 4 / # 5 (למשל בהבלעה) צריך גם להחזיק חפיפה משמעותית זה לזה ב5'ends. לוח ב ': אחרי הסיבוב של 2 ndPCR, המבוסס על 1 ברי PCR העגולים הרחוב כתבניות, בר ארוך צריך להיות שהושג באמצעות זוג פריימר # 1 + # 6. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 4
איור 4. תוצאה צפויה שהודגמה לאסטרטגית מחיקת ctxAB. הזן המקורי (wild-type), insertional מוטצית Δ ctxAB :: FRT קאן-FRT, והמתח הסופי Δ ctxAB :: FRT נבדק לגנוטיפים שלהם. לוח: ייצוג סכמטי של כוח הבידול של זוג ctx-CHK-up פריימר וctx-CHK כלפי מטה, בעיקר ביחס לכריתה של קלטת האנטיביוטיקה. לוח ב ': תאים שלמים של חיידקים שמשו כתבנית בתגובות PCR. כדי לבדוק את ה-DNA השתנה מוקד פריימרים CHK למעלה ולמטה CHK נוצלו. שברי PCR המוגברים הופרדו על ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל ומדמיינים באמצעות דנ"א בטוח SYBR כתם. 1 ליין: Wild סוג V. מתח cholerae; מסלול 2: המתח Δ ctxAB :: FRT קאן-FRT; 3 מסלולים: Δ ctxAB :: FRT. הגדלים צפויים PCR בר פי פנל מצוינים בצד ימין. L, סולם 1KB (Invitrogen). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 5
איור 5. אסטרטגיה כדי לוודא את המחיקה של אי גנומי. לוח: תכנית של Vibrio פתוגניות 1 האי (VPI-1) (מותאם באופן חופשי ממס 16; לא לקנה מידה.). לזן פראי סוג האזור של עניין הוא שאינם amplifiable באמצעות התקן ה-PCR ופריימרים VPI-1-ספציפי CHK-CHK ומטה (~ 40 ק"ג). לכן נוסףoligonucleotide חישול בתוך האזור ליימחק-יושם (VC0817 גב) יחד עם VPI-CHK-up. לוח ב ': תוצאת נציג באמצעות הדנ"א הגנומי מהזנים המתאימים כתבנית ואת זוגות פריימר שצוין לעיל כל תמונה. זנים שנבדקו: Wild סוג V. cholerae המתח (1 שביל), המתח VPI :: FRT-Kan/Gm-FRT (מסלול 2), וΔVPI-1 :: FRT (3 נתיבים). גדלים של שברי PCR כפי שחזו בפנל מצוינים בצד ימין. L, סולם 1KB (Invitrogen). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 6
איור 6. פנוטיפ נציג לאחר החדרת רצף אמרגן מלאכותי. רצף T7 רנ"א פולימרז תלוי האמרגן היה משולב במעלה זרם של tfoX גן רגולצית יכולת השימוש TransFLP methoד (סקיצה מעל הגרף). V. ההורי cholerae מתח (ADVCH-T7POL) מכיל גן פולימראז T7 RNA מונע על ידי אמרגן lacUV5. גרף: המתח ההורי ADVCH-T7POL (נתיבי 1 ו 2) ואת הלחץ שהופעל על ידי TransFLP (ADVCH-T7POL-T7-tfoX :: FRT; נתיבי 3 ו 4) נבדק ל transformability הטבעי בהעדר (נתיבי 1 ו 3 ) או נוכחות של 1mm IPTG (נתיבים 2 ו 4). הדנ"א הגנומי הפיכה נגזר מזן A1552-LacZ קאן 8. תדרי טרנספורמציה ניתנים על ציר ה-Y. <ד"ל, מתחת לגבול גילוי של ~ 5 X 10 -8. ** P <0.01 (כפי שנקבע על ידי מבחן t של סטודנט נתוני יומן הפך-). חץ שחור עם 'T7' טקסט:. רצף אמרגן פולימראז התלוי T7 רנ"א לוחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטת TransFLP שתוארה לעיל ובמקומות אחרים 5 כבר נעשה שימוש נרחב במעבדה שלנו. הסוג של מניפולציות גנטיות שישימות כולל בין שאר: מחיקה של גנים בודדים ואשכולות גנים, מחיקה של איים גנומיים (למשל, VPI-1), החדרה של רצפים במעלה זרם של גן של עניין (למשל, רצפי פרומוטר) והחדרה של רצפים בסוף הגן ספציפי (למשל, תגי זיקת קידוד).

תנאי מוקדם ליבוא TransFLP הוא שV. המתאים לחץ הוא טבעי cholerae transformable. לפעמים זה לא מצב, במיוחד בבידודים נגזרים מחולי הכולרה. זנים כאלה לעתים קרובות מוטציה בתוך למשל חישת הקוורום המעגל, בתוך גן מקודד הווסת העיקרי למניין חישה, 17 HapR. מתן בחזרה עותק של hapR משחזר transformability הטבעי בזנים אלה 6 כexemplified למתח HapR-הפגום N16961 18.

שינויים אפשריים יכולים להיות משולבים, כגון העשרה של החיידקים לאחר שינוי טבעי 8 במקרה התדירות נמוכה מדי. שים לב שתדירות השינוי היא באופן כללי נמוכה יותר במקרה PBR-FLP פלסמיד קיים כבר בעת עושה את assay השינוי הטבעי כיטין המושרה. זה נגרם ככל הנראה על ידי דליפה חלקית של הביטוי הרגיש הטמפרטורה של גן FLP מPBR-FLP, אשר יגרום לכך בטרם עת כריתה של קלטת עמידות לאנטיביוטיקה וחוסר היכולת לבחור לtransformants אלה. לכן אנו ממליצים למקרים קריטיים להכניס PBR-FLP פלסמיד לאחר שלב השינוי הטבעי.

שלב קריטי נוסף הוא סיבוב 2 nd של ה-PCR, שישלב את השלושה שברי 1 st-PCR העגולים. זה יכול להתרחש שברים חלקיים קיימים לאחר PCR הפליליction (למשל, הרכבה חלקית של רק רסיסים "למעלה" ופי 'FRT קאן-FRT' באיור 1). זה זניח, כפי כפול הומולוגי רקומבינציה עם אזור כרומוזומליות הממוקד אינו יכולה להתרחש במצב זה. כtransformants רק מחסה קלטת עמידות לאנטיביוטיקה נבחרת ל, כל transformants האחר עם חילופי DNA שאינם רצויים הם שלילי.

נקודה נוספת שכדאי לזכור היא לגבי חזרתו של הנוהל לכמה סיבובים. יש לנו כבר שלב בהצלחה את המחיקה של אשכול גני ctxAB עם המחיקה של פתוגניות האי (VPI-1) ואשכול גנים ארסיים אחר (Blokesch, לא פורסם). יתר על כן, יש לנו משולב אמרגן T7 רנ"א פולימרז התלוי ביעילות בתוך הזנים הללו (במעלה הזרם tfoX ובמקומות אחרים). עם זאת, גנוטיפ חזה צריך להיבדק באופן קבוע לכל מתח ביניים (למשל, על ידי מושבה-PCR כדemonstrated באיור 4). זה יעזור להוציא רקומבינציה לא הרצויה FLP בתיווכו של השמאל מאחורי צלקות FRT (כפי שמוצג אדום מלבני בכל הדמויות) אחד עם השני בזמן PBR-FLP פלסמיד הוא עדיין קיים בחיידקים. זה יכול כנראה להתעלם לגנים הממוקמים בריחוק, כמו ההסתברות שהכריתה שבין האזור תהיה קטלנית עקב המחיקה של גנים חיוניים הוא גבוה מאוד.

לבסוף, ברצוננו לדון במחיקה של גנים בתוך operons. אנחנו לא יכולים לשלול שהמחיקה של גן במעלה זרם, מה שמשאיר צלקת FRT מאחור, עשויה לשנות את הביטוי של הגן במורד הזרם (הים). כדי להבטיח שהשפעה זו אינה גורמת פנוטיפ הצפייה, אבל שזה אכן נגרם על ידי המחיקה, assay complementation מומלץ. פקד אחר שכבר השתמשנו בהצלחה במעבדה הוא שילוב של מורד צלקת FRT של withou גנים של האינטרסלא מוחק את האפשרות השנייה. אנו לא צופים בעיות כאלה במעבדה שלנו אבל עדיין אינו יכולים לשלול את קיומם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

ברצוני להודות אולגה דה סוזה סילבה לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע שויצרי (SNSF) גרנט 31003A_127029.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chitin flakes Sigma C9213 Autoclaving required
OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) Biorad 165-2100 Or comparable electroporators

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, V. L., Mekalanos, J. J. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).
  2. Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).
  3. Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).
  4. Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).
  5. De Souza Silva, O., Blokesch, M. Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination. Plasmid. 64, 186-195 (2010).
  6. Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310, 1824-1827 (2005).
  7. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).
  8. Marvig, R. L., Blokesch, M. Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure. BMC Microbiol. 10, 155 (2010).
  9. Blokesch, M., Schoolnik, G. K. Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs. PLoS Pathog. 3, e81 (2007).
  10. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, 9-14 (1995).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A laboratory manual. Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. 1, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  12. Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells. Cell. 133, 90-102 (2008).
  13. Karaolis, D. K. R. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).
  14. Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo. Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).
  15. Pan, S. H., Malcolm, B. A. Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3). Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).
  16. Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani,, Kamruzzaman, M., Mekalanos, J. J. Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage. Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).
  17. Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae. Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).
  18. Heidelberg, J. F. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 406, 477-483 (2000).

Tags

אימונולוגיה גיליון 68 מיקרוביולוגיה גנטיקה שינוי טבעי ספיגת ה-DNA רקומבינציה FLP כיטין,
TransFLP - שיטה גנטית לשינוי<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; בהתבסס על שינוי הטבעי וFLP-רקומבינציה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blokesch, M. TransFLP — A… More

Blokesch, M. TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination. J. Vis. Exp. (68), e3761, doi:10.3791/3761 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter