Summary
一个快速的方法来修改的基因组
Abstract
有几种方法可用来操纵细菌染色体1-3。这些协议大多依靠的条件复制型质粒插入（ 例如 PIR依赖或对温度敏感的复制窝藏1,2）。这些质粒基于同源性的介导的重组整合到细菌染色体中。这样的插入突变体往往直接用于实验的设置。可替换地，可以进行选择质粒切除后跟其损失为革兰氏阴性菌，往往依赖于计数器可选择的果聚糖蔗糖酶的酶编码的sacB基因的 4。的切除可以恢复的插入前的基因型或在经修饰的基因的染色体和质粒编码的副本之间的交换的结果。这种技术的一个缺点是，它是耗时的。首先被克隆的质粒，它需要五的水平转移到霍乱 （最多n个 otably通过交配与E.大肠杆菌供体菌株）或人工转变后者;和切除该质粒是随机的，可以恢复初始的基因型或创建所需的修改，如果没有施加正选择的。在这里，我们提出了一个方法，为快速操作的五霍乱弧菌染色体（）5（ 图1）。此TransFLP方法是基于最近发现的几丁质的自然能力介导的诱导在此有机体6和其他五，如弧菌属代表鲵 7。自然能力允许的游离DNA的摄取，包括PCR产生的DNA片段。一旦占用，存在一个最小的250-500的bp的侧翼同源区域8给出的染色体DNA的重组。包括选择标记这些侧翼区之间可以方便地检测经常发生转化的。
T“>这种方法可以用于不同的遗传操作的霍乱弧菌 ，可能还有其他的自然胜任的细菌。我们提供了三个新的例子可以用这种方法来完成的，除了我们之前发表的研究单基因缺失和另外的亲和标签序列。优化步骤，初始协议的几丁质引起的自然转换6注册成立在此TransFLP的协议，包括（其中包括）更换螃蟹壳碎片市售甲壳素片，捐赠PCR衍生的DNA为转化材料9，和另外的FLP重组目标网站（FRT）5。FRT收网站允许位点定向切除10 Flp重组酶介导的的选择标记。Protocol
的TransFLP方法（ 图1）通过三种不同的方法可以举出：Ⅰ）的两个相邻的基因，编码毒力决定因素五删除霍乱 （ 例如 ，ΔctxAB）;Ⅱ）去除的致病岛（ 例如 ，ΔVPI-1）和III）的T7 RNA聚合酶-依赖型启动子序列的融合利益一个基因的上游，这随后允许其人工表达的各菌株背景（ 例如，T7-tfoX）（ 图2）。
1。制备甲壳素片
- 体重50-80毫克的甲壳素片在一个标准的1.5毫升的塑料管。这可以批量制备。几丁质片市售自Sigma公司（目录编号C9213）。
- 保持管的盖，打开高压釜的薄片。
- 高压釜冷却下来后，立即关闭盖子。
- 商店蒸压甲壳素片在室温下。
2。可选：人工改造五霍乱 FLP重组酶编码质粒
- 准备电穿孔V。霍乱细胞使用标准的方法11。的感受态细胞的等分试样储存于-80℃。
- 将1-2μl的一个普通的小编制质粒pBR-FLP 5添加到电穿孔五霍乱细胞和将混合物转移到电穿孔比色皿（0.2厘米的间隙宽度）。
- 应用脉冲电压为1.6 kV。
- 添加SOC培养基，0.9毫升，轻轻细胞转移到一个标准的14毫升管。孵育非移动的为2.5至3小时，在30℃下
- 板加入100μl和300μl的LB平板上含有100μg/ ml氨苄青霉素和孵育在30℃下保温过夜。
- 净化单一的克隆和存储甘油为未来TransFLP实验。
3。寡核苷酸的设计和聚合酶链反应
- 需要至少六个寡核苷酸扩增的DNA区域（s）的利益，以及FRT-侧翼的抗生素盒通过PCR（ 图3）。建议还包括一个外插入的PCR片段的寡核苷酸对吸。这允许检查FRT-侧翼的抗生素抗性盒（ 例如，'CHK-'和'CHK-向下'引物，在图3至图5所示）的集成和正确的切除。
- ＃2，＃3，＃4，＃5小心设计的寡核苷酸。他们应该能够充分退火（ 例如 〜28 bp）的模板DNA。模板DNA为基因组DNA（基因组DNA）为引物，＃2和＃5和pROD17 12和PBR-FRT-KAN-FRT（本研究）为引物，＃3和＃4（FRT-阚-FRT-含有质粒DNA，如图3A）。
- 设计的引物，＃2至＃5允许广泛的碱基配对分别在其5'-末端＃2 /＃3和＃4 /＃5之间的，（ 图3A
- 执行3个独立的PCR反应作为第一轮PCR。第一个，将扩增的基因/ DNA区域的感兴趣的援助的寡核苷酸＃1和＃2的上游区域。 PCR应导致在一个片段中的至少500 bp的长度，以允许在细胞内的同源重组。较短的片段（约250 bp）的就足够了8，但不建议使用。
- 与此同时，进行第二次PCR，放大首次登记税两侧的抗生素磁带。对于所提供的实例，我们在这里主要用于APH（根 ）。使用的寡核苷酸＃3和＃4用于该反应（ 图3A）。
- 随之而来，扩增PCR（第三次采样）的下游DNA区域。 PCR片段的长度也应该至少500个基点。执行PCR基因组DNA为模板，寡核苷酸＃5和＃6（ 图3A）。
- 所有三种PCR纯化后片段，进行第二轮的PCR。使用等量混合物为模板，在第一轮中获得的所有三个片段。扩增催化寡核苷酸＃1和＃6。将所得的PCR片段（ 图3B）在自然的转染实验中（ 图1）作为转化DNA。
4。甲壳素引起的自然转化
- 成长五需氧霍乱细胞在加富培养基中在30℃，直到它们到达的光密度约为0.5，在600 nm。
- 通过离心收获细菌。洗沉淀一次，在规定的人工介质（DASW 6）在2倍体积的DASW前重悬细胞。加入1毫升的文化50-80毫克的无菌甲壳素片（解释第1点）。如果细菌港口质粒pBR-FLP（可选第2点），添加氨苄青霉素（50微克/毫升）的文化。在30°C孵育16-24小时不动。
- 添加＆GE，200 ng的第二轮PCR衍生片段（下解释第3点）。广泛分离的几丁质表面的细菌混合，小心不要。不移动的情况下在30℃孵育24小时。
- 涡广泛的文化≥30秒。 100-300微升传播选择性LB 培养基平板上（ 如卡那霉素或庆大霉素的LB板这里提供的例子）。使用双选择性平板怀有质粒pBR-FLP加入氨苄青霉素二者对其他抗生素的细菌。在30℃温育平板16-24小时，或直至菌落是可见的。
- 从选择性平板分离单转化。这种转化已经取代了原来的染色体位点的PCR片段，由于双交叉事件。这些菌株可直接用于进一步的实验中，是没有必要的情况下，去除抗生素盒。
5。去除选择性盒式（s）的FLP- 重组
- 人为地改变你的转化与质粒pBR-FLP前，先自然转化试验点2下，如果不这样做。
- 长出的细菌在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板在37℃下16-24小时。选项：改变中的温度在2-3小时之间，以40°C作为flp的表达质粒pBR-flp的压制在较高温度下5,10;转印后细菌到新鲜板约。 8小时的潜伏期。
- 抗生素敏感性（这里用于显示卡那霉素， 图1），通过在含抗生素和抗菌素的琼脂平板上平行restreaking克隆试验。隔离单敏感的殖民地。如果你打算进一步修改的应变与其他缺失/插入使用TransFLP，冻结氨苄青霉素抗性克隆甘油。
6。质粒消除
- 成长在有氧条件下培养过夜在30℃下使用加富培养基中不添加任何抗生素。
- 可选：稀释过夜培养1:100，在新的抗生素的培养基，生长的新鲜文化为3-6小时。
- 板或条纹稀释在普通LB琼脂平板（S）（S）的文化和孵化在30°C为8-16小时（至菌落可见）。
- 试验抗生素含和不含抗生素的琼脂平板上（ 图1）上并行restreaking克隆的氨苄青霉素敏感性克隆。冻结氨苄青霉素敏感的菌株甘油。
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Representative Results
代表性的结果在图4至图6中所示的三个例子的。第一种方法的目的是在删除邻近的基因CTXA的和 ctxB。他们一起进行编码的主要致病因子V。霍乱弧菌 ，霍乱毒素。我们设计寡核苷酸为TransFLP方法，如上述那样，按照图3。中间窝藏FRT-侧翼于原始的DNA位点的ctxAB和最终删除ctxAB和释放的抗性盒的菌株的抗生素抗性盒的菌株的亲本菌株，均测试其基因型（ 图4）。全细胞PCR方法的选择。我们使用不转化的PCR片段，但只到染色体DNA（ 图3）退火的引物。这使我们能够验证站点特定的PCR片段的交换与同源的染色体区域（FIGURE 4A）。分离PCR片段，通过标准的琼脂糖凝胶电泳，以确定它们的大小（ 图4B）。这种策略可以用来，检查应变中间体，并确定最终的应变结构（S）。
第二个例子中，拆除的全基因组岛，我们选择了霍乱弧菌致病岛1（VPI-1）目标13。在这种情况下，上述的的标准TransFLP程序不成功。它被称为从以往的研究，可以交换使用几丁质诱导的自然变换9由一个类似的大小的DNA区域，如此大的DNA区域。因此，我们假设，被删除的区域和相当短的转化的PCR片段（<3.5kb的）可能会对限制因素的大小差异。因此，我们决定使用TransFLP方法分为两个步骤：第一个集成了APH基因（ 根R）之前由一个单一的FR在开始的VPI-1（ 图5A中示出）的T位。然后，我们进行了第二轮的自然转化，这使我们能够插入一个额外的抗生素抗性基因（GM R，赋予庆大霉素耐药）的第二FRT网站的致病岛（ 图5A）。各自的双抗性菌株电穿孔插入质粒pBR-flp的和的TransFLP的方法如上所述继续。将所得菌株缺乏整个VPI-1，作为纯化的基因组DNA（ 图5B）通过PCR验证。
对于第三个例子中，我们集成了T7 RNA聚合酶启动子序列的上游基因的利益，在我们的情况下，该基因编码的主要调节的自然转化tfoX 6。这样做是使用TransFLP的方法有轻微的修改的标准协议：包括T7 RNA依赖的promoter共识序列，根据文献14出挑成的寡核苷酸＃4和＃5。在此战略下的T7 RNA聚合酶-依赖型启动子序列被保持在染色体上的即使在被切除的抗生素抗性盒（ 图6）。我们将建设成为五霍乱弧菌菌株ADVCH T7POL，这窝藏驱动由lacUV5启动子（Blokesch，未发表）的T7 RNA聚合酶基因。要测试的功能的构造，即，我们的T7 RNA聚合酶的依赖性表达tfoX在LB培养基中进行自然转化试验。亲本株是不自然可变形的，在这些条件下，由于缺乏tfoX在加富培养基中，并在它的自然诱导剂的几丁质（ 图6）的情况下的转录。这种表型是独立的T7 RNA聚合酶是否被人为经IPTG诱导表达与否（ 图6，泳道1和2，respe沉着应对）。然而，生成的TransFLP的应变ADVCH T7POL-T7-tfoX :: FRT，其中包含的T7 RNA聚合酶依赖的能力基因tfoX的启动子上游，确实是自然可变形的，在加富培养基中（ 图6，泳道3和4） 。由于在LB培养基中15所产生的T7 RNA聚合酶的T7 RNA聚合酶未经诱导的依赖型启动子已经转录tfoX从lacUV5启动子的泄漏。由此引发的自然能力和转化确认集成T7-依赖性RNA聚合酶启动子序列（ 图6，泳道3）的功能。此表型显着增强lacUV5启动子，IPTG（ 图6，泳道4）的诱导剂，除了由于充分诱导T7 RNA聚合酶。
图1。流程图的TransFLP方法。在本协议中所描述的六分起草单位：1）制备甲壳素片2）可选：人工改造V. 点击这里 霍乱 FLP重组酶编码质粒; 3）寡核苷酸的设计和聚合酶链反应; 4）几丁质诱导的自然转变; 5）去除的选择性盒（S）FLP重组; 6）质粒消除。 查看大图 。
图2。三个应用程序的可能性为TransFLP方法的示意图。 I）删除一个1458 bp的DNA片段，含有霍乱毒素基因ctxA和CTXB，由Δ。二）〜40 kb的弧菌致病岛1（VPI，1月13日 ）从野生型菌株被删除。 Ⅲ）甲T7 RNA聚合酶依赖的启动子序列（28 bp）的上游的tfoX基因整合。红色矩形表示留守的一个FRT网站10短核苷酸序列。 点击这里查看大图 。
图3。为ctxAB删除基于PCR的引物设计和性能说明。 A组：对于第一轮的PCR基因组DNA（基因组DNA）与质粒pROD17 12和PBR-FRT菅直-FRT，分别担任模板。所需的寡核苷酸是＃1至＃6。的引物＃2 /＃3和＃4 /＃5（例如，在插图）应当也具有显着的相互的重叠在其5'ends。 B组第二轮的后PCR，它是基于第一轮PCR产物为模板，很长的片段，应使用引物对＃1 +＃6。 点击此处查看大图 。
预期的结果如图4所示。例举为ctxAB删除策略。原株（野生型），插入突变体ΔctxAB :: FRT菅直人首次登记税，并最终应变ΔctxAB ::汽车首次登记税的基因型进行了测试。 A组：示意图的分化力量的引物对CTX-CHK-和CTX-CHK-下来，最引人注目的是切除的抗生素盒。 B组：所有细菌细胞被用来作为PCR反应的模板。要检查更改的DNA位点的引物CHK-和利用下CHK-。扩增得到的PCR片段，用琼脂糖凝胶电泳分离可视化使用SYBR安全的DNA染色。 1巷：野生型五霍乱菌株;泳道2：应变ΔctxAB :: FRT菅直人首次登记税;泳道3：ΔctxAB ::首次登记税。预计PCR片段的大小根据面板显示在右侧。 L，1KB阶梯（Invitrogen公司）。 点击此处查看大图 。
图5。确认删除的基因组岛的战略。 A组：计划弧菌毒力岛1（VPI-1）（自由改编自编号16;不按比例）。对于野生型菌株中，感兴趣的区域是通过标准PCR的VPI-1-特异性引物CHK-向上和向下（CHK-〜40 kb的）非扩增。因此，一个额外的寡核苷酸退火区域内的被删除的施加（VC0817回）连同VPI-CHK-。面板B：具有代表性的结果使用的各菌株的基因组DNA为模板和引物对上述每个图像。野生型菌株：V。霍乱菌株（泳道1），菌株的VPI :: FRT-Kan/Gm-FRT（泳道2），和ΔVPI-1 :: FRT收（泳道3）。一个右图所示的PCR片段预测的面板尺寸。 L，1KB阶梯（Invitrogen公司）。 点击此处查看大图 。
图6代表表型的人工启动子序列插入后。的依赖的T7 RNA聚合酶启动子序列上游的整合的能力的调节基因tfoX使用TransFLP methoD（草图上图）。父母V。霍乱弧菌菌株（ADVCH-T7POL）包含由lacUV5启动子驱动的T7 RNA聚合酶基因。格拉夫：父母的应变ADVCH T7POL（泳道1和2）和菌株所操纵TransFLP（ADVCH-T7POL-T7-tfoX :: FRT收;泳道3和4）进行了测试，在没有（泳道1和3的自然可变形为1mM的IPTG（泳道2和4））或存在。转化基因组DNA来源于株A1552-LacZ的菅直人8。转化频率给出在Y-轴。 <分升，低于检出限为〜5×10 -8。 * P <0.01（由学生的t检验数转换的数据）。黑箭文本“T7”：T7 RNA聚合酶依赖的启动子序列。 点击此处查看大图 。
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Discussion
的TransFLP上述方法和其他地方已被广泛使用在我们的实验室。种遗传操作是可行的，包括其中包括：删除单个基因和基因簇的基因岛（ 例如 ，VPI-1），缺失，插入感兴趣的基因的上游侧（ 例如 ，启动子序列）的序列，并插入序列结束时的一个特定的基因（ 例如 ，编码的亲和标签）。
一个导入的先决条件TransFLP是，各自的五霍乱菌株是自然变形。有时这是没有的情况下，特别是在来自霍乱病人的菌株。这类菌株的突变在群体感应电路，例如 ，在基因编码的主要监管机构的法定人数感应，HAPR 17。提供的副本HAPR恢复自然的这些菌株作为exempli的可变形田间为HAPR缺陷株N16961的18。
可以掺入可能的修改，如自然变换后8的情况下的频率太低的富集的细菌。请注意，转化频率一般较低的情况下，PBR-FLP质粒是存在的，而这样做的几丁质诱导的自然转化试验。这是最有可能造成部分泄漏对温度敏感的表达FLP基因PBR-FLP，这将导致过早切除的抗生素抗性基因，无法选择这些转化。因此，我们建议对重要的情况下，以插入PBR-FLP质粒后自然转换步骤。
另一个关键步骤是第二轮PCR，将三者有机结合， 第一轮PCR片段。它可以发生，部分片段后，PCR意图ction（ 例如 ，只有片段的局部组件的'上'和'FRT-阚-FRT'，根据图1）。这是可以忽略的，作为双重同源重组的与目标染色体区域可以在这种情况下，不会发生。作为选择只有窝藏抗生素抗性基因的转化，转化与所有其他非期望的DNA交换被排除在外。
还有一点要记住方面的重复几轮的程序。我们已经成功地结合起来的的ctxAB基因簇与毒力岛（VPI-1）和其他致病基因的集群（Blokesch，未发表）删除删除。此外，我们已经有效地集成了T7 RNA聚合酶依赖型启动子，在这些菌株（上游tfox和其他地方）。然而，设想的基因型应不断测试，所有应变中间体（ 例如 ，通过菌落PCR为demonstrated于图4）。这将有助于相互排除不想要的的FLP-介导的重组的汽车首次登记税的伤疤背后的左边（显示为红色的矩形中的所有数字），而PBR-FLP中的细菌质粒是仍然存在的。这也许可以被忽略为远亲位于基因，因为，在两者之间的区域的切除会是致命的，因为必需基因的删除的概率是非常高的。
最后，我们想讨论内的基因操纵子的删除。我们不能排除删除的上游基因，这让后面的汽车首次登记税的疤痕，可能会改变下游基因的表达（S）。为了确保这种效应是不造成可观察到的表型，但是，这的确是由删除引起的，互补法建议。另一种控制，我们已经成功地在实验室中使用的是集成的汽车首次登记税的疤痕下游基因的利息无需添加后者吨删去。在我们的实验室，我们没有观察到这样的问题，但也不能排除其存在。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我要感谢奥尔加·德索萨·席尔瓦的技术援助。这项工作是由瑞士国家科学基金会（SNSF）31003A_127029格兰特的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
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