Summary
En hurtig metode til at modificere genomet af
Abstract
Der findes flere metoder til at manipulere bakterielle kromosomer 1-3. De fleste af disse protokoller er afhængige af indsættelsen af konditionelt replikative plasmider (f.eks huser pir-afhængige eller temperatur-sensitive replicons 1,2). Disse plasmider integreret i bakterielle kromosomer på basis af homologi-medieret rekombination. Sådanne insertionelle mutanter ofte anvendes direkte i forsøgsopstillingen. Alternativt kan selektion for plasmidet excision efterfulgt af tabet udføres, som for gramnegative bakterier ofte afhængig af kontra-selekterbare levansucraseenzymet kodet af sacB-genet 4. The excision kan enten gendanne før insertion genotype eller medfører en udveksling mellem kromosomet og plasmidkodet kopi af det modificerede gen. En ulempe ved denne teknik er, at det er tidskrævende. Plasmidet, klones først, det kræver horisontal overførsel til V. cholerae (mest N otably ved parring med et E. coli donor stamme) eller kunstige omdannelse af dette produkt, og udskæring af plasmidet er tilfældig og kan enten genoprette den oprindelige genotype eller skabe den ønskede modifikation, hvis der ikke positiv selektion udøves. Her præsenteres en metode til hurtig manipulation af V. cholerae kromosom (er) 5 (fig. 1). Denne TransFLP metode er baseret på den nyligt opdaget chitin-medieret induktion af naturlig kompetence i denne organisme 6 og anden repræsentant af slægten Vibrio, såsom V. fischeri 7. Naturlig kompetence tillader optagelse af frit DNA, herunder PCR-dannede DNA-fragmenter. Når taget op, DNA rekombinerer med kromosomet følge af tilstedeværelsen af mindst 250-500 bp flankerende homologe region 8. Herunder en selektionsmarkør i-mellem disse flankerende regioner gør det nemt at detektion af hyppigt forekommende transformanter.
t "> Denne metode kan anvendes til forskellige genetiske manipulationer af V. cholerae og eventuelt også andre naturligt kompetente bakterier. Vi giver tre hidtil ukendte eksempler på hvad der kan opnås ved denne fremgangsmåde ud over vores tidligere offentliggjorte undersøgelse enkelt gen deletioner og tilsætning af affinitets-tag sekvenser 5. Adskillige optimering trin vedrørende indledende protokol af chitin-induceret naturlig transformation 6 er indarbejdet i denne TransFLP protokol. Disse omfatter blandt andet at erstatte krabbeskallen fragmenter ved kommercielt tilgængelig chitin flager 8 donation af PCR -afledt DNA som transformerende materiale 9, og tilsætningen af FLP-rekombinationssitene målsteder (FRT) 5. FRT sites tillader sted-rettet udskæring af selektionsmarkøren medieret af Flp-rekombinasen 10.Protocol
The TransFLP metoden (fig. 1) er eksemplificeret ved tre forskellige metoder: I), at to nabostillede gener, der koder virulensdeterminanter af V. cholerae (f.eks ΔctxAB), II) fjernelse af en patogenitetstest ø (f.eks ΔVPI-1), og III) integration af en T7 RNA-polymerase-afhængige promotorsekvensen opstrøms for et gen-of-interesse, som efterfølgende giver sit kunstige ekspression i den pågældende stamme baggrund (fx T7-tfoX) (figur 2).
1. Fremstilling af chitin Flakes
- Vægt 50-80 mg chitin flager i en standard 1,5 ml plastrør. Det kan fremstilles i bulk. Chitin flager er kommercielt tilgængelige fra Sigma (kat. nr. C9213).
- Autoklavere flager holder låget af rørene åbne.
- Umiddelbart lukke låget efter autoklaven er afkølet.
- Store autoklaveret chitin flagerved stuetemperatur.
2. Valgfrit: Kunstig Transformation af V. cholerae med Flp-rekombinase-kodende plasmid
- Forbered elektrokompetente V. cholerae-celler under anvendelse af standardfremgangsmåder 11. Opbevare portioner af kompetente celler ved -80 ° C.
- Tilsættes 1-2 pi af en regelmæssig mini-fremstilling af plasmid pBR-FLP 5 til elektrokompetente V. cholerae celler og overføre blandingen i en elektroporation cuvette (0,2 cm hul bredde).
- Påfør en puls på 1,6 kV.
- Tilsættes 0,9 ml SOC medium, forsigtigt overføre celle til en standard 14 ml rør. Inkuber stillestående i 2,5-3 timer ved 30 ° C.
- Pladen 100 pi og 300 gl på LB-plader indeholdende 100 ug / ml ampicillin og inkuberes ved 30 ° C natten over.
- Rens enkelt klon og gemmes som glycerol lager for fremtidige TransFLP eksperimenter.
3. Oligonukleotid Design og polymerasekædereaktion
- Mindst seks oligonucleotider er nødvendige for at amplificere den DNA-region (er) af interesse samt FRT-flankeret antibiotikum kassetten ved PCR (figur 3). Det anbefales også at inkludere en oligonukleotidpar priming uden det indsatte PCR-fragment. Dette tillader kontrol for integration og korrekt udskæring af FRT-flankeret antibiotikaresistens kassette (f.eks afbildet som "CHK-up" og "chk-down" primere i figur 3 til 5).
- Design oligonukleotiderne # 2, # 3, # 4 og # 5 med omhu. De skal være i stand til tilstrækkeligt anneale (f.eks ~ 28 bp) til template-DNA. The template-DNA er genomisk DNA (gDNA) for primerne # 2 og # 5 og FRT-Kan-FRT-indeholdende plasmid-DNA, såsom pROD17 12 og pBR-FRT-KAN-FRT (denne undersøgelse) for primerne # 3 og # 4 ( figur 3A).
- Designe primerne # 2 til # 5 tillader omfattende baseparring ved deres 5'-enden mellem # 2 / # 3 og # 4 / # 5, henholdsvis (figur 3A
- Udfør tre uafhængige PCR-reaktioner som 1. runde af PCR. Det første vil amplificere opstrømsregionen af genet / DNA-regionen af interesse ved hjælp af oligonukleotider # 1 og # 2. PCR bør resultere i et fragment på mindst 500 bp langt til at tillade homolog rekombination i cellerne. Kortere fragmenter (~ 250 bp), kan være tilstrækkelig 8, men anbefales ikke.
- Sideløbende udførelse af den anden PCR, der forstærker FRT-flankeret antibiotikum kassette. For eksemplerne forudsat her vi hovedsageligt bruges APH (can R). Anvendelse oligonukleotider # 3 og # 4 for denne reaktion (figur 3A).
- Samtidigt, amplificere den nedstrøms DNA-region ved hjælp af PCR (tredje prøve). PCR-fragmentet bør også være mindst 500 bp langt. Udføre PCR med gDNA som template og oligonukleotiderne # 5 og # 6 (figur 3A).
- Efter oprensning af alle tre PCRfragmenter, udføre 2. runde af PCR. Anvende en ligelig blanding af alle tre fragmenter opnået i den første runde som template. Amplifikationen katalyseres af oligonukleotider # 1 og # 6. Det resulterende PCR-fragment (figur 3B) tjener som transformerende DNA i naturlige transformationsforsøg (figur 1).
4. Chitin-induceret Natural Transformation
- Grow V. cholerae-celler aerobt i rigt medium ved 30 ° C indtil de når en optisk densitet ved 600 nm på cirka 0,5.
- Høste bakterierne ved centrifugering. Vask pellet én gang i definerede kunstige medium (DASW 6) inden resuspendering af cellerne i 2 volumener DASW. Tilsæt 1 ml kultur til 50-80 mg steril chitin flager (forklaret under punkt 1). Hvis bakterier harbour plasmid pBR-FLP (valgfrit punkt 2), add ampicillin (50 ug / ml) til kulturen. Inkuber ved 30 ° C i 16-24 timer uden bevægelse.
- Tilføj & ge, 200 ng af 2 nd-round PCR-afledt fragment (forklaret under punkt 3). Blandes omhyggeligt uden udstrakt frigørelse bakterierne fra chitin overflader. Inkuber ved 30 ° C i 24 timer uden bevægelse.
- Vortex kulturen omfang til ≥ 30 sek. Spred 100-300 pi på selektive LB-medium plader (f.eks kanamycin eller gentamicin-holdige LB-plader for eksempler forudsat her). Anvende dobbelt-selektive plader, hvis bakterierne huser plasmidet pBR-FLP ved tilsætning ampicillin samtidigt til de andre antibiotika. Pladerne inkuberes ved 30 ° C i 16-24 timer, eller indtil kolonier er synlige.
- Isolere enkelte transformanter fra selektive plader. Sådanne transformanter har erstattet det oprindelige kromosomale locus ved PCR-fragment på grund af en dobbelt crossoverhændelse. Disse stammer kan anvendes direkte til yderligere forsøg, hvis fjernelse af antibiotikummet kassetten er ikke nødvendig.
5. Fjernelse af Selective Cassette (s) ved Flp-Rekombination
- Kunstigt forvandle dine transformanter med plasmid pBR-FLP som beskrevet under punkt 2, hvis ikke gjort før den naturlige transformationsassay.
- Dyrke bakterierne på LB-agarplader indeholdende ampicillin ved 37 ° C i 16-24 timer. Valg: ændre temperaturen i mellem for 2-3 timer til 40 ° C som udtryk for FLP fra plasmid pBR-FLP er de-undertrykt ved højere temperaturer 5,10, overføre bakterier til friske plader efter ca. 8 timers inkubation.
- Test for antibiotika-følsomhed (vist her for kanamycin, figur 1) ved genudstrygning klonerne parallelt på antibiotika-holdige og antibiotika-fri agarplader. Isolere enkelte følsomme kolonier. Frys ampicillin-resistent klon som glycerol lager, hvis du har til hensigt yderligere at modificere stammen med andre deletion / insertion hjælp TransFLP.
6. Plasmid Hærdning
- Vokse kulturen natten over under aerobe betingelser ogved 30 ° C. Brug rigt medium uden tilsætning af antibiotika.
- Valgfrit: Grow frisk kultur i 3-6 timer ved fortynding af overnatskulturen 1:100 i frisk antibiotikum-frit medium.
- Plade eller streak (WD) af kulturen på almindeligt LB-agarplade (er) og inkuber ved 30 ° C i 8-16 timer (indtil kolonier er synlige).
- Test for ampicillin-følsomhed af klonerne ved genudstrygning klonerne parallelt på antibiotika-holdige og antibiotikum-frit agarplader (figur 1). Frys ampicillin-følsom stamme som glycerolstamopløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater af de tre eksempler er vist i figurerne 4-6. Den første strategi til at slette de tilstødende gener ctxA og ctxB. Sammen de koder for den store virulensfaktor V. cholerae, koleratoksin. Vi designede oligonucleotider til TransFLP metoden som beskrevet ovenfor og ifølge figur 3. Den parentale stamme, blev den mellemliggende stamme, der huser den FRT-flankeret antibiotikaresistens kassetten på den oprindelige DNA-locus af ctxAB og den endelige stamme deleteret for ctxAB og befriet for modstanden kassetten alle testet for deres genotype (figur 4). Den foretrukne metode blev helcelle-PCR. Vi anvendte primere, som ikke annealer til det transformerende PCR-fragment, men kun til kromosomalt DNA (figur 3). Dette tillod os at bekræfte den stedspecifikke udveksling af PCR-fragmentet med det homologe område af kromosomet (Figur 4A). PCR-fragmenterne blev separeret ved standard agarosegelelektroforese for at bestemme deres størrelse (fig. 4B). Denne strategi kan anvendes til at kontrollere stamme mellemprodukter og for at bekræfte den endelige stamme konstrukt (er).
For det andet eksempel, fjernelse af en hel genomisk ø vi valgte Vibrio patogenicitet island 1 (VPI-1) som target 13. Standarden TransFLP ovenfor beskrevne lykkedes i dette tilfælde. Det var kendt fra tidligere undersøgelser, at en så stor DNA-region kan udskiftes med en tilsvarende størrelse DNA-region ved hjælp af chitin-induceret naturlig transformation 9. Vi har derfor antaget, at den størrelse forskellen mellem region-til-være-slettet, og den temmelig korte transformerende PCR-fragment (<3,5 kb) kan være den begrænsende faktor. Vi besluttede derfor at benytte den TransFLP metode i to trin: vi først integreret APH genet (can R) indledes med en enkelt FRT-sted ved starten af VPI-1 (illustreret i figur 5A). Vi derefter udført en anden runde af naturlig transformation, hvilket tillod os at indsætte yderligere antibiotisk resistens-kassette (g R, giver gentamicin-resistens) efterfulgt af en anden FRT site ved enden af patogenicitet island (figur 5A). De respektive dobbelt-resistente stamme blev elektroporeret at indsætte plasmid pBR-FLP og TransFLP metoden blev fortsat som beskrevet ovenfor. Den resulterende stamme manglede hele VPI-1 som verificeret ved PCR af oprenset genomisk DNA (figur 5B).
For det tredje eksempel vi integreret en T7 RNA-polymerase-afhængige promotorsekvens opstrøms for et gen af interesse, i vores tilfælde genet, der koder den største regulator af naturlig transformation tfoX 6. Dette blev gjort ved hjælp af TransFLP metode med en mindre ændring fra den standard protokol: vi medtaget T7 RNA afhængig promoter konsensussekvens ifølge ref. 14 som udhæng i oligonukleotiderne # 4 og # 5. Med denne strategi for T7 RNA-polymerase-afhængige promotorsekvens blev holdt på kromosomet, selv efter den antibiotiske resistens-kassetten blev udskåret (figur 6). Vi integreret konstruktionen i V. cholerae-stamme ADVCH-T7pol, som huser T7-RNA-polymerasegenet drevet af lacUV5 promotoren (Blokesch, ikke publiceret). For at teste for funktionaliteten af konstruktionen, nemlig T7 RNA-polymerase-afhængige ekspression af tfoX, udførte vi naturlige transformation assays i LB-medium. Den parentale stamme er ikke naturligt transformerbare under disse betingelser på grund af den manglende tfoX transkription i rigt medium og i fravær af dets naturlige inducer chitin (figur 6). Denne fænotype var uafhængig af, om T7 RNA polymerase kunstigt blev induceret ved IPTG eller ikke (figur 6, bane 1 og 2, respektivctively). Imidlertid TransFLP-genererede stamme ADVCH-T7pol-T7-tfoX :: FRT, der indeholder T7 RNA-polymerase-afhængig promotor opstrøms for kompetencen genet tfoX, faktisk var naturligt transformerbare i rigt medium (figur 6, bane 3 og 4) . På grund af lækage af lacUV5-promotoren i LB medium 15 den producerede T7 RNA-polymerase allerede er transkriberet tfoX fra T7 RNA-polymerase-afhængig promotor uden induktion. Dette indledte naturlig kompetence og transformation bekræfter funktionaliteten af den integrerede T7 RNA-polymerase-afhængige promotorsekvens (fig. 6, bane 3). Denne fænotype blev signifikant forbedret ved fuld induktion af T7-RNA-polymerase på grund af tilsætning af induceren af lacUV5-promotoren, IPTG (figur 6, bane 4).
Figur 1.Rutediagram over TransFLP metoden. De seks punkter i denne protokol beskrevne er udarbejdet:.. 1) Fremstilling af chitin flager, 2) Valgfrit: Kunstig transformation af V. cholerae med Flp-rekombinase-kodende plasmid. 3) Oligonukleotid design og polymerasekædereaktion. 4) Chitin-induceret naturlig transformation, 5) Fjernelse af selektiv kassette (r) ved FLP-rekombination... 6) Plasmid hærdning Klik her for at se større figur .
Figur 2. Skematisk repræsentation af tre anvendelsesmuligheder for TransFLP metoden. I) A 1458 bp DNA-fragment, der indeholder choleratoksin som koder generne ctxA og ctxB, blev slettet som angivet med Δ. II) ~ 40 kb Vibrio patogenicitet island 1 (VPI-1 13)blev slettet fra vildtypestammen. III) en T7 RNA-polymerase-afhængige promotorsekvens (28 bp) blev integreret opstrøms for tfoX genet. Den røde rektangel angiver venstre bag korte nukleotidsekvens af et enkelt FRT sted 10. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Forklaring til primer design og udførelse af PCR baseret på sletning af ctxAB. Panel A: For 1 st runde af PCR genomisk DNA (gDNA) og plasmiderne pROD17 12 og pBR-FRT-Kan-FRT henholdsvis tjente som skabeloner. De nødvendige oligonukleotider er # 1 til # 6. Primeren # 2 / # 3 og # 4 / # 5 (f.eks indsat) bør også have væsentlig overlapning til hinanden ved deres 5'ends. Panel B: Efter den 2. runde afPCR, som er baseret på de 1 m runde PCR-fragmenter som skabeloner, bør en lang fragment opnås ved anvendelse af primerpar # 1 + # 6. Klik her for at se større figur .
Figur 4. Forventet resultat eksemplificeret for ctxAB deletion strategi. Den oprindelige stamme (vildtype), indførelsesmutationen mutant Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT, og den endelige stamme Δ ctxAB :: FRT blev testet for deres genotyper. Panel A: Skematisk fremstilling af differentieringen effekt af primerparret ctx-CHK-og ctx-CHK-down, især med hensyn til udskæring af antibiotikummet kassetten. Panel B: hele bakterieceller blev anvendt som template i PCR-reaktioner. At kontrollere for den ændrede DNA locus primere chk-up og chk-down blev udnyttet. De amplificerede PCR-fragmenter blev separeret ved agarosegelelektroforese og visualiseret under anvendelse af SYBR sikker DNA-farve. Bane 1: Vildtype V. cholerae-stamme, bane 2: stamme Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT, bane 3: Δ ctxAB :: FRT. Forventede PCR fragmentstørrelser ifølge panel A er vist til højre. L, 1 kb stige (Invitrogen). Klik her for at se større figur .
Figur 5. Strategi om at bekræfte sletningen af den genomiske øen. Panel A: Ordning af Vibrio patogenicitet island 1 (VPI-1) (fri tilpasset fra Ref. 16; ikke i målestoksforhold.). For vildtypestammen området af interesse er ikke-amplificerbar ved hjælp af standard PCR og VPI-1-specifikke primere chk-up og CHK-down (~ 40 kb). Derfor en yderligereoligonukleotid udglødning i regionen til-være-slettet blev anvendt (VC0817-back) sammen med VPI-chk-up. Panel B: Repræsentativ resultat med genomisk DNA fra de respektive stammer som skabelon og primerparrene ovennævnte hvert billede. Stammer testet: Vildtype V. cholerae-stamme (bane 1), stamme VPI :: FRT-Kan/Gm-FRT (bane 2), og ΔVPI-1 :: FRT (bane 3). Størrelser af de PCR-fragmenter som forudsagt i panel A, er angivet til højre. L, 1 kb stige (Invitrogen). Klik her for at se større figur .
Fig. 6. repræsentant fænotype efter indsættelse af en kunstig promotorsekvens. T7-RNA-polymerase-afhængige promotorsekvensen blev integreret opstrøms for kompetencen regulerende gen tfoX hjælp af TransFLP method (skitse ovenstående graf). Den parentale V. cholerae-stamme (ADVCH-T7pol) indeholder en T7-RNA-polymerasegenet drevet af lacUV5-promotoren. Graf: Den parentale stamme ADVCH-T7pol (bane 1 og 2) og stammen manipuleret af TransFLP (ADVCH-T7pol-T7-tfoX :: FRT, bane 3 og 4) blev testet for fysisk transformability i fravær (bane 1 og 3 ) eller nærvær af 1 mM IPTG (bane 2 og 4). Transformerende genomisk DNA blev afledt fra stamme A1552-LacZ-Kan 8. Transformationsfrekvenser er angivet på Y-aksen. <Dl, under detektionsgrænsen på ~ 5 x 10 -8. ** P <0,01 (som bestemt ved Students t-test af log-transformerede data). Sort pil med teksten 'T7':. T7 RNA-polymerase-afhængige promotorsekvens Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
The TransFLP fremgangsmåden beskrevet ovenfor og andre steder 5, er blevet ekstensivt anvendt i vores laboratorium. Den form for genetisk manipulation, der er mulig omfatter bl.a.: deletion af enkelte gener og gen-clustere, deletion af genomiske øer (fx VPI-1), insertion af sekvenser opstrøms for et gen af interesse (fx promotorsekvenser), og indsættelse af sekvenser ved slutningen af et specifikt gen (f.eks kodende for affinitetsmærker).
En import forudsætning for TransFLP er, at de respektive V. cholerae-stamme er naturligt transformerbare. Dette er undertiden ikke tilfældet, især i isolater afledt af kolera patienter. Sådanne stammer er hyppigt muteret i quorum sensing kredsløbet fx inden for genet, der koder den største regulator af quorum sensing, HapR 17. Forudsat tilbage en kopi af hapR genskaber naturlig transformability i disse stammer 6 som exempliceret til HapR-defekt stamme N16961 18.
Mulige modifikationer kan inkorporeres, såsom tilsætning af bakterierne efter naturlig transformation 8, hvis frekvensen er for lav. Bemærk venligst, at transformationen frekvens er generelt lavere i tilfælde af pBR-FLP plasmid er allerede til stede, mens du gør det chitin-induceret naturlig transformationsassay. Dette er mest sandsynligt forårsaget af en delvis lækage af det temperaturfølsomme ekspression af FLP-genet fra pBR-FLP, hvilket ville resultere i for tidlig excision af det antibiotikaresistente kassetten og den manglende evne til at selektere for disse transformanter. Vi anbefaler derfor for kritiske tilfælde at indsætte pBR-FLP plasmid efter den naturlige transformation skridt.
Et andet kritisk trin er 2 nd runde af PCR, som vil kombinere de tre 1 st-runde PCR-fragmenter. Det kan forekomme, at delvise fragmenter er til stede efter PCR-reaktion (fx en delvis samling af kun fragmenter "op" og "FRT-Kan-FRT 'ifølge figur 1). Dette er forsvindende lille, kan som dobbelt homolog rekombination med det målrettede kromosomale område ikke forekomme i denne situation. Da kun Transformanter indeholdende den antibiotiske resistens kassetten udvælges til, er alle andre transformanter med ikke-ønskede DNA udvekslinger udelukket.
Et andet punkt at huske på er med hensyn til gentagelse af proceduren for flere runder. Vi har allerede med succes kombineret udeladelsen af ctxAB genklyngen med udeladelse af patogenicitet øen (VPI-1) og en anden virulensgen klynge (Blokesch, ikke publiceret). Vi har endvidere integreres effektivt T7-RNA-polymerase-afhængig promotor i disse stammer (opstrøms tfoX og andre steder). Imidlertid bør forudses genotype konstant testes for alle strain mellemprodukter (fx ved koloni-PCR som demonstrated i figur 4). Dette vil bidrage til at udelukke den uønskede Flp-medieret rekombination af venstre bag FRT ar (vist som rødt rektangulær i alle figurer) med hinanden, mens den pBR-FLP plasmid er stadig til stede i bakterierne. Dette kan sandsynligvis blive taget hensyn til fjernt beliggende gener, som sandsynligheden for, at udtagelse af i-mellem region ville være dødbringende skyldes deletion af essentielle gener er meget høj.
Endelig vil vi gerne diskutere deletion af gener inden operoner. Vi kan ikke udelukke, at sletning af en opstrøms gen, som efterlader en FRT ar bag, kan ændre ekspressionen af nedstrøms gen (er). For at sikre, at denne effekt ikke er årsag til observerbare fænotype, men at dette faktisk er forårsaget af deletion, er en komplementerende analyse anbefales. En anden kontrol, som vi allerede har med succes brugt i laboratoriet, er integrationen af de FRT ar nedstrøms for genet af interesse without slette sidstnævnte. Vi har ikke observere sådanne problemer i vores laboratorium endnu, men kan ikke udelukke deres eksistens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Jeg vil gerne anerkende Olga de Souza Silva til teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af den schweiziske National Science Foundation (SNSF) Grant 31003A_127029.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
References
- Miller, V. L., Mekalanos, J. J. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).
- Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).
- Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).
- De Souza Silva, O., Blokesch, M. Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination. Plasmid. 64, 186-195 (2010).
- Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310, 1824-1827 (2005).
- Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).
- Marvig, R. L., Blokesch, M. Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure. BMC Microbiol. 10, 155 (2010).
- Blokesch, M., Schoolnik, G. K. Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs. PLoS Pathog. 3, e81 (2007).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, 9-14 (1995).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A laboratory manual. Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. 1, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells. Cell. 133, 90-102 (2008).
- Karaolis, D. K. R. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).
- Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo. Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).
- Pan, S. H., Malcolm, B. A. Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3). Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).
- Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani,, Kamruzzaman, M., Mekalanos, J. J. Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage. Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).
- Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae. Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).
- Heidelberg, J. F. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 406, 477-483 (2000).
