Summary
के जीनोम को संशोधित करने के लिए एक त्वरित विधि
Protocol
: TransFLP विधि (1 चित्रा) तीन अलग अलग दृष्टिकोण द्वारा उदाहरण है) दो आसन्न वी. के निर्धारकों डाह जीन एन्कोडिंग का विलोपन मैं कोलरा (जैसे, ΔctxAB), द्वितीय) एक pathogenicity द्वीप (जैसे, ΔVPI-1) हटाने, और III) T7 आरएनए पोलीमरेज़ निर्भर प्रमोटर अनुक्रम के एकीकरण नदी के ऊपर एक जीन के ब्याज की, जो बाद में की अनुमति देता है संबंधित तनाव की पृष्ठभूमि में कृत्रिम अभिव्यक्ति (उदाहरण के लिए, T7 - tfoX) (चित्रा 2).
1. काइटिन गुच्छे की तैयारी
- वजन एक मानक 1.5 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में 50-80 मिलीग्राम chitin के गुच्छे. यह थोक में तैयार किया जा सकता है. काइटिन गुच्छे सिग्मा (cat. संख्या C9213) से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं.
- ट्यूबों के lids खुला रखने गुच्छे आटोक्लेव.
- तुरंत lids को बंद करने के बाद आटोक्लेव ठंडा हो गया.
- स्टोर autoclaved chitin गुच्छेकमरे के तापमान पर.
2. वैकल्पिक: वी. के कृत्रिम परिवर्तन recombinase एन्कोडिंग FLP प्लास्मिड के साथ कोलरा
- Electrocompetent तैयार करें वी. कोलरा 11 मानक तरीकों कोशिकाओं का उपयोग कर. -80 में सक्षम कोशिकाओं की aliquots संग्रहीत डिग्री सेल्सियस
- Electrocompetent प्लाज्मिड 5 PBR FLP के एक नियमित रूप से मिनी तैयारी के 1-2 μl जोड़ें वी. कोलरा कोशिकाओं और एक electroporation क्युवेट (0.2 सेमी अंतराल चौड़ाई) में मिश्रण हस्तांतरण.
- 1.6 केवी पर एक पल्स लागू.
- 0.9 मिलीलीटर समाज मध्यम जोड़ें, धीरे से एक मानक 14 मिलीलीटर ट्यूब सेल हस्तांतरण. 30 में 2.5 से 3 घंटे के लिए गैर चलती सेते डिग्री सेल्सियस
- प्लेट 100 μl और पौंड 30 ° रातोंरात सी 100 छ / मिलीलीटर एम्पीसिलीन और सेते युक्त प्लेटों पर 300 μl.
- एकल क्लोन और भविष्य TransFLP प्रयोगों के लिए दुकान ग्लिसरॉल स्टॉक के रूप में शुद्ध.
3. Oligonucleotide डिजाइन और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन
- कम से कम छह oligonucleotides के लिए ब्याज की डीएनए क्षेत्र (ओं) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से FRT flanked पीसीआर (3 चित्रा) द्वारा एंटीबायोटिक कैसेट बढ़ाना आवश्यक हैं. यह भी डाला पीसीआर टुकड़ा बाहर oligonucleotides भड़काना की एक जोड़ी को शामिल करने के लिए सिफारिश की है. यह एकीकरण और FRT flanked एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट (जैसे chk - अप 'और 3 से 5 आंकड़े में' chk नीचे प्राइमरों के रूप में दर्शाया गया है) की सही छांटना के लिए जाँच की अनुमति देता है.
- # 2, # 3, # 4, और देखभाल के साथ # 5 oligonucleotides डिजाइन. वे टेम्पलेट डीएनए के लिए पर्याप्त पानी रखना (उदाहरण के ~ 28 बीपी) करने में सक्षम होना चाहिए. टेम्पलेट डीएनए प्राइमरों के लिए जीनोमिक डीएनए (gDNA) # # 2 और 5 और इस तरह के रूप में 12 pROD17 PBR FRT - कान - FRT (इस अध्ययन) प्राइमरों के लिए # 3 और # (4 FRT - कान - FRT युक्त प्लास्मिड डीएनए 3A चित्रा).
- प्राइमरों 2 # # 5 करने के लिए अनुमति देता है डिजाइन # 2 / # 3 और # 4/5 के बीच अपने 5'-अंत में व्यापक आधार बाँधना, क्रमशः (चित्रा 3A
- तीन पीसीआर के 1 सेंट दौर के रूप में स्वतंत्र पीसीआर प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन. 1 एक जीन / # # 1 और 2 oligonucleotides की सहायता के साथ क्षेत्र के ब्याज डीएनए की अपस्ट्रीम क्षेत्र बढ़ाना होगा. पीसीआर लंबाई में कम से कम 500 बीपी मुताबिक़ पुनर्संयोजन कोशिकाओं के भीतर की अनुमति का एक टुकड़ा में परिणाम चाहिए. छोटे टुकड़े (~ 250 बीपी) 8 पर्याप्त हो सकता है, लेकिन सिफारिश नहीं कर रहे.
- समानांतर में 2 पीसीआर, है जो FRT flanked एंटीबायोटिक कैसेट amplifies प्रदर्शन. उदाहरण यहाँ बशर्ते कि हम मुख्य रूप से APH (कण आर) का इस्तेमाल किया. का प्रयोग करें 3 और # 4 oligonucleotides इस प्रतिक्रिया (चित्रा 3A) के लिए.
- Concomitantly, पीसीआर (3 नमूना) द्वारा बहाव के डीएनए क्षेत्र बढ़ाना. पीसीआर टुकड़ा भी लंबाई में कम से कम 500 बीपी होना चाहिए. प्रदर्शन पीसीआर रूप में gDNA साथ टेम्पलेट और 5 और # 6 (चित्रा 3A) oligonucleotides.
- सभी तीन पीसीआर की शुद्धि के बादटुकड़े, पीसीआर के 2 एन डी दौर प्रदर्शन. टेम्पलेट के रूप में पहले दौर में प्राप्त सभी तीन टुकड़े के एक समान मिश्रण का प्रयोग करें. प्रवर्धन # # 1 और 6 oligonucleotides द्वारा उत्प्रेरित है. परिणामस्वरूप पीसीआर टुकड़ा (3B चित्रा) प्राकृतिक परिवर्तन प्रयोग (1 चित्रा) में डीएनए को बदलने के रूप में कार्य करता है.
4. काइटिन प्रेरित प्राकृतिक परिवर्तन
- आगे बढ़ें वी. अमीर मध्यम में कोलरा aerobically 30 में कोशिकाओं ° C जब तक वे लगभग 0.5 600 एनएम पर एक ऑप्टिकल घनत्व तक पहुँचने.
- Centrifugation द्वारा बैक्टीरिया फसल. गोली एक बार 2 DASW के संस्करणों में कोशिकाओं resuspending के पहले परिभाषित कृत्रिम मध्यम (6 DASW) में धो लें. बाँझ chitin गुच्छे (1 बिंदु तहत समझाया) की 50-80 मिलीग्राम संस्कृति के 1 मिलीलीटर जोड़ें. यदि बैक्टीरिया बंदरगाह प्लाज्मिड PBR (वैकल्पिक बिंदु 2) flp, जोड़ संस्कृति को एम्पीसिलीन (50 / ग्राम मिलीलीटर). आंदोलन के बिना 16-24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- जोड़ें छई, 2 एन डी दौर टुकड़ा पीसीआर व्युत्पन्न (3 बिंदु तहत समझाया) की 200 एनजी. बड़े पैमाने पर chitin सतहों से बैक्टीरिया detaching के बिना ध्यान से मिलाएं. आंदोलन के बिना 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- संस्कृति ≥ 30 सेकंड के लिए बड़े पैमाने पर भंवर. चयनात्मक लेग मध्यम प्लेट (जैसे केनामाइसिन या यहाँ प्रदान की है उदाहरण के लिए gentamicin युक्त लेग प्लेटें) पर 100-300 μl बिखरा हुआ है. डबल चयनात्मक प्लेट का उपयोग अगर जीवाणु प्लाज्मिड एम्पीसिलीन अन्य एंटीबायोटिक दवाओं से जोड़ने concomitantly द्वारा PBR flp बंदरगाह. 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों या 16-24 घंटे के लिए सेते हैं जब तक कालोनियों दिखाई दे रहे हैं.
- चयनात्मक प्लेटों से एक transformants अलग. इस तरह के transformants पीसीआर टुकड़ा एक डबल विदेशी घटना की वजह से मूल गुणसूत्र बिन्दुपथ जगह ले ली है. इन उपभेदों सीधे आगे के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एंटीबायोटिक कैसेट के मामले में हटाने के लिए आवश्यक नहीं है.
5. चयनात्मक कैसेट FLP द्वारा हटाना (ओं)- पुनर्संयोजन
- कृत्रिम PBR flp प्लाज्मिड के साथ अपने transformants को बदलने के रूप में 2 अंक के तहत वर्णित प्राकृतिक परिवर्तन परख से पहले अगर नहीं किया.
- लेग अगर 37 डिग्री सेल्सियस पर 16-24 घंटे के लिए एम्पीसिलीन युक्त प्लेटों पर बैक्टीरिया बढ़ने. विकल्प: 40 2-3 घंटा के लिए बीच में तापमान परिवर्तन ° सी प्लाज्मिड PBR flp से flp की अभिव्यक्ति के रूप में उच्च तापमान 5,10 de-दमित, लगभग के बाद हस्तांतरण बैक्टीरिया ताजा प्लेटों के लिए. ऊष्मायन 8 घंटा.
- समानांतर में एंटीबायोटिक युक्त और एंटीबायोटिक मुक्त अगर प्लेटों पर क्लोनों restreaking, एंटीबायोटिक संवेदनशीलता (1 चित्रा केनामाइसिन के लिए यहाँ का प्रदर्शन) के लिए टेस्ट. एकल संवेदनशील कालोनियों को अलग. रुक एम्पीसिलीन प्रतिरोधी ग्लिसरॉल स्टॉक के रूप में क्लोन अगर आप आगे की अन्य विलोपन / TransFLP का उपयोग कर प्रविष्टि के साथ तनाव को संशोधित करने का इरादा है.
6. प्लास्मिड इलाज
- संस्कृति रातोंरात एरोबिक शर्त के तहत और आगे बढ़ें30 डिग्री सेल्सियस किसी भी एंटीबायोटिक के अलावा बिना समृद्ध मध्यम का प्रयोग करें.
- वैकल्पिक: 3-6 घंटे के लिए ताजा मध्यम एंटीबायोटिक मुक्त में रातोंरात संस्कृति 1:100 कमजोर द्वारा ताजा संस्कृति के लिए आगे बढ़ें.
- सादे लेग अगर प्लेट (ओं) पर संस्कृति (ओं) प्लेट या लकीर कमजोर पड़ने और 30 पर सेते हैं ° सी 8-16 घंटे के लिए (जब तक कालोनियों दिखाई दे रहे हैं).
- समानांतर में एंटीबायोटिक युक्त और एंटीबायोटिक मुक्त अगर प्लेट (1 चित्रा) पर क्लोनों restreaking क्लोनों की एम्पीसिलीन संवेदनशीलता के लिए टेस्ट. ग्लिसरॉल स्टॉक के रूप में तनाव एम्पीसिलीन के प्रति संवेदनशील रुक.
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Representative Results
तीन उदाहरण के प्रतिनिधि परिणाम 6 4 आंकड़े में दिखाया जाता है. पहले दृष्टिकोण पड़ोसी जीन ctxA और ctxB को हटाने के उद्देश्य से. साथ में वे वी. के प्रमुख विषैलापन कारक सांकेतिक शब्दों में बदलना कोलरा, हैजा विष. हम TransFLP विधि के लिए oligonucleotides डिजाइन के रूप में ऊपर वर्णित है और 3 चित्रा अनुसार. माता पिता का तनाव, मध्यवर्ती तनाव के मूल डीएनए बिन्दुपथ ctxAB और अंतिम ctxAB के लिए नष्ट कर दिया और प्रतिरोध कैसेट से मुक्त तनाव FRT flanked एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट शरण सब उनके जीनोटाइप के लिए परीक्षण किया गया (चित्रा 4). पसंद की विधि पूरे सेल पीसीआर था. हम प्राइमरों है कि बदलने पीसीआर लेकिन केवल गुणसूत्र डीएनए टुकड़ा (3 चित्रा) नहीं पानी रखना इस्तेमाल किया. यह हमें गुणसूत्र के मुताबिक़ क्षेत्र (एफ के साथ पीसीआर टुकड़ा साइट विशिष्ट विनिमय सत्यापित करने की अनुमति दीigure 4A). पीसीआर टुकड़े मानक agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा उनके आकार का निर्धारण करने के लिए अलग हो गए थे (4B चित्रा). इस रणनीति तनाव मध्यवर्ती की जाँच करने के लिए अंतिम तनाव का निर्माण (ओं) की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
दूसरे उदाहरण के लिए, एक पूरी जीनोमिक द्वीप के हटाने, हम विब्रियो pathogenicity 13 लक्ष्य के रूप में चुना द्वीप 1 (VPI-1). मानक TransFLP ऊपर वर्णित प्रक्रिया इस मामले में असफल रहा था. पिछले अध्ययनों से यह जाना जाता था कि इतनी बड़ी डीएनए क्षेत्र एक समान आकार की डीएनए chitin प्रेरित प्राकृतिक परिवर्तन 9 का उपयोग क्षेत्र से विमर्श किया जा सकता है. इसलिए हम धारणा है कि क्षेत्र को नष्ट कर दिया हो सकता है और नहीं बल्कि कम बदलने पीसीआर टुकड़ा (<3.5 केबी) सीमित कारक हो सकता है के बीच आकार में अंतर. इसलिए हम दो चरणों में TransFLP विधि का उपयोग करने का फैसला किया है: हम पहली बार एक एकल FR द्वारा APH (कण आर) जीन पहले एकीकृतVPI-1 के शुरू (चित्रा 5A में सचित्र) टी साइट. हम तो प्राकृतिक परिवर्तन के एक दूसरे दौर है, जो हमें एक अतिरिक्त एंटीबायोटिक प्रतिरोध (जीएम, अनुसंधान gentamicin प्रतिरोध प्रदान) कैसेट pathogenicity द्वीप (चित्रा 5A) के अंत में एक दूसरे FRT साइट द्वारा पीछा सम्मिलित करने के लिए अनुमति दी प्रदर्शन किया. संबंधित डबल प्रतिरोधी तनाव प्लाज्मिड PBR flp और TransFLP विधि ऊपर वर्णित के रूप में जारी किया गया था डालने electroporated किया गया था. परिणामस्वरूप तनाव पूरे VPI-1 के रूप में शुद्ध जीनोमिक डीएनए (चित्रा 5 ब) के पीसीआर द्वारा सत्यापित का अभाव है.
तीसरा उदाहरण के लिए हम एक T7 आरएनए पोलीमरेज़ निर्भर प्रमोटर अनुक्रम एकीकृत नदी के ऊपर एक जीन के ब्याज की, हमारे मामले में प्राकृतिक परिवर्तन tfoX 6 के प्रमुख नियामक जीन एन्कोडिंग. यह मानक प्रोटोकॉल से एक मामूली संशोधन साथ TransFLP विधि का उपयोग किया गया था: हम T7 आरएनए निर्भर पी शामिलromoter आम सहमति रेफरी के अनुसार 4 # # 5 oligonucleotides में overhangs के रूप में 14 अनुक्रम. इस रणनीति के साथ T7 आरएनए पोलीमरेज़ निर्भर प्रमोटर अनुक्रम गुणसूत्र के बाद भी एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट (6 चित्रा) excised था पर रखा गया था. हम वी. में एकीकृत का निर्माण कोलरा ADVCH T7POL तनाव, जो T7 आरएनए पोलीमरेज़ जीन प्रमोटर lacUV5 (Blokesch, अप्रकाशित) द्वारा संचालित harbors. के निर्माण के कार्यक्षमता के लिए परीक्षण, अर्थात् tfoX के T7 आरएनए पोलीमरेज़ निर्भर अभिव्यक्ति, हम लेग मध्यम में प्राकृतिक परिवर्तन assays प्रदर्शन किया. माता पिता का तनाव स्वाभाविक रूप से transformable अमीर मध्यम में और अपने प्राकृतिक inducer काइटिन (6 चित्रा) के अभाव में tfoX प्रतिलेखन की कमी की वजह से इन शर्तों के तहत नहीं है. इस phenotype कि T7 आरएनए पोलीमरेज़ कृत्रिम IPTG द्वारा प्रेरित किया गया था या नहीं (6 चित्रा, गलियों 1 और 2, respe स्वतंत्र थाctively). हालांकि, TransFLP जनित तनाव ADVCH T7POL-T7 tfoX :: FRT, जो T7 आरएनए पोलीमरेज़ निर्भर प्रमोटर क्षमता जीन tfoX के अपस्ट्रीम में शामिल हैं, वास्तव में अमीर मध्यम (6 चित्रा, गलियों 3 और 4) में स्वाभाविक रूप से बदला जाने वाला था . लेग 15 मध्यम प्रेरण बिना T7 पोलीमरेज़ निर्भर प्रमोटर आरएनए से उत्पादित T7 आरएनए पोलीमरेज़ पहले से ही लिखित tfoX में lacUV5 प्रमोटर के रिसाव के कारण. यह शुरू प्राकृतिक क्षमता और परिवर्तन एकीकृत T7 आरएनए पोलीमरेज़ निर्भर प्रमोटर अनुक्रम (6 चित्रा, 3 लेन) की कार्यक्षमता की पुष्टि. यह phenotype काफी प्रमोटर lacUV5, IPTG (6 चित्रा, 4 लेन) के inducer के अलावा के कारण T7 आरएनए पोलीमरेज़ का पूरा प्रेरण द्वारा बढ़ाया गया था.
चित्रा 1.का प्रवाह चार्ट TransFLP विधि. इस प्रोटोकॉल में वर्णित छह अंक का मसौदा तैयार कर रहे हैं:. 1) chitin गुच्छे की तैयारी, 2) वैकल्पिक: वी. के कृत्रिम परिवर्तन recombinase एन्कोडिंग FLP प्लाज्मिड साथ कोलरा, 3) Oligonucleotide डिजाइन और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन, 4) काइटिन प्रेरित प्राकृतिक परिवर्तन; 5) चयनात्मक कैसेट (ओं) के flp पुनर्संयोजन द्वारा हटाने,. 6) प्लास्मिड क्यूरिंग यहाँ क्लिक करें बड़ा आंकड़ा देखने .
चित्रा 2 TransFLP विधि के लिए तीन आवेदन संभावनाओं के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. ) एक 1458 बीपी डीएनए टुकड़ा, हैजा विष एन्कोडिंग जीन ctxA और ctxB युक्त, मैं Δ द्वारा संकेत के रूप में हटा दिया गया था. II) ~ 40 - केबी विब्रियो pathogenicity द्वीप एक (13 VPI 1)जंगली प्रकार के तनाव से हटा दिया गया था. III) एक T7 आरएनए पोलीमरेज़ निर्भर प्रमोटर अनुक्रम (28 बीपी) नदी के ऊपर tfoX जीन की एकीकृत किया गया. लाल आयत एक एकल FRT 10 साइट की कमी nucleotide अनुक्रम के पीछे छोड़ दिया है इंगित करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3 ctxAB का विलोपन पर आधारित प्रथम डिजाइन और पीसीआर के प्रदर्शन के लिए स्पष्टीकरण. पैनल: 1 सेंट दौर के लिए पीसीआर जीनोमिक डीएनए (gDNA) और pROD17 12 plasmids और PBR FRT - कान - FRT, क्रमशः, टेम्पलेट के रूप में सेवा की. आवश्यक oligonucleotides # 1 # 6. प्राइमर # 2 / # 3 और # 4 / # 5 (इनसेट में उदाहरण) भी उनके 5'ends पर एक दूसरे को ओवरलैप अधिकारी चाहिए. पैनल बी: 2 एन डी के दौर के बादपीसीआर, जो 1 सेंट दौर पीसीआर टुकड़े टेम्पलेट के रूप में, एक लंबा टुकड़ा प्राइमर जोड़ी 1 # + # 6 का उपयोग कर प्राप्त किया जाना चाहिए पर आधारित है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 4 अपेक्षित परिणाम ctxAB विलोपन रणनीति के लिए उदाहरण है. मूल (जंगली प्रकार) तनाव, insertional उत्परिवर्ती Δ :: ctxAB FRT - कान - FRT, और अंतिम तनाव Δ ctxAB :: FRT उनके जीनोटाइप के लिए परीक्षण किया गया. पैनल: प्राइमर जोड़ी ctx chk - अप और ctx chk नीचे, सबसे एंटीबायोटिक कैसेट की छांटना के संबंध के साथ विशेष रूप से भेदभाव की शक्ति के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. पैनल बी: पूरे बैक्टीरियल कोशिकाओं पीसीआर प्रतिक्रियाओं में टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया. बदल डीएनए की जांच करने के लिए उपयोग किया गया बिन्दुपथ chk अप प्राइमरों और chk नीचे. agarose जेल वैद्युतकणसंचलन प्रवर्धित पीसीआर टुकड़े अलग हो गए थे और SYBR सुरक्षित डीएनए का उपयोग कर दाग visualized. लेन 1: जंगली प्रकार वी. कोलरा तनाव, 2 लेन: तनाव Δ :: ctxAB FRT - कान - FRT, 3 लेन: Δ ctxAB :: FRT. उम्मीद पीसीआर टुकड़ा आकार पैनल के अनुसार सही पर एक संकेत कर रहे हैं. एल, 1kb (Invitrogen) सीढ़ी. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 5 जीनोमिक द्वीप के विलोपन की पुष्टि करने के लिए रणनीति. पैनल: विब्रियो pathogenicity 1 द्वीप (VPI 1) (स्वतंत्र रूप से रेफरी से अनुकूलित 16; पैमाने पर करने के लिए नहीं.) की योजना. जंगली प्रकार के तनाव के लिए ब्याज के क्षेत्र मानक पीसीआर और VPI-1-विशिष्ट chk अप प्राइमरों और chk नीचे (~ 40 केबी) के माध्यम के के द्वारा गैर amplifiable है. इसलिए एक अतिरिक्तoligonucleotide क्षेत्र के भीतर annealing हो हटा दिया गया था (VC0817 वापस) VPI chk - अप के साथ साथ लागू किया है. पैनल बी: प्रतिनिधि परिणाम टेम्पलेट और प्राइमर जोड़े के रूप में संबंधित उपभेदों के जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर प्रत्येक छवि के ऊपर संकेत. खींच परीक्षण: जंगली प्रकार वी. कोलरा तनाव (1 लेन), तनाव VPI :: FRT-Kan/Gm-FRT (2 लेन), और ΔVPI-1 :: FRT (3 लेन). पीसीआर के रूप में पैनल में भविष्यवाणी टुकड़े का आकार सही पर एक संकेत कर रहे हैं. एल, 1kb (Invitrogen) सीढ़ी. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
एक कृत्रिम प्रमोटर अनुक्रम की प्रविष्टि के बाद 6 प्रतिनिधि phenotype चित्रा. T7 आरएनए पोलीमरेज़ निर्भर प्रमोटर अनुक्रम नदी के ऊपर क्षमता नियामक जीन tfoX TransFLP metho का उपयोग कर के एकीकृत किया गया थाघ (ग्राफ स्केच के संस्करण). माता पिता वी. कोलरा तनाव (ADVCH T7POL) एक T7 शाही सेना पोलीमरेज़ lacUV5 प्रमोटर द्वारा संचालित जीन होते हैं. ग्राफ़: माता पिता का तनाव (1 गलियों और 2) ADVCH T7POL और तनाव TransFLP (:: ADVCH T7POL-T7-tfoX FRT, गलियों 3 और 4) द्वारा चालाकी से प्राकृतिक transformability लिए अनुपस्थिति में परीक्षण किया गया (1 गलियों और 3 ) या 1mm IPTG (2 गलियों और 4) की उपस्थिति. बदलने जीनोमिक डीएनए 8 A1552 lacZ - कान तनाव से निकाला गया था. परिवर्तन आवृत्तियों Y-अक्ष पर दिया जाता है. <डेसीलीटर, ~ 10 -8 एक्स 5 की सीमा का पता लगाने के नीचे. ** पी <0.01 (के रूप में छात्र लॉग इन तब्दील डेटा की टी परीक्षण द्वारा निर्धारित की जाती है). पाठ 'T7' के साथ काला तीर: T7 आरएनए प्रमोटर अनुक्रम पोलीमरेज़ निर्भर बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
TransFLP विधि ऊपर और कहीं वर्णित 5 बड़े पैमाने पर किया गया है हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है. आनुवंशिक जोड़तोड़ कि संभव है की तरह दूसरों के बीच में शामिल हैं: एकल जीन और जीन समूहों का विलोपन, जीनोमिक द्वीपों का विलोपन (जैसे, VPI-1), ब्याज की एक जीन (जैसे, प्रमोटर दृश्यों) के अपस्ट्रीम दृश्यों की प्रविष्टि की प्रविष्टि अंत में एक विशेष जीन (जैसे, एन्कोडिंग आत्मीयता टैग) के दृश्यों.
TransFLP के लिए एक आयात शर्त है कि संबंधित वी. कोलरा तनाव स्वाभाविक रूप से बदला जाने वाला है. कभी कभी यह है, हैजा रोगियों से प्राप्त आइसोलेट्स में विशेष रूप से मामला नहीं है. ऐसे उपभेदों अक्सर कोरम संवेदन सर्किट जैसे भीतर उत्परिवर्तित कोरम संवेदन, 17 HapR के प्रमुख नियामक जीन एन्कोडिंग के भीतर. वापस hapR की एक प्रति उपलब्ध कराने के इन 6 उपभेदों exempli रूप में प्राकृतिक transformability restoresHapR दोषपूर्ण तनाव N16961 18 के लिए fied.
संभावित संशोधनों प्राकृतिक परिवर्तन 8 मामले में आवृत्ति बहुत कम है के बाद बैक्टीरिया के संवर्धन के रूप में शामिल कर सकते हैं. कृपया ध्यान दें कि परिवर्तन आवृत्ति सामान्य रूप में है के मामले में कम PBR flp प्लाज्मिड पहले से ही मौजूद है जबकि chitin प्रेरित प्राकृतिक परिवर्तन परख कर. यह सबसे अधिक संभावना PBR flp से flp जीन, है जो एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट और इन transformants के लिए चयन करने में असमर्थता की समयपूर्व छांटना में परिणाम होगा के तापमान संवेदनशील अभिव्यक्ति की आंशिक रिसाव के कारण होता है. इसलिए हम महत्वपूर्ण मामलों के लिए सिफारिश करने के लिए प्राकृतिक परिवर्तन कदम के बाद PBR flp प्लाज्मिड डालने.
एक और महत्वपूर्ण कदम 2 पीसीआर के एन डी दौर है, जो तीन 1 सेंट दौर पीसीआर टुकड़े गठबंधन होगा. यह हो सकता है कि आंशिक टुकड़े पीसीआर इसकी वजह के बाद मौजूद हैंction (उदाहरण के लिए, केवल टुकड़े के एक आंशिक विधानसभा 'अप' और 'FRT - कान - FRT' आकृति 1 के अनुसार). यह नगण्य है, के रूप में लक्षित गुणसूत्र क्षेत्र के साथ डबल मुताबिक़ पुनर्संयोजन इस स्थिति में नहीं हो सकता है. के रूप में केवल एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट शरण transformants लिए चुना है, गैर वांछित डीएनए के आदान - प्रदान के साथ अन्य सभी transformants अपवर्जित कर रहे हैं.
कई दौर के लिए प्रक्रिया की पुनरावृत्ति के लिए सम्मान के साथ एक और बात को ध्यान में रखना है. हम पहले से ही सफलतापूर्वक संयुक्त pathogenicity द्वीप (VPI-1) और एक अन्य डाह जीन क्लस्टर (Blokesch, अप्रकाशित) का विलोपन के साथ ctxAB जीन क्लस्टर का विलोपन. इसके अलावा, हम प्रभावी रूप से इन उपभेदों (नदी के ऊपर और कहीं tfoX) के भीतर T7 आरएनए पोलीमरेज़ निर्भर प्रमोटर एकीकृत. हालांकि, जीनोटाइप कल्पना की लगातार सभी तनाव मध्यवर्ती के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए और डी के रूप में कॉलोनी पीसीआर द्वारा (जैसे,चित्रा 4 में emonstrated). यह करने के लिए एक दूसरे के साथ FRT निशान के पीछे undesired FLP की मध्यस्थता बाईं (सभी आंकड़े में लाल आयताकार रूप में दिखाया गया है) के पुनर्संयोजन बाहर जबकि अभी भी PBR flp प्लाज्मिड बैक्टीरिया में मौजूद है में मदद मिलेगी. यह शायद दूर स्थित जीन के लिए अवहेलना किया जा सकता है, संभावना है कि के बीच क्षेत्र के छांटना घातक आवश्यक जीन का विलोपन के कारण होगा के रूप में बहुत अधिक है.
अंत में, हम operons भीतर जीन का विलोपन पर चर्चा करना चाहते हैं. हम बाहर नहीं कर सकते कि एक नदी के ऊपर जीन है, जो एक FRT निशान के पीछे छोड़ देता है का विलोपन अनुप्रवाह जीन (ओं) की अभिव्यक्ति बदल सकता है. यह सुनिश्चित करने के लिए कि इस प्रभाव phenotype नमूदार नहीं पैदा कर रहा है, लेकिन यह है कि यह वास्तव में हटाए जाने के कारण होता है, एक complementation परख की सिफारिश की है. एक और नियंत्रण है कि हम पहले से ही सफलतापूर्वक प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया withou जीन के ब्याज की FRT निशान बहाव के एकीकरण हैटी को हटाने के बाद. हम हमारी प्रयोगशाला में इस तरह की समस्याओं का अभी तक पालन नहीं किया था, लेकिन उनके अस्तित्व को बाहर नहीं कर सकते.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
मैं तकनीकी सहायता के लिए ओल्गा डी सूजा सिल्वा स्वीकार करना चाहते हैं. यह काम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (SNSF) 31003A_127029 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
References
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