Summary
Un método rápido para modificar el genoma de
Abstract
Hay varios métodos disponibles para manipular los cromosomas bacterianos 1-3. La mayoría de estos protocolos se basan en la inserción de plásmidos replicativos condicionalmente (por ejemplo, albergar replicones pir-dependientes o sensibles a la temperatura 1,2). Estos plásmidos se integran en los cromosomas bacterianos basado en la recombinación mediada por homología. Tales mutantes de inserción son a menudo utilizados directamente en la configuración experimental. Alternativamente, la selección para la escisión del plásmido seguido por su pérdida puede ser realizado, para que las bacterias Gram negativas a menudo se basa en la enzima sacarasa contraseleccionable levano codificada por el gen sacB 4. La escisión puede restaurar el genotipo pre-inserción o resultado en un intercambio entre el cromosoma y la copia codificada por plásmidos del gen modificado. Una desventaja de esta técnica es que requiere mucho tiempo. El plásmido tiene que ser clonado primero, que requiere la transferencia horizontal en V. cholerae más (n otably en el apareamiento con una E. coli cepa donante) o transformación artificial de este último, y la escisión del plásmido es aleatoria y puede restaurar el genotipo inicial o crear la modificación deseada si no hay selección positiva se ejerce. Aquí, se presenta un método para la manipulación rápida de la V. cholerae cromosoma (s) 5 (Figura 1). Este método se basa en TransFLP el recientemente descubierto quitina mediada por la inducción de competencia natural en este organismo representante 6 y otro del género Vibrio, como V. fischeri 7. Competencia natural permite la captación de ADN libre incluyendo fragmentos de ADN generados por PCR. Una vez absorbido, el ADN se recombina con el cromosoma dada la presencia de un mínimo de 250-500 pb de la región homóloga flanqueante 8. Incluyendo un marcador de selección en-entre estas regiones flanqueantes permite la fácil detección de los transformantes que ocurren con frecuencia.
t "> Este método se puede utilizar para diferentes manipulaciones genéticas de V. cholerae y bacterias naturalmente competentes también potencialmente otros. Proporcionamos tres ejemplos novedosos en lo que puede lograrse por este método, además de nuestro estudio publicado anteriormente sobre las supresiones de genes individuales y el Además de las secuencias de etiqueta de afinidad-5. Varios pasos de optimización sobre el protocolo inicial de quitina inducida por transformación natural 6 se incorporan en este protocolo TransFLP. Estos incluyen entre otros la sustitución de fragmentos de conchas de cangrejo por comercialmente disponible quitina copos 8, la donación de PCR derivado de ADN como la transformación de material 9, y la adición de sitios diana de recombinación FLP-(FRT) 5. sitios FRT permitir la escisión dirigida a sitio del marcador de selección mediada por la recombinasa Flp 10.Protocol
El método TransFLP (Figura 1) se ejemplifica mediante tres enfoques diferentes: i) la deleción de dos genes adyacentes que codifican los determinantes de virulencia de V. cholerae (por ejemplo, ΔctxAB), II) la extracción de una isla de patogenicidad (por ejemplo, ΔVPI-1), y III) la integración de una secuencia de T7 RNA polimerasa dependiente de promotor aguas arriba de un gen de interés, lo que permite posteriormente su artificial expresión en la cepa de fondo respectivo (por ejemplo, T7-tfox) (Figura 2).
1. Preparación de Copos de quitina
- Peso 50-80 mg de copos de quitina en un tubo de plástico estándar de 1,5 ml. Este puede ser preparado en grandes cantidades. Copos de quitina están disponibles comercialmente de Sigma (número cat. C9213).
- Autoclave los copos de mantenimiento de las tapas de los tubos abiertos.
- Inmediatamente después de cerrar las tapas de la autoclave se ha enfriado.
- Tienda autoclave quitina escamasa temperatura ambiente.
2. Opcional: Transformación artificial de V. cholerae con Flp recombinasa plásmido que codifica
- Preparar electrocompetentes V. cholerae células utilizando métodos estándar 11. La tienda de alícuotas de células competentes a -80 ° C.
- Añadir 1-2 l de una normal de mini-preparación de plásmido pBR-flp 5 a la electrocompetentes V. células cholerae y transferir la mezcla en una cubeta de electroporación (0,2 cm ancho hueco).
- Aplicar un pulso a 1,6 kV.
- Añadir 0,9 ml de medio SOC, suavemente la transferencia de células a un tubo estándar de 14 ml. Incubar que no se mueve durante 2,5 a 3 horas a 30 ° C.
- Placa de 100 l y 300 l en placas de LB que contenían 100 ug / ml de ampicilina y se incuba a 30 ° C durante la noche.
- Purificar solo clon y almacena como reserva de glicerol para experimentos TransFLP futuras.
3. Diseño de oligonucleótidos y reacción en cadena de la polimerasa
- Al menos seis oligonucleótidos se requieren para amplificar la región de ADN (s) de interés, así como el casete FRT-flanqueado antibiótico por PCR (Figura 3). Se recomienda incluir también un par de oligonucleótidos de cebado fuera del fragmento de PCR insertado. Esto permite la comprobación de la integración y la escisión correcta de la casete de resistencia a FRT-flanqueado antibiótico (por ejemplo, representado como 'chk-up' y cebadores 'chk hacia abajo "en las figuras 3 a 5).
- Diseñar los oligonucleótidos # 2, # 3, # 4, # 5 y con cuidado. Ellos deben ser capaces de hibridarse suficientemente (por ejemplo, ~ 28 pb) a la plantilla de ADN. La plantilla de ADN es ADN genómico (gDNA) para los cebadores # 2 y # 5 y FRT-Kan-FRT-que contiene ADN plásmido tal como pROD17 12 y pBR-FRT-KAN FRT-(este estudio) para los cebadores # 3 y # 4 ( Figura 3A).
- Diseño de los cebadores # 2 al # 5 que permite una amplia base-apareamiento en su extremo 5 'entre el # 2 / # 3 y # 4 / # 5, respectivamente (Figura 3A
- Realizar tres reacciones de PCR independientes como 1 ª ronda de PCR. El primero será amplificar la región corriente arriba del gen / ADN de la región de interés con la ayuda de oligonucleótidos # 1 y # 2. La PCR debería resultar en un fragmento de al menos 500 pb de longitud para permitir la recombinación homóloga dentro de las células. Fragmentos más cortos (~ 250 pb) puede ser suficiente 8 pero no se recomiendan.
- En paralelo realizar la segunda PCR, que amplifica el casete FRT-flanqueado antibiótico. Para los ejemplos que aquí se utiliza principalmente aph (kan R). Uso oligonucleótidos # 3 y # 4 para esta reacción (Figura 3A).
- Al mismo tiempo, amplificar la región de ADN corriente abajo por PCR (tercera muestra). El fragmento de PCR también debe ser de al menos 500 pb de longitud. Realizar la PCR con gDNA como molde y los oligonucleótidos # 5 y # 6 (Figura 3A).
- Después de la purificación de todos PCR tresfragmentos, lleve a cabo la 2 ª ronda de PCR. Usar una mezcla igual de los tres fragmentos obtenidos en la primera ronda como molde. La amplificación es catalizada por los oligonucleótidos # 1 y # 6. El fragmento resultante de PCR (Figura 3B) sirve como la transformación de ADN en el experimento de transformación natural (Figura 1).
4. La quitina inducida por transformación natural
- Crecer V. células cholerae aeróbicamente en medio rico a 30 º C hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm de aproximadamente 0,5.
- Cosechar las bacterias por centrifugación. Lavar la pella una vez en medio artificial definido (DASW 6) antes de resuspender las células en 2 volúmenes de DASW. Añadir 1 ml de cultivo a 50-80 mg de escamas estéril quitina (como se explica en el punto 1). Si las bacterias puerto plásmido pBR-flp (opcional punto 2), añadir ampicilina (50 mg / ml) a la cultura. Incubar a 30 ° C durante 16-24 h sin movimiento.
- Añadir & ge; 200 ng de la 2 ª ronda de PCR fragmento derivado (que se explica en el punto 3). Mezclar cuidadosamente sin ampliamente separar las bacterias de las superficies de quitina. Incubar a 30 ° C durante 24 horas sin movimiento.
- Vortex la cultura extensamente durante ≥ 30 segundos. Corre 100-300 l selectivos en placas de LB medio (por ejemplo, kanamicina o gentamicina que contienen placas de LB ejemplos proporcionados aquí). El uso de dos placas selectivas si las bacterias albergar el plásmido pBR-flp añadiendo ampicilina concomitantemente a los otros antibióticos. Incubar las placas a 30 ° C durante 16-24 horas o hasta que las colonias son visibles.
- Aislar transformantes individuales de placas selectivas. Tales transformantes han sustituido el locus cromosómico original por el fragmento de PCR debido a un evento de doble entrecruzamiento. Estas cepas se pueden usar directamente para experimentos adicionales en caso de que la eliminación de la casete de antibiótico no es necesario.
5. La eliminación selectiva de casete (s) por Flp-Recombinación
- Artificialmente transformar sus transformantes con el plásmido pBR-flp como se describe en el punto 2 si no se hace antes de que el ensayo de transformación natural.
- Cultivar las bacterias en placas de agar LB que contenían ampicilina a 37 ° C durante 16-24 h. Opciones: cambiar la temperatura entre el 2-3 hr a 40 ° C, según la expresión de FLP del plásmido pBR-flp se de-reprimidos a altas temperaturas; 5,10 bacterias de transferencia a placas frescas después de aprox. 8 horas de incubación.
- Prueba de sensibilidad a los antibióticos (demostrada aquí para kanamicina; Figura 1) por restreaking los clones en paralelo sobre placas de agar que contienen antibiótico ni antibióticos. Aislar colonias individuales sensibles. Congelar clon resistente a la ampicilina como la acción del glicerol si tiene intención de modificar aún más la tensión con supresión otro / inserción con TransFLP.
6. Curado del plásmido
- Cultive hasta el día bajo condiciones aeróbicas ya 30 º C. Usar medio rico sin la adición de ningún antibiótico.
- Opcional: Crecer cultivo fresco por 3-6 horas por dilución de 1:100 del cultivo de una noche fresca en medio libre de antibióticos.
- Placa o estría de dilución (s) de cultivo en placa de agar LB sin formato (s) e incubar a 30 ° C durante 8-16 h (hasta que las colonias son visibles).
- Prueba de sensibilidad a la ampicilina de los clones por restreaking los clones en paralelo sobre placas de agar que contienen antibióticos y libre de antibióticos-(Figura 1). Congelar ampicilina cepa sensible como la acción del glicerol.
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Representative Results
Los resultados representativos de los tres ejemplos que se muestran en las Figuras 4 a 6. El primer enfoque dirigido a eliminar los genes vecinos ctxA y ctxB. Juntos codifican el factor de virulencia de V. cholerae, la toxina del cólera. Hemos diseñado oligonucleótidos para el método TransFLP como se ha descrito anteriormente y según la figura 3. La cepa parental, la cepa intermedia albergar el casete FRT-flanqueado resistencia a los antibióticos en el locus de ADN original de ctxAB y la cepa final eliminada para ctxAB y se liberó de la casete de resistencia fueron todos probados por su genotipo (Figura 4). El método de elección fue la de células enteras PCR. Se utilizaron cebadores que no se reasocian a la transformación de fragmento de PCR, pero sólo a ADN cromosómico (Figura 3). Esto nos permitió verificar el cambio de sitio específico del fragmento de PCR con la región homóloga del cromosoma (Figura 4A). Los fragmentos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa estándar para determinar su tamaño (Figura 4B). Esta estrategia se puede utilizar para comprobar la cepa intermedios y para confirmar la construcción de la cepa (s) final.
Para el segundo ejemplo, la eliminación de una isla genómica todo, elegimos la isla de patogenicidad Vibrio 1 (VPI-1) como destino 13. El procedimiento TransFLP estándar descrito anteriormente no tuvo éxito en este caso. Se sabe de los estudios anteriores que tal región de ADN de gran tamaño puede ser intercambiada por una región de ADN de tamaño similar utilizando quitina inducida por transformación natural 9. Por lo tanto, la hipótesis de que la diferencia de tamaño entre la región-a-ser-eliminada y el más corto transformar fragmento de PCR (<3,5 kb) puede ser el factor limitante. Por lo tanto, decidió utilizar el método TransFLP en dos pasos: en primer lugar integrar el gen aph (kan R) precedido por un único FRT sitio en el inicio de VPI-1 (ilustrado en la Figura 5A). A continuación realizó una segunda ronda de transformación natural, lo que nos permitió insertar un casete de resistencia a los antibióticos adicional (gm R, que confiere resistencia a la gentamicina) seguido de un sitio FRT segundos al final de la isla de patogenicidad (Figura 5A). El respectivo doble cepa resistente a electroporación para insertar plásmido pBR-flp y el método TransFLP se continuó como se ha descrito anteriormente. La cepa resultante carecía de la totalidad VPI-1 como se verifica por PCR de ADN genómico purificado (Figura 5B).
Para el tercer ejemplo hemos integrado un T7 polimerasa dependiente de ARN secuencia promotora cadena arriba de un gen de interés, en nuestro caso, el gen que codifica el regulador principal de la transformación natural tfox 6. Esto se hizo utilizando el método TransFLP con una ligera modificación del protocolo estándar: se incluyeron la p T7 RNA dependienteromoter secuencia de consenso de acuerdo con Ref. 14 como voladizos en los oligonucleótidos # 4 y # 5. Con esta estrategia, la T7 polimerasa dependiente de la secuencia promotora de ARN se mantuvo en el cromosoma incluso después de que el cassette de resistencia a los antibióticos se escindió (Figura 6). Hemos integrado la construcción en V. cholerae cepa ADVCH-T7pol, que alberga el gen de la ARN polimerasa de T7 impulsada por el promotor lacUV5 (Blokesch, no publicado). Para probar la funcionalidad de la construcción, a saber, la T7 ARN polimerasa dependiente de la expresión de tfox, hemos realizado ensayos naturales de transformación en medio LB. La cepa parental no es, naturalmente, transformable en estas condiciones debido a la falta de transcripción tfox en medio rico y en ausencia de su quitina inductor natural (Figura 6). Este fenotipo era independiente de si la ARN polimerasa de T7 fue inducida artificialmente por IPTG o no (Figura 6, carriles 1 y 2, Respectively). Sin embargo, la cepa TransFLP generada ADVCH-T7pol-T7-tfox :: FRT, el cual contiene la T7 RNA polimerasa dependiente de promotor aguas arriba de la competencia gen tfox, era de hecho naturalmente transformable en medio rico (Figura 6, carriles 3 y 4) . Debido a la fuga del promotor lacUV5 en medio LB 15 producido la ARN polimerasa de T7 tfox ya transcritos de la ARN polimerasa T7 dependiente de promotor sin inducción. Esta competencia inició natural y transformación confirmar la funcionalidad de la secuencia integrada T7 promotor de ARN polimerasa dependiente (Figura 6, carril 3). Este fenotipo fue significativamente mayor de inducción total de la ARN polimerasa de T7 debido a la adición del inductor del promotor lacUV5, IPTG (Figura 6, carril 4).
Figura 1.Diagrama de flujo del método TransFLP. Los seis puntos descritos en este protocolo se redactó:.. 1) Preparación de copos de quitina, 2) Opcional: transformación artificial de V. cholerae con recombinasa Flp plásmido que codifica;. 3) diseño de oligonucleótidos y reacción en cadena de la polimerasa;. 4) quitina inducida por la transformación natural; 5) La eliminación selectiva de casete (s) por recombinación FLP;... 6) curado del plásmido clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 2. Representación esquemática de tres posibilidades de aplicación para el método TransFLP. I) Un fragmento de 1458 pares de bases de ADN, que contiene la toxina del cólera que codifica los genes ctxA y ctxB, ha sido eliminada como se indica por Δ. II) El ~ 40 kb Vibrio isla de patogenicidad 1 (VPI-1 13)se eliminó de la cepa de tipo salvaje. III) Un T7 polimerasa dependiente de la secuencia promotora de ARN (28 pb) se integra corriente arriba del gen tfox. El rectángulo rojo indica la izquierda detrás de corta secuencia de nucleótidos de un solo sitio FRT 10. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 3. Explicación para el primer diseño y el rendimiento de la PCR basada en la supresión de ctxAB. Panel A: Para la ronda 1 ª PCR de ADN genómico (gDNA) y plásmidos pROD17 12 y pBR-FRT-Kan-FRT, respectivamente, sirven como plantillas. Los oligonucleótidos requeridos son # 1 a # 6. El cebador # 2 / # 3 y # 4 / # 5 (ejemplo en el recuadro) deben también poseer un solapamiento significativo entre sí en sus extremos 5 '. Panel B: Después de la 2 ª ronda dePCR, que se basa en los fragmentos 1 ª ronda de PCR como plantilla, un fragmento largo deben obtenerse utilizando par de cebadores # 1 + # 6. Haga clic aquí para ampliar la figura .
Figura 4. Resultado esperado ejemplificado por la estrategia de supresión ctxAB. La cepa original (wild-type), la inserción mutante Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT, y la final cepa Δ ctxAB :: FRT se ensayaron sus genotipos. Un panel: Representación esquemática de la potencia de la diferenciación de la pareja de cebadores ctx-chk-up y ctx-chk-down, en particular con respecto a la escisión del casete de antibiótico. Panel B: células bacterianas enteras fueron utilizados como plantilla en las reacciones de PCR. Para comprobar si el ADN modificado locus primers chk chk-up y down-se utilizaron. Los fragmentos amplificados por PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron mediante tinción de ADN SYBR seguro. Pista 1: Wild-tipo V. cholerae, carril 2: cepa Δ ctxAB :: FRT-Kan-FRT, carril 3: Δ ctxAB :: FRT. Esperados tamaños de los fragmentos de PCR de acuerdo con el panel A se indica a la derecha. L, 1kb ladder (Invitrogen). Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 5. Estrategia para confirmar la eliminación de la isla genómica. Panel A: Esquema de la isla de patogenicidad Vibrio 1 (VPI-1) (adaptación libre de la referencia 16; no a escala.). Para la cepa de tipo salvaje de la región de interés es no amplificable por medio de PCR estándar y los cebadores VPI-1-específico chk-chk arriba y hacia abajo (~ 40 kb). Por lo tanto un adicionaloligonucleótido recocido dentro de la región a-ser-eliminados se aplicó (VC0817-back), junto con VPI-chk-up. Panel B: resultado representativo usando ADN genómico de las cepas respectivas como molde y los pares de cebadores se indica encima de cada imagen. Las cepas probadas: Wild-tipo V. cholerae cepa (carril 1), la cepa VPI :: FRT-Kan/Gm-FRT (carril 2), y ΔVPI 1-:: FRT (carril 3). Los tamaños de los fragmentos de PCR como se predijo en el panel A se indica a la derecha. L, 1kb ladder (Invitrogen). Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 6. Representante fenotipo después de la inserción de una secuencia de promotor artificial. La T7 polimerasa dependiente de ARN secuencia promotora se integra corriente arriba de la tfox competencia de regulación de genes utilizando la meto TransFLPd (dibujo gráfico anterior). La parental V. cholerae cepa (ADVCH-T7pol) contiene un gen de ARN polimerasa de T7 impulsada por el promotor lacUV5. Gráfico: La cepa parental ADVCH-T7pol (carriles 1 y 2) y la cepa manipulada por TransFLP (ADVCH-T7pol-T7-tfox :: FRT; carriles 3 y 4) se ensayaron para la transformabilidad natural en ausencia (carriles 1 y 3 ) o presencia de 1 mM de IPTG (carriles 2 y 4). Transformación de ADN genómico se obtuvo a partir de la cepa A1552-LacZ-Kan 8. Las frecuencias de transformación se da en el eje-Y. <Dl, por debajo del límite de detección de ~ 5 x 10 -8. ** P <0,01 (según lo determinado por la prueba de la t de Student de log-transformado los datos). Flecha negro con 'T7' text:. T7 RNA polimerasa dependiente de la secuencia promotora Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Discussion
El método TransFLP descrito anteriormente y en otros lugares 5 ha sido ampliamente utilizado en nuestro laboratorio. El tipo de manipulaciones genéticas que son factibles incluyen, entre otros: la supresión de los genes individuales y grupos de genes, la supresión de las islas genómicas (por ejemplo, VPI-1), la inserción de secuencias de aguas arriba de un gen de interés (por ejemplo, secuencias de promotor) y la inserción de secuencias en el extremo de un gen específico (por ejemplo, etiquetas de codificación de afinidad).
Un requisito previo para la importación de TransFLP es que el respectivo V. cholerae es naturalmente transformable. Esto a veces no es el caso, especialmente en aislamientos derivados de pacientes de cólera. Tales cepas son frecuentemente mutado en el ejemplo la detección de quórum circuito, dentro del gen que codifica el regulador principal de la detección de quórum, HapR 17. Proveer de nuevo una copia de hapR restaura transformabilidad natural en estos 6 cepas como ejemplificacado para la cepa HapR defectuoso N16961 18.
Posibles modificaciones pueden ser incorporadas, tales como el enriquecimiento de las bacterias después de la transformación natural 8 en caso de que la frecuencia es demasiado baja. Por favor, tenga en cuenta que la frecuencia de transformación es en general inferior en el caso del plásmido pBR-flp ya está presente mientras se hace el ensayo de quitina inducida por la transformación natural. Esto es muy probablemente causado por la fuga parcial de la expresión sensible a la temperatura del gen FLP de pBR-flp, lo que resultaría en la escisión prematura de la casete de resistencia a los antibióticos y la incapacidad para seleccionar estos transformantes. Por lo tanto recomendamos para casos críticos para insertar el plásmido pBR-flp después de la etapa de transformación natural.
Otro paso importante es la 2 ª ronda de PCR, que combinará las tres 1 ª ronda de fragmentos de PCR. Puede ocurrir que los fragmentos parciales están presentes después de la rea PCRcción (por ejemplo, un conjunto parcial de fragmentos únicos "arriba" y "FRT-Kan-FRT" de acuerdo a la Figura 1). Esto es despreciable, como doble recombinación homóloga con la región cromosómica específica no puede ocurrir en esta situación. Como sólo los transformantes que albergaban el casete de resistencia a los antibióticos se seleccionan para, todos los transformantes con otros intercambios de ADN no deseados están excluidos.
Otro punto a tener en cuenta es con respecto a la repetición del procedimiento de varias rondas. Ya hemos combinado con éxito la supresión de la agrupación de genes ctxAB con la supresión de la isla de patogenicidad (VPI-1) y otro grupo de genes de virulencia (Blokesch, no publicado). Además, se ha integrado de manera efectiva la T7 RNA polimerasa dependiente de promotor dentro de estas cepas (aguas arriba tfox y en otros lugares). Sin embargo, el genotipo previsto debe ser constantemente a prueba para todos los compuestos intermedios de tensión (por ejemplo, mediante PCR de colonias como demonstrated en la Figura 4). Esto ayudará a excluir la indeseada mediada por FLP recombinación de la izquierda detrás de cicatrices FRT (que se muestra como rojo rectangular en todas las figuras) uno con el otro, mientras que el plásmido pBR-flp está todavía presente en las bacterias. Esto probablemente puede descartarse por genes localizados remotamente, como la probabilidad de que la escisión de la región en el medio podría ser letal debido a la deleción de genes esenciales es muy alta.
Por último, nos gustaría hablar de la supresión de los genes dentro de operones. No se puede excluir que la deleción de un gen aguas arriba, lo que deja una cicatriz detrás de FRT, puede cambiar la expresión del gen corriente abajo (s). Para asegurar que este efecto no está causando el fenotipo observable, pero que este efecto está causado por la eliminación, un ensayo de complementación se recomienda. Otro control que ya se ha utilizado con éxito en el laboratorio es la integración de las aguas abajo de la cicatriz FRT withou gen de interést eliminar el último. No se observaron problemas en nuestro laboratorio, pero aún no se puede excluir su existencia.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Me gustaría reconocer Olga de Souza Silva de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Fondo Nacional Suizo (FNS) Grant 31003A_127029.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
| OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |
References
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