Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

TransFLP - طريقة لتعديل وراثيا Published: October 8, 2012 doi: 10.3791/3761

Summary

وهناك طريقة سريعة لتعديل جينوم

Abstract

تتوفر العديد من الطرق لمعالجة الكروموسومات البكتيرية 1-3. معظم هذه البروتوكولات تعتمد على إدخال البلازميدات تنسخي مشروط (مثل إيواء replicons البير التي تعتمد على درجة الحرارة أو تراعي 1،2). يتم دمج هذه البلازميدات البكتيرية في الكروموسومات تقوم على التماثل بوساطة إعادة التركيب. وغالبا ما تكون مثل هذه المسوخ غرزي استخدامها مباشرة في إعدادات التجريبية. وبدلا من ذلك، يمكن إجراء الختان لاختيار البلازميد تليها خسارتها، والتي لالجراثيم سلبية الغرام تعتمد في أغلب الأحيان على انزيم مكافحة اختيار سكراز ليفان المشفرة بواسطة الجينات هيئة تنسيق المعونة 4. يمكن للالختان إما استعادة النمط الجيني ما قبل الإدراج أو تؤدي إلى تبادل بين كروموسوم ونسخة بلازميد ترميز الجين المعدلة. عيوب هذا الأسلوب هو أنه يستغرق وقتا طويلا. البلازميد لابد من استنساخ الأولى؛ أنه يتطلب نقل الأفقي إلى V. الكوليرا (ن معظم otably من التزاوج مع E. سلالة الإشريكية المانحة) أو التحول الاصطناعي لهذه الأخيرة؛ واستئصال البلازميد هو عشوائي ويمكن إما استعادة النمط الجيني الأولي أو إنشاء التعديل المطلوب إذا لم يمارس اختيار إيجابية. هنا، نقدم طريقة للتلاعب السريع للV. الكوليرا كروموسوم (ق) 5 (الشكل 1). ويستند هذا الأسلوب على تحريض TransFLP كيتين بوساطة اكتشفت مؤخرا من الكفاءة الطبيعية في هذا الحي ممثل 6 و أخرى من جنس الضمة مثل V. fischeri 7. الكفاءة الطبيعية يسمح للامتصاص الحمض النووي DNA مجانا بما في ذلك شظايا ولدت PCR. تؤخذ مرة واحدة حتى، ويعيد توحيد DNA مع كروموسوم معين وجود ما لا يقل عن 250-500 من بي بي المرافقة مثلي المنطقة 8. منها علامة الاختيار في الفترات الفاصلة بين هذه المناطق المحيطة يسمح الكشف سهولة transformants التي تحدث في كثير من الأحيان.

ر "> ويمكن استخدام هذه الطريقة لمعالجات وراثية مختلفة من الكوليرا V. وربما غيرها أيضا البكتيريا المختصة بشكل طبيعي. نحن نقدم أمثلة ثلاثة على رواية ما يمكن تحقيقه باستخدام هذا الأسلوب بالإضافة إلى دراستنا المنشورة سابقا على الحذف جين واحد وعلى إضافة علامة تقارب-متواليات 5. يتم دمج عدة خطوات التحسين بشأن بروتوكول الأولي من الكيتين التي يسببها التحول الطبيعي 6 في هذا البروتوكول TransFLP. وتشمل هذه وغيرها استبدال شظايا قذيفة السلطعون من رقائق كيتين المتاحة تجاريا على التبرع PCR المستمدة من الحمض النووي وتحويل المواد وإضافة المواقع المستهدفة FLP-إعادة التركيب (FRT) 5. مواقع FRT يسمح الختان الموقع موجه للعلامة الاختيار بوساطة recombinase FLP 10.

Protocol

ويتمثل الأسلوب TransFLP (الشكل 1) من ثلاثة مناهج مختلفة: I) حذف اثنين من الجينات المجاورة ترميز المحددات الفوعة من V. الكوليرا (على سبيل المثال، ΔctxAB)؛ II) إزالة جزيرة المرضية (مثل ΔVPI-1)، وIII) إدماج بوليميراز RNA T7 التي تعتمد على تسلسل المروج المنبع من الجينات المصلحة من الذي يسمح له لاحقا اصطناعية التعبير في الخلفية سلالة منها (على سبيل المثال، T7-tfoX) (الشكل 2).

1. إعداد رقائق كيتين

  1. الوزن 50-80 ملغ من رقائق كيتين في مستوى 1،5 مل أنبوب بلاستيكي. يمكن إعداد هذه بكميات كبيرة. كيتين رقائق متاحة تجاريا من سيغما (الفئة رقم C9213).
  2. الأوتوكلاف رقائق الحفاظ على أغطية من الأنابيب مفتوحة.
  3. إغلاق الأغطية على الفور بعد الأوتوكلاف وتبريده.
  4. متجر تعقيمها كيتين رقائقفي درجة حرارة الغرفة.

2. اختياري: تحويل الاصطناعي V. الكوليرا مع FLP Recombinase ترميز البلازميد

  1. إعداد electrocompetent V. الكوليرا الخلايا باستخدام الطرق القياسية 11. تخزين مأخوذة من الخلايا المختصة في -80 ° C.
  2. إضافة 1-2 ميكرولتر من إعداد مصغرة العادية للبلازميد PBR-FLP 5 إلى electrocompetent V. الخلايا الكوليرا ونقل الخليط إلى كوفيت الصعق الكهربائي (0.2 عرض الفجوة سم).
  3. تطبيق النبض عند 1.6 كيلو فولت.
  4. إضافة 0.9 مل SOC المتوسطة، ونقل بلطف الخلية إلى أنبوب القياسية مل 14. غير احتضان الحركة ل2،5 حتي 3 ساعة عند 30 ° C.
  5. لوحة 100 ميكرولتر و 300 ميكرولتر على لوحات تحتوي على 100 ميكروغرام LB / مل الأمبيسلين واحتضان في 30 ° C بين عشية وضحاها.
  6. تنقية استنساخ واحدة ومخزن والأسهم الجلسرين للتجارب TransFLP المستقبل.

3. قليل النوكليوتيد تصميم وتفاعل البلمرة سلسلة

  1. مطلوب لا يقل عن ستة [أليغنوكليوتيد] لتضخيم المنطقة DNA (ق) من الفائدة وكذلك FRT-يحيط كاسيت المضادات الحيوية عن طريق PCR (الشكل 3). فمن المستحسن أن تدرج أيضا زوج من خارج فتيلة أليغنوكليوتيد] جزء PCR المدرجة. هذا يسمح التحقق من التكامل والختان الصحيح للكاسيت-FRT يحيط المقاومة للمضادات الحيوية (مثل صورت على أنها "CHK إلى أعلى 'والاشعال" CHK إلى أسفل "في أرقام 3 إلى 5).
  2. تصميم أليغنوكليوتيد] # 2، # 3، # 4، # 5 وبعناية. ينبغي أن تكون قادرة على يصلب بما فيه الكفاية (على سبيل المثال ~ 28 بي بي) إلى DNA القالب. الحمض النووي القالب الحمض النووي الجيني (gDNA) لالاشعال رقم 2 ورقم 5 و FRT-اساسه-FRT التي تحتوي على الحمض النووي البلازميد مثل pROD17 12 و PBR-FRT-KAN FRT-(هذه الدراسة) لالاشعال رقم 3 ورقم 4 ( الرقم 3A).
  3. تصميم الاشعال رقم 2 لرقم 5 واسعة تسمح قاعدة الاقتران في نهاية 5'ما بين رقم 2 / رقم 3 ورقم 4 / # 5 على التوالي (الشكل 3A
  4. أداء ثلاث تفاعلات PCR مستقلة والجولة 1 القديس PCR. وأول واحد تضخيم المنطقة المنبع للجين / DNA المنطقة في المصالح مع المعونة من [أليغنوكليوتيد] رقم 1 ورقم 2. ينبغي أن يؤدي إلى PCR جزء من شركة بريتيش بتروليوم لا يقل عن 500 في الطول للسماح إعادة التركيب مثلي داخل الخلايا. يمكن أقصر شظايا (~ 250 BP) من 8 كافية ولكن لا ينصح.
  5. بالتوازي أداء PCR الثانية، التي تزيد من الكاسيت FRT-يحيط المضادات الحيوية. لتقديم أمثلة ونحن هنا تستخدم أساسا APH (اساسه R). [أليغنوكليوتيد] استخدام رقم 3 ورقم 4 لهذا التفاعل (الشكل 3A).
  6. وفي نفس الوقت، تضخيم المنطقة DNA بواسطة PCR المصب (عينة الثالثة). يجب أن يكون جزء PCR أيضا لا يقل عن 500 شركة بريتيش بتروليوم في الطول. أداء PCR مع gDNA كقالب وأليغنوكليوتيد] # 5 و # 6 (الشكل 3A).
  7. بعد تنقية جميع PCR 3شظايا، نفذ الجولة الثانية 2 من PCR. استخدام خليط متساو من ثلاثة اجزاء على جميع الحصول عليها في الجولة الأولى كقالب. يتم تحفيز التضخيم من قبل أليغنوكليوتيد] رقم 1 ورقم 6. جزء PCR الناتجة (الشكل 3B) بمثابة تحويل DNA في التجربة التحول الطبيعي (الشكل 1).

4. كيتين الناجم عن التحول الطبيعي

  1. تنمو V. الكوليرا في الخلايا الهوائية المتوسطة الغنية في 30 ° C حتى تصل إلى الكثافة البصرية في 600 نانومتر تقريبا 0.5.
  2. حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي. غسل بيليه مرة واحدة في المتوسط ​​اصطناعية محددة (DASW 6) قبل resuspending الخلايا في 2 مجلدات من DASW. إضافة 1 مل من ثقافة إلى 50-80 ملغ من رقائق كيتين العقيمة (تحت أوضح نقطة 1). إذا البكتيريا الميناء البلازميد PBR-FLP (اختياري نقطة 2)، إضافة الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل) إلى الثقافة. احتضان في C ° 30 ساعة ل16-24 دون حركة.
  3. إضافة & Gه و 200 نانوغرام من جزء الثانية على مدار PCR المستمدة 2 (شرح تحت النقطة 3). مزيج بعناية دون فصل على نطاق واسع من البكتيريا على أسطح كيتين. احتضان في C ° 30 لمدة 24 ساعة دون حركة.
  4. دوامة الثقافة على نطاق واسع ل≥ 30 ثانية. نشر 100-300 ميكرولتر على انتقائية لوحات متوسطة LB (مثل لوحات أو الكاناميسين LB التي تحتوي على جنتاميسين للأمثلة المقدمة هنا). استخدام لوحات مزدوجة انتقائية إذا كان المرفأ البكتيريا البلازميد PBR-FLP بإضافة الأمبيسلين بصورة متزامنة إلى المضادات الحيوية الأخرى. احتضان لوحات في C ° 30 ساعة ل16-24 أو حتى المستعمرات مرئية.
  5. عزل واحدة من لوحات transformants انتقائية. وحلت هذه transformants موضع الكروموسومات الأصلي من جزء PCR نتيجة لحدث كروس مزدوجة. ويمكن استخدام هذه السلالات مباشرة لمزيد من التجارب في حالة إزالة كاسيت المضادات الحيوية ليست ضرورية.

5. إزالة راديو كاسيت الانتقائية (ق) من FLPإعادة التركيب،

  1. تحويل مصطنع transformants الخاص بك مع البلازميد PBR-FLP كما هو موضح في النقطة 2 إذا لم تفعل قبل الفحص التحول الطبيعي.
  2. تنمو هذه البكتيريا على لوحات أجار LB C تحتوي على أمبيسلين في ل16-24 ° 37 ساعة. خيارات: تغيير درجة الحرارة في ما بين ساعة لمدة 2-3 إلى 40 ° C والتعبير عن FLP من البلازميد FLP-PBR ودي في قمع 5،10 ارتفاع درجات الحرارة؛ البكتيريا نقل لوحات جديدة بعد تقريبا. 8 ساعات من الحضانة.
  3. اختبار الحساسية للمضادات الحيوية، (أظهر هنا لالكاناميسين؛ الشكل 1) من restreaking استنساخ بالتوازي على لوحات أجار المضادات الحيوية التي تحتوي على المضادات الحيوية والحرة. عزل المستعمرات الحساسة واحد. تجميد الأمبيسلين مقاومة للاستنساخ كما الجلسرين الأسهم إذا كنت تنوي تعديل المزيد من سلالة أخرى مع حذف / الإدراج باستخدام TransFLP.

6. بلازميد علاج

  1. تنمو بين عشية وضحاها الثقافة في الظروف الجوية وفي 30 ° C. استخدام المتوسطة الغنية دون إضافة أي مضاد حيوي.
  2. اختياري: نمو ثقافة جديدة للموارد البشرية 3-6 من تمييع 1:100 الثقافة بين عشية وضحاها في وسط المضادات الحيوية خالية الطازجة.
  3. لوحة خط أو التخفيف (ق) للثقافة في سهل LB وحة أجار (ق) واحتضان في 30 درجة مئوية لمدة 8-16 ساعة (حتى المستعمرات مرئية).
  4. اختبار لالأمبيسلين الحساسية من الحيوانات المستنسخة من restreaking استنساخ بالتوازي على لوحات أجار المضادات الحيوية التي تحتوي على المضادات الحيوية وخالية من (الشكل 1). تجميد الأمبيسلين سلالة حساسة والأسهم الجلسرين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتظهر نتائج ممثل في الأمثلة الثلاثة أرقام 4 إلى 6. النهج الأول يهدف إلى حذف الجينات المجاورة ctxA وctxB. معا ترميز عامل الفوعة الرئيسية للV. الكوليرا، بكتيريا الكوليرا. قمنا بتصميم [أليغنوكليوتيد] للأسلوب TransFLP كما هو موضح أعلاه وفقا للالشكل 3. سلالة الأبوية، وسلالة متوسطة إيواء FRT-يحيط كاسيت المقاومة للمضادات الحيوية في مكان الجريمة DNA الأصلي ctxAB والضغط النهائي لحذف ctxAB واطلاق سراح من كاسيت المقاومة لاختبار جميع الوراثي الخاصة بهم (الشكل 4). كان الأسلوب المفضل خلية كاملة PCR. استخدمنا الاشعال التي لا يصلب لتحويل جزء PCR ولكن فقط لDNA الكروموسومي (الشكل 3). هذا سمح لنا للتحقق من تبادل مواقع محددة من جزء PCR مع المنطقة من كروموسوم مثلي (Figure 4A). تم فصل أجزاء من PCR الكهربائي هلام الاغاروز القياسية لتحديد حجمها (الشكل 4B). ويمكن استخدام هذا استراتيجية للتأكد من سلالة وسيطة لتأكيد بناء سلالة (الختامية).

المثال الثاني ل، وإزالة جزيرة الجيني بأكمله، اخترنا بالحالة المرضية الضمة الجزيرة 1 (VPI-1) والهدف 13. وكان الإجراء TransFLP القياسية المذكورة أعلاه غير ناجحة في هذه الحالة. كانت تعرف من الدراسات السابقة التي يمكن تبادلها مثل هذه المنطقة الكبيرة من DNA DNA منطقة مماثلة الحجم باستخدام الكيتين التي يسببها التحول الطبيعي 9. افترضنا ذلك أن الفرق بين حجم المنطقة إلى حذف، أن وقصيرة بدلا جزء PCR تحويل (<3.5 كيلوبايت) قد يكون عاملا يحد. ولذلك قررنا استخدام الأسلوب TransFLP في خطوتين: أولا نحن متكاملة الجينات APH (R اساسه) يسبقه احد FRT موقع في بداية VPI-1 (موضح في الشكل 5A). ثم نفذنا الجولة الثانية من التحول الطبيعي الذي سمح لنا لإدراج راديو كاسيت إضافية المقاومة للمضادات الحيوية (جنرال موتورز تمنح المقاومة جنتاميسين)، يليه موقع FRT الثانية في نهاية من الجزيرة المرضية (الشكل 5A). وعلى كل electroporated مزدوجة مقاومة للسلالة لادخال البلازميد PBR-FLP واستمر أسلوب TransFLP كما هو موضح أعلاه. تفتقر إلى سلالة تنتج كل VPI-1 كما تم التحقق منها من قبل PCR من تنقية الحمض النووي الجيني (الشكل 5B).

مثال ثالث لأننا متكامل لبوليميراز RNA T7 التي تعتمد تسلسل المروج المنبع من الجينات الفائدة من، في حالتنا ترميز الجين المنظم الرئيسي للتحول الطبيعية tfoX 6. وقد تم ذلك باستخدام طريقة TransFLP مع تعديل طفيف من بروتوكول قياسي: قمنا بتضمين ع RNA T7 تعتمدromoter تسلسل الآراء وفقا لالمرجع. 14 كما يتدلى في أليغنوكليوتيد] # # 4 و 5. مع هذه الاستراتيجية كان يحتفظ بوليميريز RNA T7 التي تعتمد على تسلسل المروج على الكروموزوم حتى بعد رفعه الكاسيت المقاومة للمضادات الحيوية (الشكل 6). نحن في دمج بناء V. الكوليرا سلالة ADVCH-T7POL الذي يكن RNA T7 بوليميريز الجينات يقودها المروج lacUV5 (Blokesch، غير منشور). لاختبار وظيفة بناء، أي RNA T7 بوليميريز التي تعتمد على التعبير عن tfoX، أجرينا فحوصات التحول الطبيعي في المتوسط ​​LB. سلالة الأبوية ليست بطبيعة الحال التحويلية في ظل هذه الظروف نظرا لعدم وجود النسخ في tfoX المتوسطة الغنية وفي غياب محفز لها كيتين الطبيعية (الشكل 6). وكان هذا النمط الظاهري بغض النظر عما إذا كان اصطناعي RNA T7 بوليميريز بواسطة IPTG أم لا (الشكل 6، الممرات 1 و 2، respe) ctively. ومع ذلك، كان من سلالة TransFLP ولدت ADVCH-T7POL-T7-tfoX :: FRT، الذي يحتوي على RNA T7 بوليميريز التي تعتمد على المروج المنبع من اختصاص tfoX الجينات، بل التحويلية بشكل طبيعي في المتوسط ​​الغنية (الشكل 6، والممرات 3 و 4) . بسبب تسرب المروج lacUV5 في المتوسط ​​LB 15 وأنتجت بوليميراز RNA T7 tfoX المحولة بالفعل من RNA T7 بوليميريز التي تعتمد على المروج دون تحريض. بدأ هذا الاختصاص الطبيعي والتحول يؤكد وظيفة تسلسل متكامل RNA T7 بوليميريز المروج التي تعتمد على (الشكل 6، لين 3). وتعززت بشكل كبير هذا النمط الظاهري عن طريق الحث الكامل للبوليميراز RNA T7 بسبب إضافة محفز للمروج lacUV5، IPTG (الشكل 6، لين 4).

الشكل 1
الشكل 1.الرسم البياني للأسلوب TransFLP. وصاغت ست نقاط المبينة في هذا البروتوكول: 1) إعداد رقائق كيتين، 2) الاختياري: من التحول الصناعي V. الكوليرا مع FLP recombinase ترميز البلازميد؛ 3) تصميم قليل النوكليوتيد وتفاعل البلمرة سلسلة؛ 4) كيتين الناجم عن التحول الطبيعية؛ 5) إزالة انتقائية كاسيت (ق) من خلال إعادة التركيب، FLP؛.. 6) علاج البلازميد اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. تمثيل تخطيطي من الاحتمالات الثلاثة لتطبيق أسلوب TransFLP. تم حذف I) A DNA BP 1458 جزء، التي تحتوي على ترميز الجينات ctxA ذيفان الكوليرا وctxB، كما أشارت إلى ذلك Δ. II) و~ 40 كيلو بايت جزيرة الإمراضية الضمة 1 (VPI-1 13)تم حذف من سلالة من النوع البري. III) تم دمج A بوليميراز RNA T7 التي تعتمد على تسلسل المروج (28 بي بي) المنبع من الجين tfoX. المستطيل الأحمر يدل على اليسار وراء تسلسل النوكليوتيدات قصيرة لموقع FRT واحدة 10. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3
الشكل 3. شرح لتصميم التمهيدي وأداء PCR يعتمد على حذف ctxAB. لوحة A: للحصول على الجولة الحادية و1 من الحمض النووي الجيني PCR (gDNA) والبلازميدات pROD17 12 و PBR-FRT-FRT اساسه، على التوالي، شغل منصب القوالب. وأليغنوكليوتيد] المطلوبة هي رقم 1 لرقم 6. يجب التمهيدي رقم 2 / رقم 3 ورقم 4 / رقم 5 (على سبيل المثال في الشكل) تمتلك أيضا تداخل كبير مع بعضها البعض في 5'ends بهم. لوحة B: بعد الجولة الثانية 2 منPCR، الذي يقوم على أساس ال 1 شظايا سانت PCR جولة كقوالب، وينبغي الحصول على جزء طويل باستخدام الزوج التمهيدي رقم 1 + رقم 6. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 4
الشكل 4. النتيجة المتوقعة للاستراتيجية يتمثل حذف ctxAB. تم اختبار سلالة الأصلي (من النوع البري)، وغرزي متحولة Δ ctxAB :: FRT-اساسه-FRT، والمباراة النهائية سلالة ctxAB Δ :: FRT للالأنماط الجينية الخاصة بهم. لوحة A: تمثيل تخطيطي للسلطة التفريق بين الزوج التمهيدي CTX-يصل CHK وCTX-CHK إلى أسفل، وعلى الأخص فيما يتعلق استئصال كاسيت المضادات الحيوية. واستخدمت الخلايا البكتيرية الجامعة كقالب في تفاعلات PCR: لوحة B. للتحقق من وDNA تغيير واستخدمت مكان الاشعال CHK متابعة وCHK أسفل. تم فصل تضخيم PCR بواسطة شظايا الكهربائي للهلام الاغاروز وتصور باستخدام DNA SYBR آمنة وصمة عار. حارة 1: البرية من نوع V. الكوليرا سلالة؛ حارة 2: سلالة Δ ctxAB :: FRT-اساسه-FRT؛ حارة 3: Δ ctxAB :: FRT. أحجام جزء PCR المتوقع وفقا لوحة يشار إلى A على اليمين. L، 1KB سلم (إينفيتروجن). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 5
الشكل 5. الاستراتيجية للتأكد من حذف الجزيرة الجيني. لوحة A: مخطط الضمة المرضية الجزيرة 1 (VPI-1) (المرجع تكييفها بحرية من 16؛ عدم نطاق). لسلالة من النوع البري في المنطقة ذات الاهتمام هي غير amplifiable عن طريق PCR القياسية والاشعال VPI-1-CHK محددة ومتابعة CHK إلى أسفل (~ 40 KB). لذا إضافيةقليل النوكليوتيد الصلب في المنطقة ليكون بين حذف تم تطبيق (VC0817 الظهير) جنبا إلى جنب مع ما يصل VPI-CHK. وأشار الممثل الخاص نتيجة الحمض النووي الجيني للسلالات منها كقالب وأزواج التمهيدي فوق كل صورة: لوحة B. اختبار سلالات: البرية من نوع V. الكوليرا سلالة (حارة 1)، سلالة VPI :: FRT-Kan/Gm-FRT (حارة 2)، وΔVPI :: 1-FRT (حارة 3). أحجام شظايا PCR كما هو متوقع في لوحة يشار إلى A على اليمين. L، 1KB سلم (إينفيتروجن). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 6
الشكل 6. النمط الظاهري الممثل بعد الإدراج من تسلسل المروج الاصطناعية. تم دمج بوليميريز RNA T7 التي تعتمد على تسلسل المروج المنبع من الجين tfoX الكفاءة التنظيمية باستخدام metho TransFLPد (رسم بياني أعلاه). والأبوية V. الكوليرا سلالة (ADVCH-T7POL) بوليميراز RNA يحتوي على الجينات T7 يقودها المروج lacUV5. الرسم البياني: سلالة الأبوية ADVCH-T7POL (الممرات 1 و 2) والسلالة التلاعب بها من قبل TransFLP (ADVCH-T7POL-T7-tfoX :: FRT؛ الممرات 3 و 4) تم اختبار لtransformability الطبيعية في غياب (1 و 3 حارات ) أو وجود IPTG 1MM (الممرات 2 و 4). وقد اشتق من تحويل الحمض النووي الجيني سلالة A1552-LacZ-اساسه 8. يتم إعطاء الترددات التحول على المحور Y. <دل، دون الكشف عن الحد ~ 5 × 10 -8. ** P <0.01 (على النحو الذي يحدده اختبار الطالب ر من تسجيل الدخول، تحويل البيانات). السهم الأسود مع 'T7' النص: T7 بوليميريز RNA تسلسل المروج التي تعتمد على اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصف طريقة TransFLP أعلاه وغيرها وقد تم على نطاق واسع 5 المستخدمة في مختبرنا. هذا النوع من التلاعب الجيني التي هي ممكنة، ضمن جملة أمور: حذف الجينات واحد ومجموعات الجينات، حذف الجزر الجيني (على سبيل المثال، VPI-1)، إدراج تسلسل المنبع من الجين في المصالح (على سبيل المثال، تسلسل المروج) وإدراج متواليات في نهاية جين معين (على سبيل المثال، بعد تقارب الترميز).

شرط الاستيراد لTransFLP هو أن كل V. الكوليرا هي سلالة التحويلية بشكل طبيعي. هذا هو أحيانا لم يكن الأمر كذلك، وخاصة في عزلة المستمدة من مرضى الكوليرا. وكثيرا ما تحور السلالات داخل هذه الدائرة مثل الاستشعار عن النصاب القانوني، في ترميز الجين المنظم الرئيسي للاستشعار عن النصاب القانوني، HapR 17. توفير نسخة من العودة hapR يعيد transformability الطبيعية في هذه السلالات 6 كما exemplified لسلالة HapR-N16961 معيب 18.

ويمكن إدراج التعديلات الممكنة، مثل تخصيب من البكتيريا الطبيعية بعد التحول 8 في حالة تردد منخفض جدا. يرجى ملاحظة أن وتيرة التحول هو بشكل عام أقل في حالة البلازميد PBR-FLP موجود بالفعل عند القيام الكيتين التي يسببها مقايسة التحول الطبيعي. وعلى الأرجح سبب هذا عن طريق التسرب الجزئي للتعبير درجة الحرارة حساسة من هذا الجين من FLP PBR-FLP، الذي من شأنه أن يؤدي إلى سابق لأوانه استئصال كاسيت المقاومة للمضادات الحيوية وعدم القدرة على الاختيار لهذه transformants. لذلك فإننا ننصح للحالات الحرجة لإدراج البلازميد PBR-FLP بعد خطوة التحول الطبيعي.

خطوة حاسمة أخرى هي الجولة الثانية 2 من PCR، والتي سوف تجمع بين ثلاثة 1 ST-PCR جولة شظايا. يمكن أن يحدث أن شظايا جزئية موجودة بعد الجرمية PCRction (على سبيل المثال، تجميع جزئي للشظايا فقط 'حتى' و 'FRT-اساسه-FRT "حسب الشكل 1). هذا لا يكاد يذكر، كما يمكن إعادة التركيب مثلي مزدوج مع المنطقة المستهدفة الكروموسومات لا يحدث في هذه الحالة. كما يتم اختيار transformants فقط إيواء كاسيت المقاومة للمضادات الحيوية ل، وتستبعد جميع transformants أخرى مع تبادل DNA غير المرغوبة.

نقطة أخرى أن نأخذ في الاعتبار هو ما يتعلق تكرار إجراء عدة جولات. لدينا بالفعل مجتمعة بنجاح حذف الكتلة الجينات ctxAB مع حذف من الجزيرة المرضية (VPI-1) وآخر مجموعة الجينات الفوعة (Blokesch، غير منشور). وعلاوة على ذلك، دمجنا بشكل فعال RNA T7 بوليميريز التي تعتمد على المروج داخل هذه السلالات (المنبع tfoX وغيرها). ومع ذلك، ينبغي أن النمط الجيني تصور باستمرار اختبار لجميع سيطة سلالة (على سبيل المثال، عن طريق PCR مستعمرة ودemonstrated في الشكل 4). هذا سوف يساعد على استبعاد غير المرغوب فيه FLP بوساطة إعادة التركيب لليسار وراء ندبات FRT (كما هو موضح مستطيل أحمر في جميع الأرقام) مع بعضها البعض في حين أن البلازميد PBR-FLP لا تزال موجودة في البكتيريا. ربما يمكن أن تهمل هذه الجينات تقع بعيدة عن، واحتمال أن الختان في المنطقة في الفترات الفاصلة بين أن تكون قاتلة بسبب حذف الجينات الأساسية هي عالية جدا.

وأخيرا، نود أن نناقش حذف الجينات داخل operons. لا يمكننا استبعاد أن حذف الجينات المنبع، الأمر الذي يترك ندبة خلف FRT، قد تغيير التعبير عن الجينات المصب (ق). لضمان أن هذا التأثير ليس مما تسبب في النمط الظاهري للملاحظة، ولكن الذي يحدث في الواقع عن طريق الحذف، ويوصى فحص تكامل. عنصر تحكم آخر أن لدينا بالفعل استخدمت بنجاح في المختبر هو دمج المصب ندبة FRT من withou الجينات في المصالحر حذف هذا الأخير. لم نكن نلاحظ مثل هذه المشاكل في مختبرنا بعد ولكن لا يمكن استبعاد وجودها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأود أن أنوه أولغا سيلفا دي سوزا للحصول على المساعدة الفنية. وأيد هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم السويسري (SNSF) منحة 31003A_127029.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chitin flakes Sigma C9213 Autoclaving required
OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) Biorad 165-2100 Or comparable electroporators

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, V. L., Mekalanos, J. J. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol. 170, 2575-2583 (1988).
  2. Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171, 4617-4622 (1989).
  3. Kato, C., Ohmiya, R., Mizuno, T. A rapid method for disrupting genes in the Escherichia coli genome. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1826-1829 (1998).
  4. Donnenberg, M. S., Kaper, J. B. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector. Infect. Immun. 59, 4310-4317 (1991).
  5. De Souza Silva, O., Blokesch, M. Genetic manipulation of Vibrio cholerae by combining natural transformation with FLP recombination. Plasmid. 64, 186-195 (2010).
  6. Meibom, K. L., Blokesch, M., Dolganov, N. A., Wu, C. -Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310, 1824-1827 (2005).
  7. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environ. Microbiol. 12, 2302-2311 (2010).
  8. Marvig, R. L., Blokesch, M. Natural transformation of Vibrio cholerae as a tool-optimizing the procedure. BMC Microbiol. 10, 155 (2010).
  9. Blokesch, M., Schoolnik, G. K. Serogroup Conversion of Vibrio cholerae in Aquatic Reservoirs. PLoS Pathog. 3, e81 (2007).
  10. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158, 9-14 (1995).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A laboratory manual. Ford, N., Nolan, C., Ferguson, M. 1, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  12. Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells. Cell. 133, 90-102 (2008).
  13. Karaolis, D. K. R. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 3134-3139 (1998).
  14. Ikeda, R. A., Ligman, C. M., Warshamana, S. T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo. Nucleic Acids Res. 20, 2517-2524 (1992).
  15. Pan, S. H., Malcolm, B. A. Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21 (DE3). Biotechniques. 29, 1234-1238 (2000).
  16. Faruque, S. M., Zhu, J., Asadulghani,, Kamruzzaman, M., Mekalanos, J. J. Examination of diverse toxin-coregulated pilus-positive Vibrio cholerae strains fails to demonstrate evidence for Vibrio pathogenicity island phage. Infect. Immun. 71, 2993-2999 (2003).
  17. Joelsson, A., Liu, Z., Zhu, J. Genetic and phenotypic diversity of quorum-sensing systems in clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae. Infect. Immun. 74, 1141-1147 (2006).
  18. Heidelberg, J. F. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae. Nature. 406, 477-483 (2000).

Tags

علم المناعة، العدد 68، علم الأحياء الدقيقة، علم الوراثة، والتحول الطبيعي، امتصاص الحمض النووي، FLP إعادة التركيب، كيتين،
TransFLP - طريقة لتعديل وراثيا<em&gt; ضمة الكوليرا</em&gt; بناء على التحول الطبيعي وإعادة التركيب، FLP
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blokesch, M. TransFLP — AMore

Blokesch, M. TransFLP — A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination. J. Vis. Exp. (68), e3761, doi:10.3791/3761 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter